胰岛素样肽(INSL)，例如结构类似于胰岛素的这些肽，由2条肽链：A链和 B链组成，此2条链通过2个分子间二硫键连接在一起，同时A链含有一个额外 的分子内二硫键。一个例外是胰岛素样生长因子IGF-1和IGF-2，它们各由含70 个氨基酸的一条肽链组成。
INSL家族除胰岛素外还包括INSL3、INSL4、INSL5、INSL6、松弛素1 （RLN1）、松弛素2（RLN2）和松弛素3（RLN3）以及生长因子IGF-1和IGF-2。
INSL肽显示具有重要的生物学性能，它们决定了代谢，例如胰岛素和IGF-1， 并能调节生物体的重要状态，例如妊娠受RLN1、RNL-2和INSL4调节。
胰岛素销售用于治疗糖尿病并可视为最佳的被研究蛋白质，IGF-1用于重度 原发性IGF-1缺陷病例治疗并在多项临床试验中针对适应征例如I型糖尿病、II 型糖尿病、阿尔茨海默症、严重烧伤和肌强直性肌营养不良症(MMD)等，RLN2 在临床试验中测试了对急性心力衰减、先兆子痫和硬皮病的效果，除此以外关于 其他INSL及它们的衍生物和拮抗物的生物学性能和可能的治疗应用知之甚少。
一种情况中表明由一种INSL的A链和另一种INSL的B链组成的嵌合肽能 与相应INSL的独特受体相互作用并显示显著的生物学活性。此外，已表明由 IGF-1的A部分和IGF-2的B部分组成肽链的IGF具有额外的重要生物学活性。 对于大量的其它嵌合肽证明同样如此。
尚未深入研究嵌合性INSL的生物学性能和可能的药学应用，因为它们的制 备非常困难。事实上只制备和研究了由INSL5的B链和其它INSL的各种A链组 成的嵌合肽。特别是，已发现由RLN3的A链和INSL5的B链组成的 RLN3A/TNSL5与GPCR135和GPCR142受体相互作用。
对于由INSL的二条不同链组成的嵌合肽仅有限研究的原因是其合成的难度 和低产率。
迄今已采用的方法是A)随机混合直链A链与B链及其氧化，B)混合在半胱 氨酸残基的巯基处含磺酸基团的A链，和C)定点构建A链与B链之间的三个二 硫键。认为此方法是迄今为止制备INSL的最为改进的化学方法，虽然它需要多 个步骤和5步层析纯化。显然所有上述方法非但不尽人意而且导致制备少量INSL 的难度大及成本高。此外，这些方法不适合大规模生产。
由于化学合成困难，故采用重组DNA技术生产这些肽，例如胰岛素、松弛 素和IGF。但是重组DNA技术比常规的肽和蛋白质合成方法更为复杂。因此， 即使在最简单的IGF-1的情况中，还需要在分离得到其直链后选择性形成3个二 硫键。
产生由2条肽链组成的INSL变得甚至更为困难，因为该情况中用重组DNA 技术合它们的前肽，如前胰岛素、前松弛素等前肽后，需要选择性形成二硫键并 最后用酶去除各前肽中间的C-肽段。
制备RLN2甚至更为复杂，在切除C肽段后需要额外的步骤通过加热将位于 A链氨基末端的谷氨酰胺残基转变为焦谷氨酸残基。因此，即使生物技术制备的 INSL也很难制成，且需要多步层析纯化才能获得药学上可接受纯度的INSL。这 些巨大的困难和高生产成本导致极大地延误了对许多INSL生物学性能的评价和 在临床试验中对它们的药学应用测试，虽然认为它们的生物学活性是肯定的。这 对于含胰岛素链与其他INSL链结合的嵌合性INSL同样成立。
发明内容
近年来我们发现并报道了一种随机重组RLN1和RLN2链的简单制备方法。 该方法显示很容易合成嵌合肽，例如由RNL2A/RLN1B所组成。用单环A链和双 环A链时该合成方法特别有效。这表明A链含有结构信息使其能与不对应链的 天然对的胰岛素B肽链结合。
在本发明中，我们描述了胰岛素样肽A链的结构特征使它识别并选择性结合 胰岛素的所有B链和其它与那些肽相类似的链。肽链的结合总是选择性给出对应 预期和天然胰岛素样的结合。
例如，本发明表明双环RLN2A识别并通过随机组合不仅连接其它INSL的B 链，还与理论上对应于INSL的B链和对应于作为单链肽而天然所见的IGF-1和 IGF-2的B链随机结合。这同样可用于其它胰岛素样肽的结合，使我们有可能容 易地制备具有可能的药学活性的嵌合多肽。
在本发明中，描述了单环A链和双环A链反应的主要副产物是B链氧化成 环形B链。具体说，INSL的直链B链与双环A链的反应非常快，如果A链过量 在数分钟内即可将该B链氧化成环形B链同步形成胰岛素样肽。
双环A链肽有效氧化和产生二硫键连接的这种性能是一种氧化酶性能，因此 我们可将胰岛素样肽的双环A链称为已知的最小的同时为强效的氧化酶，其还显 示能容易地组合其它肽链的能力。
正是这种性能使得INSL的双环A链和类似的肽链作为用于蛋白质构象疾病 的感兴趣治疗剂。因此，提供合适的双环INSLA链或类似肽，可能有助于改善 因生物体功能障碍导致的蛋白质折叠缓慢。
我们还揭示INSL的双环A链易与只含不参与二硫键的半胱氨酸残基（例如 导致糖尿病的某些胰岛素突变体中）的肽链反应。
为此，给予双环A链作为药物可对于通过它与突变蛋白的结合反应，然后通 过生物体的ERAD系统或其它防御系统，破坏双环A链与突变蛋白的这种结合， 来清除人体或动物体中的突变蛋白极其有益。
双环A链作为药物的递送将极为有益，因为它会与沉淀蛋白反应并溶解它 们，还能与蛋白寡聚物或多聚物反应而溶解它们，并通过其氧化活性使之折叠而 恢复它们的功能。
在本发明的另一种实施方式中，我们描述了一种INSL肽链的方便而有效的 合成方法，通过采用2-氯三苯甲基和4-甲基二苯甲基化树脂的固相合成技术。此 外，可采用本领域已知用于制备直链肽或肽酰胺的所有技术。
本发明描述了已知的INSL和嵌合肽的改进的化学合成方法。还首次描述了 由2条链组成且链以胰岛素与其它胰岛素样肽2条链的链连接方式连接的IGF-1 和IGF-2的嵌合性衍生物（图1），及。还首次描述了由一种INSL的A链与另 一种INSL的B链组成的一系列嵌合性INSL。
正确形成二硫键对INSL的肽合成非常重要。在本发明中，我们描述了形成 正确-S-S-结合的方法。半胱氨酸残基的这些氧化反应可在各个链纯化之前或之后 进行。也可用带保护形式的肽形成二硫化物/键连接。
如果2条链的合成采用固相法，二硫键的形成可以在树脂上、从树脂上切割 肽后或从树脂上切割肽的同时进行。氧化半胱氨酸巯基以形成分子内二硫键可采 用任何氧化剂进行，但优选用二甲基亚砜(DMSO)(JPTam等，JAmChem Soc,1991,113:6657-6662)氧化去保护INSL链；带保护的肽或部分去保护的肽则用 碘氧化。
链装配时为了保护半胱氨酸的侧链巯基，可利用科学领域已知的保护巯基功 能团的各种保护基团，但优选利用4-甲氧基三苯甲基（Mmt）(Barlos等，Int.J. PeptideProteinRes.1996,47,148-153)、三苯甲基（Trt）和乙酰胺基甲基(Acm) 基团。
在本发明中，我们也描述了通过将胰岛素样肽的A链和B链氧化成相应的双 环和单环A链和B链而提高其溶解度。因此在制备型高效液相层析(HPLC)中它 们的洗脱大大早于相应的（还原）肽，因而对于纯化它们的应用简单而优于直链 （还原）肽的应用。
为了在A链中选择性形成分子间二硫键，可利用任何一对正交保护基团，但 优选采用Trt/Mmt、Trt/Acm和Mmt/Acm三对中的一对。
当采用Trt/Mmt对时，选择性去除S-Mmt基团后用合适的氧化剂，优选用空 气或DMSO使已释放的游离巯基之间形成二硫键。优选用碘氧化去除S-Trt和 Acm基团形成第2个二硫键。采用2-氯三苯甲基树脂(K.Barlos等，Int.J.Pept. ProteinRes.1991,37,513-520)或对酸具有相似敏感性的树脂固相合成A链时，用 酸温和切割选择性去除S-Mmt基团与从树脂上切割该肽同时进行。
对于氧化去除S-Trt基团然后形成二硫键，可采用该领域已知的任何氧化剂 但优选采用碘。
如果利用Trt/Acm对，可利用合适的酸溶液，优选用含10-100%浓度三氟乙 酸的二氯甲烷液对该肽树脂进行酸处理，并以不同比例加入清除剂优选硫醇，甲 硅烷和水，在S-Acm基团存在下选择性去除S-Trt基团。第1个二硫键的形成可 采用该领域已知的任何氧化剂实现，但优选DMSO和空气。
可用碘氧化去除S-Trt基团形成第1个二硫键，这可在将带保护的肽从树脂上切 割之前、切割时或切割后进行(K.Barlos等，Int.J.ofPeptide&ProteinResearch, 1991,38,562-568)。
若在0°C-15°C低温下于亲脂溶剂，优选氯化烃、氟化醇中，用温和的酸如乙 酸和三氟乙酸进行碘化反应，可在S-Acm基团存在下选择性形成所需的二硫键。
通过加入极性组分如乙酸、甲醇、三氟乙酸和偶尔用水，可在更极性的溶剂 中产生第2个二硫键。碘化期间的温度可以不同但优选设置在5-25°C范围内。
胰岛素样肽的固相合成可采用科学领域已知的任何树脂进行，但优选三苯甲 基类型的树脂，如2-氯三苯甲基树脂(K.Barlos等，TetrahedronLett.,1989,30, 3943；K.Barlos等，TetrahedronLett.,1989,30,3947；K.Barlos等，Angew.Chem. Int.Ed.Engl.,1991,30,590；K.Barlos等，Int.J.Pept.ProteinRes.,1991,37,513； Barlos,等，Int.J.Pept.ProteinRes.,1991,38,562)和4-甲基二苯甲基溴树脂(K. Barlos等，LiebigsAnnalenderChemie(1989),(10),951-5)。
在本发明中，我们描述了胰岛素样肽的A和B链结合（折叠）的改进 方法（图3-9）。含有分子内二硫键的环形肽在形成分子间-SS-键时通常比 相应的直链肽反应更快。它们表现为活化的环肽并以更有效的方式与第二 条链进行分子间结合。在混有A链异构体和B链的混和物中用DMSO、空 气或其它氧化剂氧化直链的肽。本发明描述了混有A链的多种双环异构体或 单独异构体的化合物与环形B链（图6）催化反应产生所需产物。加入还原性催 化剂加速该反应。催化剂将二硫桥还原成游离巯基，产生环形肽与分子间连接的 肽之间的平衡。这导致后续反应产生热力学更稳定的产物即天然蛋白质。
所用的还原剂可以是任何有机或无机物质，但优选有机硫醇，例如还原（直） 链A和/或B还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、苯硫酚、吡啶硫醇、3或5硝基吡啶-2- 硫醇、苄基硫醇（benzylmercaptane）、二硫苏糖醇等。优选采用A或B链或它 们的混合物作为催化剂。可在A链与B链混合之前、混合期间或之后加入催化剂。
可加入不同量的催化剂以达到平衡。折叠期间的温度可以不同但优选设置在 24°C。采用水或水与有机溶剂的混合液作溶剂，偶尔加入碱。链结合时的pH可 以不同但优选设为pH10-11。
在本发明中我们也表明存在合适的氧化剂如DMSO时，还原的A链能与B 链结合（折叠）形成胰岛素样肽。该反应通过形成单环和双环A链的混合物而进 行。
采用已氧化的A链与B链时链的结合更快。此时，混和的A链与B链反应 来在所有情况中给出胰岛素样肽，具有其二硫键的物理排列。
优选通过加入15%DMSO作为氧化剂来进行双环A链与还原（直）的B链 结合以完成折叠（图4）。A链与B链的比例可以不同但优选摩尔比1.1∶1。增加 反应液中的A链过量可加速反应。此种情况下可在HPLC纯化胰岛素样肽时回收 过量的A链或B链。
胰岛素样肽的纯化由HPLC用各种溶剂混合液进行，但优选含三氟乙酸 (TFA)、甲酸或乙酸的水和乙腈中进行。可通过冻干或沉淀分离已纯化的胰岛素 样肽。如果需要进行脱盐，可采用常用的强离子交换树脂，例如Dowex。
实施例
实施例1
固相合成胰岛素样肽的A链、B链和它们的带保护区段。通用程序。
A1.制备负载的2-氯三苯甲基树脂，通用程序。
取CBL-Patras公司的2-氯三苯甲基氯树脂(CTC-C1)(100g；载量1.6mmol/g) 置于2L肽合成反应罐中，用700mL二氯甲烷(DCM)25°C溶胀30分钟。过滤 树脂，加入含100mmolFmoc-氨基酸和300mmol二异丙基乙胺(DIEA)的500mL DCM溶液。混合物于氮气下在25°C搅拌2小时。然后加入10mL甲醇（MeOH） 反应1小时，中和2-CTC树脂的残留活性位点。过滤树脂并用400mLDMF洗涤 2次。过滤树脂，用含25%体积哌啶的500mLDMF处理30分钟2次。然后用 500mLDMF洗涤树脂4次。用500mL异丙醇(IPA)洗涤3次使树脂去溶胀。干 燥树脂至恒重。所用毫摩尔的氨基酸70-95%结合在树脂上。
A2.制备负载的MBH-树脂，通用方法。
将MBH-Br树脂(100g;190mmol)置于2L肽合成仪中，用700mLDCM25°C 溶胀30分钟。过滤树脂，然后加入含Fmoc-氨基酸和DIEA的500mLDCM溶液。 混合物在氮气下25°C搅拌6小时。然后加入10mLMeOH搅拌24小时以结合 MBH树脂的残留活性位点。过滤树脂，用400mLDMF洗涤2次。过滤树脂， 与含25%体积哌啶的500mLDMF溶液再反应30分钟2次。然后用500mLDMF 洗涤树脂4次。用500mLIPA洗涤3次使树脂去溶胀。然后树脂在真空(15torr, 25°C)下干燥至恒重。所用氨基酸中60-90%的豪摩尔数结合在树脂上。
B．固相合成，通用方案
固相合成用1.0g如实施例部分A中所述酯化于CTC或MBH树脂上的氨基 酸在24°C下进行。整个合成中采用以下方案。
B1.溶胀树脂
将树脂置于15ml反应器中用7mlNMP处理2次，然后过滤。
B2.活化氨基酸
称取氨基酸(3.0当量)和1-羟基苯并三唑(4.0当量)置于装有2.5倍体积NMP 的反应器中溶解并冷却至0°C。然后加入DIC(3.0当量)并将混合液搅拌15分钟。
B3.偶合
将B2制备的溶液加入到B1反应器中。在反应器中加入一倍体积的DCM洗 涤反应器1次，在25°C-30°C搅拌1-3小时。取样做Kaiser试验确定反应是否完 成。如果3小时后偶合反应未完成（Kaiser试验阳性），过滤反应混和液并与新 鲜的活化氨基酸溶液再偶合。完成偶合后过滤反应混和液用NMP洗涤4次（每 次洗涤用5倍体积）。
B4.去除Fmoc-基团
过滤B3得到的树脂用含25%体积哌啶的5mL溶液处理30分钟。然后用5mL NMP洗涤树脂3次。
B5.肽链延伸
重复步骤B1-B5，掺入各个氨基酸直至完成肽链。
为引入每一个氨基酸，采用了以下Fmoc-氨基酸：Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met–OH、 Fmoc-Met(O)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、 Fmoc-Glu(fBu)-OH、pGlu、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Tyr(Clt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH和 Fmoc-Cys(Acm)-OH，及以下Boc-氨基酸：Boc-Arg(Pbf)-OH、Boc-Gln-OH、Boc-Gln (Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH和Boc-Asp(tBu)-OH。
C.从CTC树脂上切割胰岛素样肽及其在N-末端含有Fmoc-或Boc-基团的带 保护区段的通用方法。
上述B1-B5产生的结合有肽或肽区段的树脂用5mLNMP洗涤4次，用5mL IPA洗涤3次，最后用7mLDCM洗涤5次，以完全去除任何残留的NMP或其 它碱性组分。然后冷却树脂至0°C，过滤去除DCM，用10mL1%TFA/DCM液 5°C处理2次。然后将混合液在0°C搅拌20分钟后过滤。树脂用10mLDCM洗 涤3次。然后滤液中加入吡啶（相当于TFA的1.3当量）以中和TFA。然后将该 DCM切割液与等体积水混和。所得混和液减压蒸馏(28°C下350torr)以去除 DCM。去除DCM后沉淀肽或肽区段。然后用水洗涤所得肽并在30-35°C下15Torr 真空干燥。
实施例2
胰岛素样肽的去保护。通用方法
将上述实施例1中所得带保护的A链和B链(0.01mmol)用10mLTFA/DTT/ 水(90∶5∶5)5°C处理3小时，再15°C处理1小时。将所得溶液真空浓缩，然后加 入二异丙醚沉淀去保护的肽，并用10mL二异丙醚洗涤3次。将所得固体真空干 燥（25°C，15Torr）至恒重。
实施例3
单环和双环胰岛素样肽的去保护。通用方法
将上述实施例1中所得带保护的RLX-A链和B链（0.05mmol）用5mL TFA/TIPS/苯甲醚/水（91∶4∶1∶4）5°C处理3小时，再15°C处理1小时。将所得 溶液真空浓缩，然后加入二异丙醚沉淀去保护的肽，并用10mL二异丙醚洗涤3 次。所得固体物质真空干燥（25°C，15Torr）至恒重。对于各条A链和B链重 复此程序。
实施例4
纯化去保护的肽和它们的单环与双环衍生物。通用程序。
将粗制去保护的RLXIA、RLX2A、Met24(O)-RLX1B和Met25(O)-RLX2B 以及单环和双环衍生物的三氟乙酸盐溶于含25%乙腈的水中，加到10x25mm的 半制备型柱上。Lichrospher100，RP-18，12微米柱（Merck）；A相=含1%TFA 的乙腈，B相=含1%TFA的水；线性梯度25%-A至65%-A洗脱30分钟。纯化 产率为30-80%。对RLX2A、Met24(O)-RLX1B和Met25(O)-RLX2B和单环及双 氧化衍生物重复此程序。
实施例5
从CTC树脂上切割并同时用碘单氧化带保护的肽。制备胰岛素样肽的单氧化A 链和B链。
将上述实施例1和2所得结合于带保护肽的N-和侧链上的树脂用5mLNMP 洗涤4次，用5mLIPA洗涤3次，最后用7mLDCM洗涤5次，以完全去除NMP 和其它碱性组分。冷却树脂至0°C。滤除DCM后，用含相当于树脂所结合肽的 10当量碘的10mL1%TFA的DCM溶液5°C处理2次。所得混和液在0°C搅拌 5分钟后过滤（代替1%TFA，可用相同体积的二氯甲烷/乙酸/三氟乙醇混和液， 结果相似）。用10mLDCM洗涤树脂3次。合并的滤液加热至15°C再搅拌30 分钟。然后在该滤液中加入吡啶（相当于TFA的1.3当量）以中和TFA。然后将 该DCM切割液与等体积的3%硫代硫酸钠水溶液混和以去除过量的碘。混和液脱 色表明碘去除。所得混和液减压蒸馏(350torr，28°C)以去除DCM。去除DCM后 沉淀所得肽或肽区段。所得肽用水洗涤并在30-35°C下15Torr真空干燥。如实 施例2、3和4所述进行去保护和纯化。总产率45-65%。对所有分子重复该程序。
实施例6
通过用DMSO氧化来合成带保护的单环胰岛素样肽。通用方法。
A1.Cys(Mmt)的选择性去保护。胰岛素样肽的部分去保护。
取结合于上述实施例B1-B5中所得含有2个用Trt保护的半胱氨酸残基和2 个用Mmt保护的半胱氨酸残基的带保护肽(0.005mmol)的N-和侧链上的树脂用5 mLNMP洗涤4次，用5mLIPA洗涤3次，最后用7mLDCM洗涤5次，以完 全去除NMP和其它碱性组分。冷却树脂至0°C，过滤去除DCM，用25mL1.5%TFA 的DCM溶液5°C处理4次，所述溶液含有相当于该树脂所连接肽的10当量的三 乙基硅烷。合并的滤液于15°C再搅拌2小时。然后在该滤液中加入吡啶（相当 于TFA的1.3当量）以去除TFA。然后将所得DCM切割液与等体积水混和。所 得混和液减压蒸馏(350torr，28°C)以去除DCM。去除DCM后沉淀在S-Mmt处 选择性去保护的肽和肽区段。所得肽然后用水洗涤并在30-35°C下15Torr真空 干燥。
A2.用DMSO氧化使游离半胱氨酸形成单环。
将如A1方法所述得到的肽（0.005mmol）溶于5mlDMSO中，25°C搅拌2 小时。然后加入5ml水继续搅拌30分钟。然后将所沉淀的单环带保护肽用水洗 涤5次并真空（30°C，15Torr）干燥至恒重。按实施例2、3和4所述进行去保 护和纯化。总得率范围为50-70%。
实施例7
合成胰岛素样肽及其衍生物的双环A链。通用方法。
A1.用碘氧化胰岛素样肽及其衍生物的带保护单环A链，其中有2个半胱氨酸残 基的侧链用Trt基团保护。
将a其中有2个半胱氨酸残基的侧链用Trt基团保护的胰岛素样肽及其衍生 物的单环带保护A链（0.005mmol）溶于5mlDCM/TFE(7∶3)中。溶液冷却至5°C 后加入含10当量碘的5mlDCM液，混和液搅拌1小时。然后将该DCM切割液 与等体积3%硫代硫酸钠水溶液混和以去除过量的碘。混和液脱色表明碘去除。 所得混和液减压蒸馏(350torr，28°C)以去除DCM。去除DCM后沉淀所得肽或肽 区段。所得沉淀肽用水洗涤后30-35°C下15Torr真空干燥。按实施例2、3和4 所述进行去保护和纯化。总得率范围为50-80%。
A2.用碘氧化二个半胱氨酸侧链用Acm基团保护的胰岛素样肽及其衍生物的带保 护单环A链。
将其中有2个半胱氨酸残基的侧链用Acm基团保护的胰岛素样肽及其衍生 物的单环带保护A链（0.005mmol）溶于5mlAcOH/TFE(5∶5)中。溶液冷却至 5°C后加入含20当量碘的5mlTFE液，混和液搅拌1小时。然后将该DCM切割 液与5倍体积的3%硫代硫酸钠与抗坏血酸的水溶液混和以去除过量的碘。混和 液脱色表明碘去除。所得混和液减压蒸馏(350torr，28°C)以去除DCM。去除DCM 后沉淀所得肽或肽区段，然后用水洗涤，在30-35°C下15Torr真空干燥。按实 施例2、3和4所述进行去保护和纯化。总得率范围为50-60%。
A3.用DMSO氧化胰岛素样肽及其衍生物的去保护单环A链，通用方法。
将胰岛素样肽及其衍生物的单环去保护A链（0.005mmol）溶于4mlpH=4 的乙酸铵缓冲液中。然后加入1mlDMSO，混和液在15°C搅拌24小时。按实施 例4所述从所得溶液分离并纯化双环肽。总得率范围为65-85%。
A4.用DMSO氧化胰岛素样肽及其衍生物的直链去保护单环A链，通用方法。
将胰岛素样肽及其衍生物的直链去保护单环A链（0.005mmol）溶于4mlpH =4的乙酸铵缓冲液中。然后加入1mlDMSO，混和液在15°C搅拌24小时。按 实施例4所述从所得溶液分离并纯化双环肽。总得率范围为60-80%。
实施例8
合成胰岛素样肽及其衍生物的单环B链。通用方法。
将胰岛素样肽及其衍生物的直链去保护B链（0.005mmol）溶于4mlpH=10.5 的甘氨酸钠缓冲液中。然后加入1mlDMSO，混和液在15°C搅拌24小时。按实 施例4所述从所得溶液分离并净化环肽。三次实验的平均得率为25-45%。
实施例9
通过线性结合胰岛素样肽的A链与胰岛素样肽及其衍生物的直链B链合成胰岛素 样肽及其衍生物，通用方法。
将去保护的胰岛素样肽直链A链（0.006mmol）与胰岛素样肽的直链B链 （0.005mmol）溶于4mlpH=10.5的甘氨酸钠/6-N盐酸胍(4∶1)缓冲液中。然后 在12小时内加入1mlDMSO，混和液在15°C搅拌4小时。按实施例4所述从所 得溶液分离并纯化胰岛素样肽。三次实验胰岛素样肽的平均得率为15-35%。
实施例10
通过胰岛素样肽的直链A链与胰岛素样肽及其衍生物的环形B链的线性组合 合成胰岛素样肽及其衍生物，通用方法
将胰岛素样肽的直链去保护A链（0.005mmol）与胰岛素B链或衍生物的环 形肽（0.005mmol）溶于4mlpH=10.5的甘氨酸盐/6-N盐酸胍(4∶1)缓冲液中。 然后在12小时内加入1mlDMSO，混和液在15°C搅拌4小时。从所得溶液中按 实施例4所述通过浸蚀（etching）分离胰岛素样肽。三次实验胰岛素样肽的平均 得率按所用的B链计算为5-70%。
实施例11
合成胰岛素衍生肽，及其在胰岛素B肽和衍生物的直链中结合胰岛素样肽及其衍 生物的单环A链，通用方法
将胰岛素样肽A链肽的去保护单环或产生子（0.006mmol）与胰岛素样肽的 环形B链肽或产生子（0.005mmol）溶于4mlpH=10.5的甘氨酸盐/6-N盐酸胍 (4∶1)缓冲盐液中。然后在12小时内逐步加入1mlDMSO，混和液在15°C搅拌 4小时。从所得溶液中按实施例4所述通过浸蚀分离胰岛素样肽。三次实验胰岛 素样肽的平均得率按所用的B链计算为12-36%。
实施例12
通过结合胰岛素样肽的单环A链与胰岛素样肽及其衍生物的直链B链合成胰岛 素样肽及其衍生物，通用方法
将胰岛素样肽或其衍生物的去保护单环A链（0.006mmol）与胰岛素样肽或 其衍生物的环形B链（0.005mmol）溶于4mlpH=10.5的甘氨酸钠/6-N盐酸胍(4∶1) 缓冲液中。然后在12小时内逐步加入1mlDMSO，混和液在15°C搅拌4小时。 从所得溶液中按实施例4所述分离并纯化胰岛素样肽。三次实验胰岛素样肽的平 均得率按所用的B链计算为10-40%。
实施例13
通过线性结合胰岛素样肽及其衍生物的双环A链与胰岛素样肽及其衍生物的直 链B链合成胰岛素样肽及其衍生物，通用方法
将胰岛素样肽或其衍生物的去保护双环A链（0.006mmol）与胰岛素样肽或 其衍生物的直链B链（0.005mmol）溶于4mlpH=10.5的甘氨酸钠/6-N盐酸胍(4∶1) 缓冲液中。然后在12小时内逐步加入1mlDMSO，混和液在15°C搅拌4小时。 从所得溶液中按实施例4所述分离并纯化胰岛素样肽。三次实验胰岛素样肽的平 均得率按所用的B链计算为5-80%。
实施例14
通过结合胰岛素样肽及其衍生物的双环A链与胰岛素样肽及其衍生物的环形B 链合成胰岛素样肽及其衍生物，通用方法
将胰岛素样肽或其衍生物的去保护双环A链（0.011mmol）与胰岛素样肽或 其衍生物的环形B链（0.01mmol）溶于15mlpH=10.5的甘氨酸钠/6-N盐酸胍(4∶1) 缓冲液中。然后5-10°C搅拌下，用时48加入5ml的0.4mmol二硫苏糖醇水溶 液。从所得溶液中按实施例4所述分离并纯化胰岛素样肽。三次实验胰岛素样肽 的平均得率按所用的B链计算为20-75%。
附图说明
图1.胰岛素样肽的一级结构。阴影表示如图2示意图所示连接在一起的半 胱氨酸残基。A链N-末端的第1半胱氨酸与A链N-末端第3半胱氨酸连接。A 链N-末端的第2半胱氨酸与B链N-末端第1半胱氨酸连接。A链N-末端的第4 半胱氨酸与B链N-末端第2半胱氨酸连接。
图2.胰岛素样肽的示意图。粗线代表肽链。S代表此肽中半胱氨酸残基的硫 原子，细线代表化学键。
图3.随机结合直链A链与直链B链制备胰岛素样肽的示意图。粗线代表肽 链。S代表此肽中半胱氨酸残基的硫原子，细线代表化学键。
图4.随机结合单环A链与直链B链制备胰岛素样肽的示意图。粗线代表肽 链。S代表此肽中半胱氨酸残基的硫原子，细线代表化学键。
图5.随机结合双环A链与直链B链制备胰岛素样肽的示意图。粗线代表肽 链。S代表此肽中半胱氨酸残基的硫原子，细线代表化学键。
图6.随机结合双环A链与环形B链制备胰岛素样肽的示意图。粗线代表肽 链。S代表此肽中半胱氨酸残基的硫原子，细线代表化学键。
图7.随机结合直链A链与环形B链制备胰岛素样肽的示意图。粗线代表肽 链。S代表此肽半胱氨酸残基的硫原子，细线代表化学键。
图8.随机结合单环A链与环形B链制备胰岛素样肽的示意图。粗线代表肽 链。S代表此肽中半胱氨酸残基的硫原子，细线代表化学键。
图9.结合含有至少1个半胱氨酸残基的双环肽的示意图。此反应中可形成 多达4种异构体。粗线代表肽链。S代表此肽中半胱氨酸残基的硫原子，细线代 表化学键。