技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，尤其涉及一种支原体培养基及其制备方法。
背景技术
支原体（Mycoplasma）是一类无细胞壁、介于病毒和细菌间的原核微生物，能引起人 和动物的多种疾病，危害极大。该菌DNA分子量比细菌少，生物合成能力较弱，对培养基 营养要求较高，生长除依赖基础营养外，尚需牛心浸液、酵母膏、辅酶Ⅰ、氨基酸等，需 要甾醇的支原体，还要加入10%～20%的动物血清。
目前，支原体分离培养常用培养基Hartleys、PPLO、Hayflick，或其他改良的培养基， 它们都是以牛心汤为基础配制而成的，此类培养基成本高，培养时间长、效率低，不利于 支原体的大量培养，制约了疫苗生产。因此，研究和探求一种材料易得、价格低廉的支原 体培养基变得十分迫切。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种材料易得、价格低廉、培养效果好的支原体培养 基及其制备方法，以降低支原体的培养成本，便于实现人工大规模培养支原体。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：支原体培养基，包括基础培养液， 基础培养液主要由猪肺消化汤、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鲜酵母浸出液组成。
基础培养液由猪肺消化汤、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鲜酵母浸出液按体积百 分数48%、50%、2%组成。
上述支原体培养基，还包括动物血清。
每90～95ml基础培养液中加入5～10ml无菌的动物血清。
动物血清为马血清或小牛血清。
上述支原体培养基的制备方法，包括以下步骤：
<1>胰腺提取液的制备
取经检疫合格猪的新鲜胰脏，去除脂肪组织，切碎；500g胰脏加入1500mlddH2O 和500ml无水乙醇，室温振荡，100rpm；72h后用滤纸过滤即得；
<2>猪肺消化汤的制备
取经检疫合格猪的新鲜猪肺，去除气管和淋巴结缔组织，切碎，1500g猪肺加入2000 mlddH2O，搅拌加热至80℃，再加入质量浓度0.8%的无水NaHCO32500ml，混匀后冷至 45℃，加入胰腺提取液500ml、氯仿50ml，混匀置37℃6～7h，之后加浓硫酸40ml， 100℃蒸汽加热1h，纱布过滤，用1mol/LNaOH溶液调pH至8，100℃蒸汽加热1h，趁 热滤纸过滤，调节pH值至7.6，121℃高压灭菌20min，冷却即得；
<3>1%水解乳蛋白胨Earle液的制备
配制原液甲：NaCl68.0g，KCl4.0g，NaH2PO4·2H2O1.4g，葡萄糖20.0g，将以 上各成分溶解于500ml水中，即得；
配制原液乙：NaCl2.0g，MgCl2·6H2O1.7g，0.4%酚红液50ml，将以上各成分溶 解于500ml水中，即得；
配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均匀即得；
将水解乳蛋白胨和Earle液按质量体积比1:100混合完全溶解，装瓶，115℃高压灭 菌20min，冷却即得；
<4>25%新鲜酵母浸出液的制备
将250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH2O中，浸泡1h后加热至沸腾、冷却， 3000r/min离心20min，取上清液，用1mol/LNaOH溶液调节pH至8，滤纸初滤后，0.22 μl滤膜过滤除菌，即得；
将步骤<2>至<4>获得的猪肺消化汤、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鲜酵母浸出液 按体积百分数48%、50%、2%在无菌条件下混合，即得基础培养液。
上述支原体培养基的制备方法，还包括以下步骤：
<5>培养基的完善
根据不同支原体的培养特性，在无菌状态下，每90～95ml基础培养液中加入5～10ml 无菌的动物血清（马血清、小牛血清或其他动物血清），混匀，将培养基分装到试管中， 每支试管10ml，-20℃保存。
发明人近年来对牛、羊和猪等动物疾病的研究发现，由支原体引起的动物肺炎的病例 很常见，据此推测肺脏组织中的某些成分可能更适应支原体的快速生长繁殖。由此，发明 人用猪肺消化汤取代牛心汤制作支原体培养基，试验证明以该培养基进行支原体培养增殖 快、浓度高、效果切确，还可使支原体培养时动物血清的用量降低50%左右，这使人工大 规模培养支原体成为可能。本发明原料猪肺脏市场量大、材料易得、价格低廉，因此，应 用本发明可大幅降低动物支原体培养成本。
具体实施方式
实施例1制备基础培养液
<1>胰腺提取液的制备
取经检疫合格猪的新鲜胰脏，去除脂肪组织，切碎；500g胰脏加入1500mlddH2O 和500ml无水乙醇，室温振荡，100rpm；72h后用滤纸过滤即得；
<2>猪肺消化汤的制备
取经检疫合格猪的新鲜猪肺，去除气管和淋巴结缔组织，切碎，1500g猪肺加入2000 mlddH2O，搅拌加热至80℃，再加入质量浓度0.8%的无水NaHCO32500ml，混匀后冷至 45℃，加入胰腺提取液500ml、氯仿50ml，混匀置37℃6～7h，之后加浓硫酸40ml， 100℃蒸汽加热1h，纱布过滤，用1mol/LNaOH溶液调pH至8，100℃蒸汽加热1h，趁 热滤纸过滤，调节pH值至7.6，121℃高压灭菌20min，冷却即得；
<3>1%水解乳蛋白胨Earle液的制备
配制原液甲：NaCl68.0g，KCl4.0g，NaH2PO4·2H2O1.4g，葡萄糖20.0g，将以 上各成分溶解于500ml水中，即得；
配制原液乙：NaCl2.0g，MgCl2·6H2O1.7g，0.4%酚红液50ml，将以上各成分溶 解于500ml水中，即得；
配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均匀即得；
将水解乳蛋白胨和Earle液按质量体积比（w/v）1:100混合完全溶解，装瓶，115℃ 高压灭菌20min，冷却即得；
<4>25%新鲜酵母浸出液的制备
将250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH2O中，浸泡1h后加热至沸腾、冷却， 3000r/min离心20min，取上清液，用1mol/LNaOH溶液调节pH至8，滤纸初滤后，0.22 μl滤膜过滤除菌，即得；
将步骤<2>至<4>获得的猪肺消化汤、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鲜酵母浸出液 按体积百分数48%、50%、2%在无菌条件下混合，即得基础培养液。
实施例2含5%马血清猪肺消化汤支原体培养基
取实施例1的基础培养液，在无菌状态下，每95ml基础培养液中加入5ml无菌的 马血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10ml，-20℃保存备用。
实施例3含10%马血清猪肺消化汤支原体培养基
取实施例1的基础培养液，在无菌状态下，每90ml基础培养液中加入10ml无菌的 马血清，混匀，将培养基分装到试管中，每支试管10ml，-20℃保存备用。
实施例4牛支原体在三种培养基中培养效果的比较
1、材料
E、含5%马血清猪肺消化汤支原体培养基（实施例2）。
F、含10%马血清猪肺消化汤支原体培养基（实施例3）。
G、含10%马血清PPLO汤支原体培养基。
菌株：牛支原体广西分离株gx1株，由广西兽医研究所细菌研究室分离鉴定。
2、方法
1）菌种的复苏将在-70℃冻存的牛支原体广西分离株gx1种子移入10ml含10%马血清 PPLO汤培养中复苏，复苏后按10%（v/v）比的接种量传代3～5代，待生长稳定后将其在 5%CO2环境中培养了48h的培养物作为接种用菌种。
2）三种培养基接种培养取第1）步48h的牛支原体培养物作为接种用菌种，同样按10% （v/v）的接种量接种到E、F、G三种培养基中，每种培养基接种3管，作为待测菌液置 37℃含5%CO2环境中培养，每间隔24h取样待检。
3）活菌计数每间隔24h从待测菌液中取样，每个时间点、每种培养基均取样3份，每 份0.2ml。用含10%马血清PPLO汤作10倍梯度的倍比稀释法进行计数，将稀释好的试管 置于37℃恒温箱中培养，以未接种菌液的培养基为阴性对照，每天观察试管颜色的变化， 连续计数4d。以培养基由红色变为黄色时的最高稀释度作为待测菌液的颜色改变单位 (colorchangeimit，ccu)，也就是支原体的最大代谢活力，则菌液浓度以ccu/ml计。3份 样品的平均滴度即为该时间点牛支原体最大生长滴度。
3、结果
表1牛支原体在三种培养基中培养效果
从表1可以看出F培养基的培养效果最好，在相同培养时间点生长滴度最大，在48h 生长滴度可达到7×1011ccu/ml，72h生长滴度可达到最大值1×1012ccu/ml。E和G培养 基牛支原体生长滴度最大值相同，都达到了4×1011ccu/ml，但E培养基比G培养基提前 了24h达到了相同的效果，说明牛支原体更适合在肺消化汤中生长，而且也使动物马血 清的用量降低了50%，从而大幅降低了培养基的成本。
实施例5绵羊肺炎支原体在三种培养基中培养效果的比较
1、材料
E、含5%马血清猪肺消化汤支原体培养基（实施例2）。
F、含10%马血清猪肺消化汤支原体培养基（实施例3）。
H、含20%马血清PPLO汤支原体培养基。
菌株：绵羊肺炎支原体广西马山分离株gm株，由广西兽医研究所细菌研究室分离鉴定。
2、方法
1）菌种的复苏将在-70℃冻存的绵羊肺炎支原体广西马山分离株（gm株）种子移入10 ml含20%马血清PPLO汤培养中复苏，复苏后按5%（v/v）比的接种量传代3～5代，待生 长稳定后将其在含5%CO2环境中培养了3d的培养物作为接种用菌种。
2）三种培养基接种培养取第1）步3d的绵羊肺炎支原体培养物作为接种用菌种，同样 按10%（v/v）的接种量接种到E、F、H三种培养基中，每种培养基接种3管，作为待测 菌液置37℃含5%CO2环境中培养，48h后开始取样，后每间隔24h取样待检。
3）活菌计数每间隔24h从待测菌液中取样，每个时间点、每种培养基均取样3份， 每份0.2ml。用含20%马血清PPLO汤作10倍梯度的倍比稀释法进行计数，将稀释好的试 管置于37℃恒温箱中培养，以未接种菌液的培养基为阴性对照，连续计数3d，后每天观 察试管颜色的变化，直至无试管颜色发生变化为止，以最后一个变色的试管稀释度即为待 测菌液的生长滴度，用颜色变化单位（ccu）表示，3份样品的平均滴度即为该时间点绵羊 肺炎支原体最大生长滴度。
3、结果
表2绵羊肺炎支原体在三种培养基中培养效果
从表2可以看出E、F培养基在48h取样点时绵羊肺炎支原体生长的滴度要好于H培 养基，说明绵羊肺炎支原体在猪肺汤中适应期短，生长起动快，增殖迅速。但随着培养时 间的延长H、F培养基的培养效果要好于E培养基，这可能与培养基中血清含量有关，H培 养基和F培养基的培养效果相当，但F培养基马血清用量较H培养基降低了50%，从而也 大幅降低了培养基的成本。