技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)引起的急性热性高度接触性传染病，主要侵害偶蹄类动物，猪类是较易感群体，临床上以口腔黏膜、蹄部及乳房皮肤发生水疱和溃烂为主要特征，是家畜疫病中传染性最强的一种，每一次口蹄疫的爆发都会给农业经济带来极大的损失。因此国际兽疫局(OIE)一直将其列为发病必须报告的A类动物疫病名单之首。所以对猪的口蹄疫的预防和诊断就显得尤为重要。目前，口蹄疫病毒的防治主要依靠传统的灭活疫苗。灭活疫苗具有其自身的优势，免疫效果好，造价低等。但也存在一些潜在的不足，灭活疫苗仍然具有因为灭活不彻底或者由于与外界野毒株基因重组从而产生毒力扩散的危险。另外，对于口蹄疫病毒，其流行毒株总在不断变异，也就是说疫苗毒株的研制总是滞后于变异毒株的出现。针对以上问题，需要探索新的口蹄疫疫苗。目前，多肽疫苗是一个研究热点，因为这种疫苗是由病毒的不同表位组合而成，既能引起免疫应答，又克服了疫苗本身散毒的问题。因此，如何分离和鉴定口蹄疫病毒表位是一个关键的问题。目前，口蹄疫病毒表位的研究多集中于B细胞表位和辅助性T细胞(T helper,Th)表位，这两类表位主要与引起体液免疫应答有关；目前缺乏引起细胞免疫应答的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Leukocyte,CTL)表位。口蹄疫病毒是严格的细胞内寄生物，其感染宿主细胞后势必会引起细胞免疫应答。因此，如何在体外筛选和鉴定口蹄疫病毒CTL表位是一个非常有研究价值的课题。目前，体外筛选和鉴定病毒CTL表位的方法有多种，包括细胞杀伤实验，ELISPOT和四聚体方法等。其中，ELISPOT和四聚体相结合是目前筛选和鉴定病毒CTL表位常用的方法。
ELISPOT技术，又称为酶联免疫斑点技术，是1983年Czerkinsky等(J Clin Microbiol,1983,17(6):965-969)首次报道，用于测定大肠杆菌产生的热敏毒素，类似于酶联免疫吸附实验(ELISA)，是ELISA技术的延伸，目前常用来测定细胞因子或CTL的功能。Herr等(J ImmunolMethods,1996,191(2):131-142)于1996年开始将该技术应用于测定人HLA-A2结合的HIV表位多肽引起的细胞杀伤反应，其基本原理就是HIV表位肽能够刺激CD8+T淋巴细胞(CTL)释放γ-干扰素，从而可以间接测定多肽的CTL活性。据研究报道(王怡瑞等，中国艾滋病性病，2005,11(1):70-72)，ELISPOT可以从100万个细胞中检测出单个分泌细胞，能对分泌细胞因子速度<每秒100个分子的细胞进行检测，具有较高的可靠性、重复性和灵敏性。
MHC I/肽四聚体技术是由Altman等(Science,1996,274(2584):94-96)在1996年建立的用于定量检测特异性T细胞。该技术使抗原特异性CTL活性检测达到特异、高效和直接定量的程度，其灵敏度是ELISPOT检测结果的3-5倍。该技术的基本原理是单个MHC-肽复合物与TCR结合的亲和力很低，并且解离速度快。而Altman在研究中发现4分子的pMHC与TCR结合具有较强的亲和力和生物学效果。根据生物素与亲和素4:1的特异性结合关系，利用生物素-蛋白连接酶(Biotin-protein ligase A,BirA)能识别蛋白的特异序列(李青等，细胞免疫学杂志，2005，2005,21(5):557-560)，在MHC分子的重链羧基端上加入1个生物素的BirA底物肽序列，BirA酶即可将生物素结合到pMHC上，从而4个生物素化的pMHC单体与1个亲和素标记的链霉亲和素形成四聚体复合物，进而提高pMHC与TCR的总体亲和力，并可通过灵敏度较高的流式细胞仪(FACS)对抗原特异性T淋巴细胞进行快速的检测和分离。
猪的主要组织相容性复合体(major histocompatility complex,MHC)也称为猪的白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)，其I类分子介导细胞性免疫应答。SLA I类分子的重链与轻链及病毒多肽在细胞内可以形成复合体，递呈到细胞表面被CD8+T细胞受体(TCR)识别，引起杀伤性T细胞(Cytotoxic T leukocyte,CTL)免疫应答，有利于机体清除病毒，抵抗疾病。这些有功能的病毒多肽即是潜在的疫苗候选表位。在体外，如何鉴别和筛选有功能的病毒表位，是一个十分关键的技术。
目前，国内还没有将Tetramer技术应用于猪SLA I类分子结合的口蹄疫病毒多肽功能的鉴定上。本发明拟在前期研究荷包猪SLA-2结合多肽的基础上，将ELISPOT技术和Tetramer技术结合，鉴定和筛选口蹄疫病毒多肽的功能，为今后研制包含口蹄疫病毒CTL表位的新型多肽疫苗奠定基础。
发明内容
本发明针对设计的口蹄疫病毒多肽，将采用ELISPOT和构建四聚体两种方法筛选和鉴定口蹄疫病毒多肽，构建荷包猪SLA-2重链四聚体，并在原核表达系统pET-21a(+)/BL21进行了表达，包涵体提取；口蹄疫病毒多肽，通过ELISPOT方法筛选具有引起特异性CTL反应的多肽，然后将多肽与SLA-2重链、已有的轻链β2m进行复性、生物素化以及与FITC标记链霉亲和素反应生成SLA-2-BSP/肽四聚体，然后通过流式细胞术检测四聚体的功能。
本发明的技术特征如下：
1、猪口蹄疫病毒SLA I限制性CTL表位设计
以NetMHCpan 2.8Version为模板，将克隆的包括荷包猪SLA-2在内的SLA I类分子各功能基因提交于在线网站模板(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)，与网站原有的SLA I类分 子各功能基因组成猪源病毒CTL表位的预测在线工具。将O型口蹄疫病毒Tibet/CHA/99(HuBHK99)、A型口蹄疫病毒A-HuBWH(1)2009以及亚洲I型口蹄疫病毒1/Jiangsu/China/2005三种毒株的VP1和3D非结构蛋白序列分别输入预测模板，进行CTL表位的预测，尽量选择具有高亲和力的多肽候选表位。
2、ELISPOT试验：
(1)无菌PBS稀释包被IFN-γ单克隆抗体至10μg/mL，pH7.4；
(2)取出ELISPOT专用板，每孔加入50μL 70％乙醇处理，处理时间最多不要超过1min(一般几十秒，膜润透即可)，弃去乙醇溶液，每孔加入200μL无菌水洗5次，每孔加100μL稀释好的IFN-γ单抗溶液，4-8℃过夜孵育；
(3)次日，吸去抗体溶液，每孔200μL无菌PBS洗2次；
(4)每孔加入20μL封闭液，37℃封闭2h，吸去封闭液，每孔加200μL完全培养基，室温孵育至少30min；
(5)吸去培养基，每孔加入100μL预先稀释的多肽和PBMC细胞悬液(细胞悬液稀释至2.5×105cells/mL)，每个样品设置3个重复；
(6)盖好板盖，37℃、5％CO2条件下孵育培养18～20h(最佳培养时间需预试验摸索)，培养期间，不可扰动细胞；
(7)吸去细胞悬液，每孔200μL无菌PBS洗5次，用含0.5％FBS的PBS稀释检测抗体至0.5μg/mL，每孔加入100μL，37℃孵育2h，按照步骤(3)完成清洗；
(8)用含0.5％FBS的PBS稀释链酶亲和素(streptavidin-HRP)，每孔加100μL。37℃孵育1h，按照步骤(3)完成清洗；
(9)每孔加100μL显色液避光放置，视斑点形成情况反应5～30min，切勿反应过度造成较高背景显色，以去离子水洗涤每孔来终止底物显色反应，室温风干2h或过夜待其完全干燥，于密封塑料袋中长期保存。ELISPOT斑点用Cellular Technology Ltd.(CTL)公司Analyzer读板仪计数，其中分别用ImmunoCapture软件完成图像获取，用Immunospot 5.0软件分析统计并质控。
3、重链SLA-2-BSP与轻链sβ2m四聚体化
1)、菌体培养
A：重链SLA-2-HB-BSP和轻链β2m表达检测
活化重链重组菌SLA-2-HB-BSP/BL21和轻链重组菌β2m/BL21，分别接种5mL含有Amp(100μg/mL)的培养基，37℃培养至OD600达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，取菌体SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
重组菌SLA-2-HB-BSP/pET-21a(+)-BL21经过诱导，12％SDS-PAGE检测，发现其表达正常，位置大约在34kD。轻链β2m/pET-21a(+)经过诱导和SDS-PAGE检测，证实该蛋白表达正常，蛋白位置大约在12kD左右。重链和轻链均适合进行下一步的四聚体制备。
将SDS-PAGE检测正确表达的重链SLA-2-HB-BSP/pET-21a重组菌以及轻链sβ2m/pET-21a重组菌37℃过夜培养。
B：分别以1:100的稀释度稀释过夜培养物到1L LB中，37℃培养到OD600＝1，加入IPTG至终浓度到0.5mmol/L，继续培养4小时，收获细菌(重链轻链各1升)。
2)、包涵体制备
A：细菌用30mL PBS悬浮，650W超声破菌(5sec on/10sec off，10min).
B：包涵体用25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl，1％Triton-X100洗涤液洗2次。
C：包涵体用25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl洗涤液洗1次。
D：包涵体用含有8mol/L尿素的25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl溶解，到蛋白质浓度为10mg/mL。
3)、复性
在4℃条件下，往500mL的100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，400mmol/L Arginine，5mmol/Lreduced Glutathione，0.5mmol/L oxidised Glutathione中加入15mg重链、10mg轻链和5mg表位肽，搅拌48小时。
4)、MHC单体的生物素化
500mL的复性液，浓缩到5mL，用PD10柱进行缓冲液交换，新缓冲液为10mmol/L TrispH8.0。根据BirA试剂盒(Avidity)的说明，将试剂盒中成分加入到上述蛋白质溶液中，室温处理16小时。
5)、生物素化单体的分离
将上述过夜的蛋白质溶液进行AKTA FPLC分离：分离柱Hiload 26/600Supdex 75pg，分离缓冲液为20mmol/L Tris-HCl pH8，100mmol/L NaCl；流速1mL/min。收集洗脱体积为163ml的蛋白峰，浓缩到1mg/mL。
6)、单体的鉴定
A：SDS-PAGE，将上述FPLC分离的单体，点样8μg，如果看到重链以及轻链两条带，表明复性后单体已经形成。
B：ELISA检测，4℃过夜包被FPLC分离的单体，每孔2μg，两孔，同时加入未生物素化的单体作为对照，用HRP标记的strepavidin(Biolegend)进行检测单体的生物素化情况。
按照每1mg生物素化单体加0.312mg extravidine-PE的量混合，形成PE标记好的四聚体。
4、SLA-2/HB/As63Tetramer流式检测
(1)分离1/Jiangsu/China/2005毒株攻毒组猪的外周血单核细胞，1500rmp室温离心3min，弃上清，以PBS(pH 7.2)洗涤细胞一次，并再次离心。
(2)将细胞沉淀重悬于FACS洗涤液(含0.1％NaN3和0.1％BSA的1×PBS)。
(3)在细胞悬液中加入5μL PE标记的SLA-2-HB-BSP/As63四聚体，室温避光反应20min。
(4)加入2mLFACS洗涤液重悬细胞，500×g室温离心3min，弃上清，细胞沉淀重悬于100μLFACS洗涤液。
(5)加入5μL(2.5μg)FITC标记的Anti-pig CD8a抗体，在室温继续避光反应20min。
(6)加入FACS洗涤液洗涤细胞一次，1500rmp室温离心3min，弃上清，细胞沉淀重悬于适量(300～400μL)FACS洗涤液中。
(7)细胞悬液样品经流式细胞术分析并分选。
As63属于亚洲I型口蹄疫毒株，取攻亚洲I型毒的猪的外周血单核细胞(PBMC)，使用FITC标记的Anti-Pig CD8a单克隆抗体对PBMC进行染色。再使用PE标记的SLA-2-HB-BSP-As63-sβ2m四聚体对PBMC进行双染色，即针对于As63多肽表位的特性型的CTL，约占总细胞的8.21％，与对照组0.1％(未攻毒组细胞)形成极显著的差异(P<0.01)，证明SLA-2-HB-As63-sβ2m四聚体制备成功，同时证明As63为口蹄疫病毒特异性的CTL表位。
结果表明，ELISPOT成功筛选出一亚洲I型口蹄疫病毒多肽As63，具有显著的CTL功能。由As63多肽制备的SLA-2-/As63四聚体能够与特异性的CTL细胞反应。本发明通过ELISPOT方法鉴定得到了猪口蹄疫病毒VP1的一条特异性多肽表位，并成功构建了该多肽表位的SLA-2/肽四聚体，检测了针对于该表位的特异性CTL，初步建立了猪四聚体技术平台，为研究猪特异性CTL免疫应答以及T细胞表位筛选奠定基础。
附图说明
图1为重组SLA-2-HB-BSP/pET-21a(+)蛋白表达检测，M代表低分子量蛋白Marker、1:未诱导组、2:诱导表达的SLA-2-HB-BSP/pET-21a(+)蛋白；
图2为重组β2m/pET-21a(+)蛋白表达检测，M代表低分子量蛋白Marker、1，未诱导的β2m/pET-21a(+)重组菌表达情况、2，诱导表达的β2m/pET-21a(+)重组菌表达情况，表达蛋白大小约12kD；
图3为ELISPOT检测各口蹄疫多肽刺激CTL分泌IFN-γ的能力，##代表优势多肽表位；
图4为各口蹄疫多肽刺激CTL所产生代表性的ELISPOT结果，其中：A，空白对照组，未攻毒；B，阴性对照组，攻毒后未加多肽刺激；C，As63刺激组；D，WX96刺激组；E，3D314刺激组；F，AHu63刺激组；G，WH94刺激组；H，INT3刺激组；I，Q10刺激组；J，As3刺激组，每个组右下角的数字代表对应的斑点数；
图5为分离生物素化SLA-2-HB-BSP-As63-β2m单体FPLC图谱，从左到右，依次为多聚体(123.42)，SLA-2-BSP-As63-β2m单体(165.34)，重链SLA-2-BSP(230.91)和轻链β2m(289)；
图6为SDS-PAGE质控单体的制备，M，分子量标准；1，浓缩的生物素化并且FPLC分离后单体；
图7为流式细胞术检测SLA-2-BSP-As63-β2m形成的Tetramer分析；
图8流式细胞术检测四聚体代表性图谱，其中：A，代表取未免疫组猪PBMC检测四聚体；B，免疫组猪PBMC检测四聚体的流式结果，Q1代表FITC单标记的CD8+T细胞的比例；Q2，代表FITC和PE标记的双阳性细胞，即能识别四聚体的CD8+T细胞；Q3，双阴性细胞；Q4，PE单标记的细胞，即其他能识别四聚体的淋巴细胞。
具体实施方式
现结合实施例进一步说明本发明。
首先，说明本发明中所涉及到的试剂；
IPTG、DNA Marker和蛋白分子量Marker均为TaKaRa公司产品；4-氯-1-萘酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris-碱)、甘氨酸、N，N，-二甲基叉双丙烯酰胺和丙酰胺、PBS溶液、NH4Cl、DMSO、Tris-base、L精氨酸、EDTA、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、PMSF、过硫酸铵、TEMED、DTT、考马斯亮蓝R250均购自生工生物工程有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、western blot显影液和定影液均购自碧云天公司；蛋白浓缩超滤管购自MilliPore公司；Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody和HRPConjugated Goat anti-MouseIgG购自艾美捷科公司；ELISpotPLUSfor Porcine IFN-γKit购自Mabtech公司；猪外周血淋巴细胞分离液Kit购自TBD公司；Con-A(刀豆蛋白A)购自SIGMA公司；胎牛血清和RPMI 1640培养基购自Gabicol；Penicillin Streptomycin Solution双抗购自Hyclone；Hiload10/600Superdex 200pg预装柱购自GE(Amersham Biosciences)公司；AVIDITY公司Biotin-ProteinLigase-BIRA500Kit；SIGMA公司Fluorescein isothiocyanate-R-Phycoerythrin；BD公司PEMouse Anti-Pig CD8a单克隆抗体；BD公司PerCP Mouse Anti-Pig CD3a单克隆抗体。
其次，做好试验动物做准备。
选一月龄的纯种荷包猪，公猪，8头。(6头作试验组，2头作对照)，抽取猪血液2mL，5000rmp离心30min取上清，检测抗体效价。
3日龄的乳鼠，接乳鼠毒200μL(10：1的乳鼠毒)，乳鼠平均死亡时间27h。处理死亡的乳鼠：剪掉乳鼠头，去掉四肢和内脏，放入无菌石英砂和PBS液至5mL，研磨，得到1:10的乳鼠毒。
将得到的乳鼠毒继续传代：3000rpm离心20min取上清，每只乳鼠接毒200μL。如此连续传4代，至乳鼠平均死亡时间在17h，此时毒性较强，所选用的毒株见表1。
表1试验所用的口蹄疫病毒的毒株
攻毒猪养在兰州兽医研究所P3实验室强毒动物舍，未攻毒猪养在普通动物房。取乳鼠毒，PBS液稀释至300:1，耳后根肌肉注射1mL。
表2攻毒试验安排
从攻毒后15日开始，每天取适量对应攻毒猪新鲜抗凝血。
(1)取新鲜抗凝血2mL，与全血及组织匀浆稀释液1:1等体积混匀。
(2)取一支15mL离心管，加入3mL分离液置于18-22℃。
(3)将血液样本小心加于分离液之液面上。18-22℃，2200rmp离心20min。低温(如4℃)离心会降低细胞得率。
(4)离心后，用吸管小心吸出分离液上层(包含淋巴细胞的细胞层)0.5cm以下的上清液部分，弃去。
(5)用吸管小心吸取分离液层及淋巴细胞层至于另一新离心管内。
(6)在步骤4中所得离心管中加入10mL细胞洗涤液混匀。
(7)弃去上清。
(8)用吸管以5mL细胞洗涤液重悬所得细胞。
(9)1600rmp离心10min。弃上清。重复步骤(7)、(8)、(9)，后以用适当体积的RPMI 1640完全培养基重悬细胞。
(10)细胞计数，调整细胞数为1×107，保存备用。
最后开始本发明中的SLA-2-HB-BSP-As63-sβ2m四聚体的制备。
1、猪口蹄疫病毒SLA-I限制性CTL表位设计
以NetMHCpan 2.8Version(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)为模板，将克隆的包括荷包猪SLA-2在内的SLA I类分子各功能基因提交于在线网站模板，与网站原有的SLA I类分子各功能基因组成猪源病毒CTL表位的预测在线工具。将O型口蹄疫病毒Tibet/CHA/99(HuBHK99)、A型口蹄疫病毒A-HuBWH(1)2009以及亚洲I型口蹄疫病毒1/Jiangsu/China/2005三种毒株的VP1和3D非结构蛋白序列分别输入预测模板，进行CTL表位的预测，尽量选择具有高亲和力的多肽候选表位，见表3。
表3限制性猪FMDV抗原预测表位
aNetMHCpan 2.8 Server(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)中应用权重矩阵预测的多肽与SLA-2-HB的结合力分数(强结合力多肽秩阈值为0.5；弱结合力多肽秩阈值为2.0)
b NetMHCpan 2.8 Server中应用人工神经网络预测的多肽IC50值(强结合/SB低于50nM；弱结合/WB低于500nM)。
2、ELISPOT试验：
ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验(Enzyme-linked Immunospot Assay)是一种结合了细胞培养技术与ELISA技术，能够在细胞水平检测细胞因子分泌情况的手段。而由于具有活性的CTL表位多肽可以刺激特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ，利用这一性质，可以通过该方法对预测得到的FMDV表位肽进行筛选。分离感染口蹄疫病毒的猪外周血单核细胞，用于ELSPOT特异性T细胞表位肽筛选。设立未攻毒PBMC为空白对照组，以及以未加多肽刺激 物的攻毒PBMC为阴性对照组。
(1)无菌PBS稀释包被IFN-γ单克隆抗体至10μg/mL，pH7.4；
(2)取出ELISPOT专用板，每孔加入50μL 70％乙醇处理，处理时间最多不要超过1min(一般几十秒，膜润透即可)，弃去乙醇溶液，每孔加入200μL无菌水洗5次，每孔加100μL稀释好的IFN-γ单抗溶液，4-8℃过夜孵育；
(3)次日，吸去抗体溶液，每孔200μL无菌PBS洗2次；
(4)每孔加入20μL封闭液，37℃封闭2h，吸去封闭液，每孔加200μL完全培养基，室温孵育至少30min；
(5)吸去培养基，每孔加入100μL预先稀释的多肽和PBMC细胞悬液(细胞悬液稀释至2.5×105cells/mL)，每个样品设置3个重复；
(6)盖好板盖，37℃、5％CO2条件下孵育培养18～20h(最佳培养时间需预试验摸索)，培养期间，不可扰动细胞；
(7)吸去细胞悬液，每孔200μL无菌PBS洗5次，用含0.5％FBS的PBS稀释检测抗体至0.5μg/mL，每孔加入100μL，37℃孵育2h，按照步骤(3)完成清洗；
(8)用含0.5％FBS的PBS稀释链酶亲和素(streptavidin-HRP)，每孔加100μL。37℃孵育1h，按照步骤(3)完成清洗；
(9)每孔加100μL显色液避光放置，视斑点形成情况反应5～30min，切勿反应过度造成较高背景显色，以去离子水洗涤每孔来终止底物显色反应，室温风干2h或过夜待其完全干燥，于密封塑料袋中长期保存。ELISPOT斑点用Cellular Technology Ltd.(CTL)公司Analyzer读板仪计数，其中分别用ImmunoCapture软件完成图像获取，用Immunospot 5.0软件分析统计并质控。
各组按照ELISPOT标准试验步骤进行反应，结果如图3和图4所示，利用CTL公司Analyzer读板仪，所读得的每一组肽的效斑点，代表肽刺激CTL后能分泌的一个IFN-γ分子，斑点越多，代表肽刺激CTL分泌IFN-γ的能力越强，刺激能力最强的肽被选作优势表位肽。由图3可知，As63多肽刺激CTL的能力远远高于其他多肽，其次为INT3、Ahu63和Q10。图4C-J为各多肽代表性的ELISPOT检测结果，A-B分别代表空白对照和阴性对照。由图可知，与对照组相比较，各多肽均有一定的刺激能力，但要用于四聚体制备，必须选择最优势的多肽，因此As63可以作为下一步进行四聚体制备选择的优势多肽表位。
3、重链SLA-2-BSP与轻链sβ2m四聚体化
1)、菌体培养
A：活化重链重组菌SLA-2-HB-BSP/BL21和轻链重组菌β2m/BL21，分别接种5mL含有Amp(100μg/mL)的培养基，37℃培养至OD600达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，取菌体SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
重组菌SLA-2-HB-BSP/pET-21a(+)-BL21经过诱导，12％SDS-PAGE检测，发现其表达正常，位置大约在34kD，见图1。轻链β2m/pET-21a(+)经过诱导和SDS-PAGE检测，证实该蛋白表达正常，蛋白位置大约在12kD左右，见图2。重链和轻链均适合进行下一步的四聚体制备。
将SDS-PAGE检测正确表达的重链SLA-2-HB-BSP/pET-21a重组菌以及轻链sβ2m/pET-21a重组菌37℃过夜培养。
B：分别以1:100的稀释度稀释过夜培养物到1L LB中，37℃培养到OD600＝1，加入IPTG至终浓度到0.5mmol/L，继续培养4小时，收获细菌(重链轻链各1升)。
2)、包涵体制备
A：细菌用30mL PBS悬浮，650W超声破菌(5sec on/10sec off，10min).
B：包涵体用25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl，1％Triton-X100洗涤液洗2次。
C：包涵体用25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100mmol/LM NaCl洗涤液洗1次。
D：包涵体用含有8mol/L尿素的25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl溶解，到蛋白质浓度为10mg/mL。
3)、复性
在4℃条件下，往500mL的100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，400mmol/L Arginine，5mmol/Lreduced Glutathione，0.5mmol/L oxidised Glutathione中加入15mg重链、10mg轻链和5mgAs63表位肽，搅拌48小时。
4)、MHC单体的生物素化
500mL的复性液，浓缩到5mL，用PD10柱进行缓冲液交换，新缓冲液为10mmol/L TrispH8.0。根据BirA试剂盒(Avidity)的说明，将试剂盒中成分加入到上述蛋白质溶液中，室温处理16小时。
5)、生物素化单体的分离
将上述过夜的蛋白质溶液进行AKTA FPLC分离：分离柱Hiload 26/600Supdex 75pg，分离缓冲液为20mmol/L Tris-HCl pH8，100mmol/L NaCl；流速1mL/min。收集洗脱体积为163ml 的蛋白峰，浓缩到1mg/mL。
6)、单体的鉴定
A：SDS-PAGE，将上述FPLC分离的单体，点样8μg，如果看到重链以及轻链两条带，表明复性后单体已经形成。
B：ELISA检测，4℃过夜包被FPLC分离的单体，每孔2μg，两孔，同时加入未生物素化的单体作为对照，用HRP标记的strepavidin(Biolegend)进行检测单体的生物素化情况，如图5所示，OD595读数：生物素化单体孔1＝1.24，生物素化单体孔2＝1.16，未生物素化单体孔1＝0.18；未生物素化单体孔2＝0.15。生物素化与未生物素化样品形成明显的对比，表明生物素化成功。
按照每1mg生物素化单体加0.312mg extravidine-PE的量混合，形成PE标记好的四聚体，如图6所示。
4、SLA-2/HB/As63Tetramer流式检测
(8)分离1/Jiangsu/China/2005毒株攻毒组猪的外周血单核细胞，1500rmp室温离心3min，弃上清，以PBS(pH 7.2)洗涤细胞一次，并再次离心。
(9)将细胞沉淀重悬于FACS洗涤液(含0.1％NaN3和0.1％BSA的1×PBS)。
(10)在细胞悬液中加入5μL PE标记的SLA-2-HB-BSP/As63四聚体，室温避光反应20min。
(11)加入2mLFACS洗涤液重悬细胞，500×g室温离心3min，弃上清，细胞沉淀重悬于100μLFACS洗涤液。
(12)加入5μL(2.5μg)FITC标记的Anti-pig CD8a抗体，在室温继续避光反应20min。
(13)加入FACS洗涤液洗涤细胞一次，1500rmp室温离心3min，弃上清，细胞沉淀重悬于适量(300～400μL)FACS洗涤液中。
(14)细胞悬液样品经流式细胞术分析并分选。
As63属于亚洲I型口蹄疫毒株，取攻1/Jiangsu/China/2005毒的猪的外周血单核细胞(PBMC)，使用FITC标记的Anti-Pig CD8a单克隆抗体对PBMC进行染色。再使用PE标记的SLA-2-HB-BSP-As63-sβ2m四聚体对PBMC进行双染色，即针对于As63多肽表位的特性型的CTL，约占总细胞的8.21％，见图7，与对照组0.1％(未攻毒组细胞)形成极显著的差异(P<0.01)，证明SLA-2-HB-As63-sβ2m四聚体制备成功，同时证明As63为口蹄疫病毒特异性的CTL表位。代表性的四聚体流式检测见图8。
本研究，通过免疫和ELISPOT成功筛选出了一条亚洲I型口蹄疫病毒多肽As63，并以 该多肽与前期构建的荷包猪SLA-2-HB-BSP以及sβ2m蛋白构建了四聚体，利用流式细胞术成功检测到制备的含有多肽As63的四聚体。研究最终证明多肽As63具有免疫学活性，是潜在的亚洲I型口蹄疫病毒CTL表位。