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1、(10)申请公布号 CN 103627811 A (43)申请公布日 2014.03.12 CN 103627811 A (21)申请号 201310673844.8 (22)申请日 2013.12.11 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) (71)申请人 东北农业大学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材 街 59 号 (72)发明人 姜毓君 满朝新 庞心怡 周文琦 赵玥明 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 11419 代理人 何自刚 王玉松 (54) 发明名称 一种快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒及其应 。
2、用 (57) 摘要 本发明公开了一种快速检测肉中沙门氏菌的 试剂盒及其应用， 试剂盒由 Bst DNA 聚合酶、 LAMP 扩增反应体系， 阴性对照液和阳性对照液组成。 其中， LAMP 扩增反应体系由 LAMP 引物组和扩增 反应液组成， 其中每 25L LAMP 扩增反应体系由 10M F3 和 B3， 40M FIP 和 BIP， 1thermopol buffer,1M 甜 菜 碱 ,3.5L dNTP,6mM MgCl2和 1L模板DNA组成， 其余部分由灭菌双蒸水补足。 本发明可以对肉中污染的沙门氏菌进行快速简便 的检测， 无需复杂的热循环仪， 普通的水浴锅就可 以满足温度的要求。。
3、 具有快速、 灵敏、 简便、 高效的 优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103627811 A CN 103627811 A 1/1 页 2 1. 一种快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒， 由 Bst DNA 聚合酶、 LAMP 扩增反应体系， 阴 性对照液和阳性对照液组成， 其特征在于， LAMP 扩增反应体系含有以下两组引物组中的任 一一组 ： （1） 上游内引物 FIP ： 5 -gacgactg。
4、gtactgatcgatagtttttcaacgtttcctgcgg-3 ； 下游内引物 BIP ： 5 -ccggtgaaattatcgccacacaaaacccaccgccagg-3 ； 上游外引物 F3 ： 5 -ggcgatattggtgtttatgggg-3 ； 下游外引物 B3 ： 5 -aacgataaactggaccacgg-3 ； （2） 上游内引物 FIP ： 5 -cccagatccccgcattgttgatttttccgccccatattatcgctat-3 ； 下游内引物 BIP ： 5 -gaccatcaccaatggtcagcattttattggcggtatttc。
5、ggtggg-3 ； 上游外引物 F3 ： 5 -gttcaacagctgcgtcatga-3 ； 下游外引物 B3 ： 5 -cgctattgccggcatcatta-3 。 2. 根据权利要求 1 所述试剂盒， 其特征在于， 所述引物组为 ： 上游内引物 FIP ： 5 -gacgactggtactgatcgatagtttttcaacgtttcctgcgg-3 ； 下游内引物 BIP ： 5 -ccggtgaaattatcgccacacaaaacccaccgccagg-3 ； 上游外引物 F3 ： 5 -ggcgatattggtgtttatgggg-3 ； 下游外引物 B3 ： 5 -aa。
6、cgataaactggaccacgg-3 。 3. 根据权利要求 2 所述试剂盒， 其特征在于， 按照体积份数组成如下 ： 1 份 8U/L 的 Bst DNA 聚合酶、 24 份的 LAMP 扩增反应体系， 1 份的阴性对照液和 1 份的阳性对照液。 4. 根据权利要求 2 所述试剂盒， 其特征在于， 所述 LAMP 扩增反应体系由 LAMP 引物组 和扩增反应液组成， 其中每25L LAMP扩增反应体系由10M F3和B3， 40M FIP和BIP， 1thermopol buffer,1M 甜菜碱 ,3.5L dNTP,6mM MgCl2和 1L 模板 DNA 组成， 其余部 分由灭菌双。
7、蒸水补足。 5. 根据权利要求 2 所述试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照液为沙门氏菌标准菌株培 养液中提取的基因组 DNA 溶液， 阴性对照液为灭菌双蒸水。 6. 权利要求 1 所述试剂盒用于检测肉中沙门氏菌。 7. 根据权利要求 6 所述方法， 其特征在于， 步骤如下 ： 1） 提取待测物 DNA ： 取 25g 待检肉样置于无菌均质袋中， 加入 225mL 生理盐水， 拍打匀 浆， 提取肉中沙门氏菌的 DNA ； 2） 环介导等温扩增 ： 以 DNA 提取物为模板进行 LAMP 扩增， 将除 Bst DNA 聚合酶以外的 LAMP 反应体系在 95预变性 5 10min， 然后迅速置于。
8、 0 4加入 Bst DNA 聚合酶， 65 酶促反应 60min， 最后升温至 80使酶失活 2min ； 3） 电泳检测 ： 取 5L 扩增产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳， 在 110V 电压下电泳 40min， 利 用凝胶成像系统观察结果。 权 利 要 求 书 CN 103627811 A 2 1/5 页 3 一种快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒及其应用， 属于食品安全技术领 域。 背景技术 0002 沙门氏菌在环境中广泛存在， 是一种引起食源性疾病的重要致病菌， 能引起人胃 肠炎、 伤寒、 败血症等症状。沙门氏菌菌属类。
9、型多样， 抗原复杂， 目前已分离出 2500 多个血 清型。 最近的一项研究美国食源性疾病暴发的报告中指出沙门氏菌是最常见的细菌性病原 体， 占所有细菌性食物中毒的 52%。在我国近年来， 沙门氏菌也是微生物引起食源性疾病中 最主要的病原菌之一， 占17.19%。 许多动物性食品尤其是生肉， 都是沙门氏菌污染的主要来 源。目前检测沙门氏菌的传统方法费时费力， 或者需要复杂昂贵的仪器等缺点已经不适用 于现代检测。环介导等温扩增技术 （LAMP） 由 Notomi 等人于 2000 年建立， 利用具有链置换 活性的 Bst DNA 聚合酶， 通过对靶基因的 6 个区段设计的 4 条特异性的引物， 。
10、在恒温 （60 65） 、 短时间 （1h） 条件下达到对目的基因的高效扩增。由于 LAMP 的扩增产物是靶基因的 一系列反向重复形成的类似花椰菜结构， 电泳呈现的是不同片段大小组成的阶梯式图谱， 也可以根据生成的焦磷酸镁沉淀通过肉眼来判断反应是否发生。 本方法所采用的试剂盒技 术能够对肉中沙门氏菌进行快速灵敏的检测。 发明内容 0003 本发明提供了一种快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒。 目的在于解决传统方法检测 沙门氏菌繁琐和费时费力的缺陷以及现有 PCR 技术对仪器要求较高的不足， 从而提供一种 快速简便， 灵敏度更高的， 并且适用于基层单位采用的检测肉中沙门氏菌的方法及检测试 剂盒。 00。
11、04 本发明技术方案如下 ： 一种快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒， 由 Bst DNA 聚合酶、 LAMP 扩增反应体系， 阴性对照液和阳性对照液组成， 其特征在于， LAMP 扩增反应体系含有 以下两组引物组中的任一一组 ： 0005 （1） 上游内引物 FIP ： 5 -gacgactggtactgatcgatagtttttcaacgtttcctgcgg-3 ； 0006 下游内引物 BIP ： 5 -ccggtgaaattatcgccacacaaaacccaccgccagg-3 ； 0007 上游外引物 F3 ： 5 -ggcgatattggtgtttatgggg-3 ； 0008 下游外。
12、引物 B3 ： 5 -aacgataaactggaccacgg-3 ； 0009 （2）上 游 内 引 物 FIP ： 5 -cccagatccccgcattgttgatttttccgccccatattatcgcta t-3 ； 0010 下游内引物 BIP ： 5 -gaccatcaccaatggtcagcattttattggcggtatttcggtggg-3 ； 0011 上游外引物 F3 ： 5 -gttcaacagctgcgtcatga-3 ； 0012 下游外引物 B3 ： 5 -cgctattgccggcatcatta-3 。 0013 进一步地， 引物组的选择对于检出限至关重要，。
13、 优选引物组为 ： 说 明 书 CN 103627811 A 3 2/5 页 4 0014 上游内引物 FIP ： 5 -gacgactggtactgatcgatagtttttcaacgtttcctgcgg-3 ； 0015 下游内引物 BIP ： 5 -ccggtgaaattatcgccacacaaaacccaccgccagg-3 ； 0016 上游外引物 F3 ： 5 -ggcgatattggtgtttatgggg-3 ； 0017 下游外引物 B3 ： 5 -aacgataaactggaccacgg-3 。 0018 按照体积份数组成如下 ： 1 份 8U/L 的 Bst DNA 聚合酶。
14、、 24 份的 LAMP 扩增反应体 系， 1 份的阴性对照液和 1 份的阳性对照液。 0019 所述 LAMP 扩增反应体系由 LAMP 引物组和扩增反应液组成， 其中每 25L LAMP 扩 增反应体系由10M F3和B3， 40M FIP和BIP， 1thermopol buffer,1M甜菜碱,3.5L dNTP,6mM MgCl2和 1L 模板 DNA 组成， 其余部分由灭菌双蒸水补足。 0020 所述阳性对照液为沙门氏菌标准菌株培养液中提取的基因组 DNA 溶液， 阴性对照 液为灭菌双蒸水。 0021 本发明还提供了一种应用上述试剂盒快速检测肉中沙门氏菌的方法。 0022 所述试剂。
15、盒用于检测肉中沙门氏菌具体步骤如下 ： 0023 1） 提取待测物 DNA ： 取 25g 待检肉样置于无菌均质袋中， 加入 225mL 生理盐水， 拍 打匀浆， 提取肉中沙门氏菌的 DNA ； 0024 2） 环介导等温扩增 ： 以 DNA 提取物为模板进行 LAMP 扩增， 将除 Bst DNA 聚合酶以 外的 LAMP 反应体系在 95预变性 5 10min， 然后迅速置于 0 4加入 Bst DNA 聚合酶， 65酶促反应 60min， 最后升温至 80使酶失活 2min ； 0025 3）电泳检测 ： 取 5L 扩增产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳， 在 110V 电压下电泳 40mi。
16、n， 利用凝胶成像系统观察结果。 0026 本发明快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒中按照体积份数由1份8U/L的Bst DNA 聚合酶、 24 份的 LAMP 扩增反应体系， 1 份的阴性对照液和 1 份的阳性对照组成。所述 LAMP 扩增反应体系由LAMP引物组和扩增反应液组成。 其中每25L LAMP扩增反应体系由10M F3 和 B3， 40M FIP 和 BIP， 1thermopol buffer,1M betain,3.5L dNTP 和 6mM MgCl2， 1L 模板 DNA 组成， 其余部分由灭菌双蒸水补足。阳性对照为沙门氏菌标准菌株培养液中 提取的基因组 DNA ； 阴性对照为。
17、灭菌双蒸水。 0027 引物均是针对沙门氏菌的吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白 （invA） 设计的， 是高度保 守的属特异性基因。LAMP 引物组中外引物与内引物比例关系为 1:8 时扩增效果最好。 0028 本发明的有益效果 ： 可以对肉中污染的沙门氏菌进行快速简便的检测， 无需复杂 的热循环仪， 普通的水浴锅就可以满足温度的要求。由于 LAMP 的引物是针对靶基因的 6 个 区段设计的， 因此特异性很强。从反应时间来看， LAMP 只需 2h 就可以得出最终结果， 而传 统方法对阴性样品的确定需要 4h。与同样是基于核酸检测的 PCR 方法相比， 检测灵敏度可 以提高 100 倍， 从而具有较。
18、高的灵敏度。因此， 本发明为肉中的沙门氏菌的检测提供了一个 快速、 灵敏、 简便、 高效的新方法， 特别是基层实验室快速初筛沙门氏菌， 提供了一个新的思 路。 附图说明 0029 图 1 具体实施方式实例 1 检测结果电泳图 ； 0030 （1， 实施例 1 阳性对照 ； 2， 实施例 2 阳性对照 ； 3， 实施例 1 ； 4， 实施例 2 ； 5， 实施例 说 明 书 CN 103627811 A 4 3/5 页 5 1 阴性对照 ； 6， 实施例 2 阴性对照） 。 0031 图 2 为具体实施方式实施例 1 灵敏度测试实验中 LAMP 扩增的电泳图 ； 0032 （M， marker 。
19、； 1， 沙门氏菌浓度 9.8107CFU/mL ； 2, 沙门氏菌浓度 9.8106CFU/ mL ； 3， 沙门氏菌浓度 9.8105CFU/mL ； 4， 沙门氏菌浓度 9.8104CFU/mL ； 5， 沙门氏菌浓度 9.8103CFU/mL ； 6， 沙门氏菌浓度 9.8102CFU/mL ； 7， 沙门氏菌浓度 9.8101CFU/mL ； 8， 沙 门氏菌浓度 9.8100CFU/mL ； 9， 沙门氏菌浓度 9.810-1CFU/mL ； 10, 阴性对照） 。 0033 图 3 为具体实施方式实施例 1 灵敏度测试实验中 PCR 扩增的电泳图 ； 0034 （M， marke。
20、r ； 1， 沙门氏菌浓度 9.8107CFU/mL ； 2, 沙门氏菌浓度 9.8106CFU/ mL ； 3， 沙门氏菌浓度 9.8105CFU/mL ； 4， 沙门氏菌浓度 9.8104CFU/mL ； 5， 沙门氏菌浓度 9.8103CFU/mL ； 6， 沙门氏菌浓度 9.8102CFU/mL ； 7， 沙门氏菌浓度 9.8101CFU/mL ； 8， 沙 门氏菌浓度 9.8100CFU/mL ； 9， 沙门氏菌浓度 9.810-1CFU/mL ； 10, 阴性对照） 。 具体实施方式 0035 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面结合实施例说明。 0036 实施例 1。
21、 0037 1. 采用细菌基因组试剂盒提取待检肉样中的沙门氏菌 DNA 0038 2、 以提取物作为模板进行 LAMP 扩增， 反应体系为 25L 0039 0040 说 明 书 CN 103627811 A 5 4/5 页 6 0041 LAMP扩增条件为 ： 95反应5min， 迅速置于4加入Bst酶， 65反应60min， 80 使酶钝化 2min。 0042 3、 扩增产物的电泳检测 0043 取5L扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳， 在110V电压下电泳40min， 并利用凝胶 成像系统观察结果 （图 1） 。 0044 本实施方法对仪器设备要求简单， 只需水浴条件即可完成， 耗时较短。
22、， 约 2 小时即 可完成， 检测灵敏度高， 检出限为 9.8101CFU/mL。 0045 实施例 2 0046 1、 待检肉样的 DNA 提取， 方法同实施例 1。 0047 2、 以提取物作为模板进行 LAMP， 反应体系为 25L。 0048 0049 说 明 书 CN 103627811 A 6 5/5 页 7 0050 3、 扩增产物的电泳检测 0051 取5L扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳， 在110V电压下电泳40min， 并利用凝胶 成像系统观察结果。 0052 本实施方法对仪器设备要求简单， 只需水浴条件即可完成， 耗时较短， 约 2 小时即 可完成， 检测灵敏度高， 检出。
23、限为 5.7102CFU/mL。 0053 实施例 3 关于灵敏度的测试 0054 对本发明实施例 1 的方法进行灵敏度的测试， 具体如下 ： 0055 鲜猪肉购自当地农贸市场， 人工染菌前经国标法确认不含有沙门氏菌。取 25g 猪 肉样品放入盛有并 225mL BPW 的无菌均质袋中， 制成 1 ： 10 稀释液， 人工接种沙门氏菌， 于 37培养 12h 后。调整匀浆液中菌体浓度为添加 107， 然后进行 10 倍梯度稀释， 使沙门氏菌 浓度即为 107CFU/mL 10-1CFU/mL， 分别提取每一组人工污染肉浆中沙门氏菌的 DNA， 方法 同实施例 1， 以提取物作为模板进行 LAM。
24、P 和 PCR 反应， 扩增结果的电泳图如图 2 所示， 图 2 从左到右依次为 marker,9.8107CFU/mL， 9.8106CFU/mL， 9.8105CFU/mL， 9.8104CFU/ mL， 9.8103CFU/mL， 9.8102CFU/mL， 9.8101CFU/mL， 9.8100CFU/mL， 9.810-1CFU/mL, 阴性对照。 0056 由图 2、 图 3 可知， LAMP 检测肉中污染的沙门氏菌的灵敏度为 9.8101CFU/mL， 比 PCR 灵敏度高 100 倍。 0057 实施例 4 0058 本发明快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒中按照体积份数由1份8U。
25、/L的Bst DNA 聚合酶、 24 份的 LAMP 扩增反应液， 1 份的阴性对照液和 1 份的阳性对照组成。所述 LAMP 扩 增反应体系由 LAMP 引物组和扩增反应液组成。其中每 25L LAMP 扩增反应体系由 10M F3 和 B3， 40M FIP 和 BIP， 1thermopol buffer,1M betain,3.5L dNTP 和 6mM Mgcl2， 1L 模板 DNA 组成， 其余部分由灭菌双蒸水补足。阳性对照为沙门氏菌标准菌株培养液中 提取的基因组 DNA ； 阴性对照为灭菌双蒸水。 0059 本实施方式的试剂盒应用于具体实施方式一、 二、 三中的 LAMP 扩增。
26、步骤。本试剂 盒需 0060 要在 -20的条件下保存。 0061 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受所述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103627811 A 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103627811 A 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 103627811 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103627811 A 10 2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103627811 A 11 。