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本申请要求2014年2月10日提交的美国临时申请序列第61/937,984号的优先权和权益，该临时申请的内容以引用方式整体并入本文中。
序列表
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发明领域
本发明涉及IgA多特异性结合分子。具体而言，本发明涉及包含IgA重链序列的多特异性(包括双特异性)结合分子，以及它们的制备和方法和用途。
发明背景
由于人源化抗体的出现，诸如(利妥昔单抗)、(曲妥单抗)和(贝伐单抗)的抗体的治疗用途已革新了医学领域，包括肿瘤学、炎性病症例如类风湿性关节炎的治疗和许多其他指征。在美国，已有超过30种人类或人源化抗体被批准用于临床应用，并且有超过600种新抗体或类抗体分子处于各个开发阶段。一些抗体对诸如血管内皮生长因子(VEGF)或肿瘤坏死因子(TNF)的可溶性靶分子具有拮抗功能，它们的作用是疾病病理过程的一部分。或者，抗体可结合、阻断和/或引起某些疾病如癌症中的病理性细胞的破坏。这些治疗性抗体的主要功能是通过Fab区的结合，以及经由Fc结构域的效应子功能的募集(其还介导抗体的长循环半衰期)。与小分子药物相比，抗体的主要优点中的一个可为它们的强烈特异性。抗体可非常准确地靶向选定的蛋白质抗原，例如癌基因产物(除了非常类似的同源物之外)，从而允许良好的安全特性。因此，抗体的特异性单一靶向功能被充分表征。
随着领域的进展，抗体功能已通过创造性的蛋白质工程方法得以增强，例如提供较高的亲和力、较长的半衰期和/或较佳的组织分布，以及组合小分子和大分子技术来实现对经由毒性有效载荷递送破坏细胞的提高的关注(例如抗体-药物偶联物)。另一种改善抗体功能的方法利用免疫球蛋白G(IgG)结构的二价结合，从而允许一个IgG分子结合两个抗原。实际上，在某些应用中，存在非对称抗体通过同时结合两个不同靶抗原来发挥有用功能的良好可能性。为了解决这种需求，已产生多种构建体以得到可结合两个不同抗原的单一分子，从而允许之前从未在自然界中见到的功能。此双特异性方法的一个例子是“blinatumumab”(MT103)，其结合分别在T细胞和B细胞上的CD3受体和CD19受体。细胞毒性T细胞与癌性B细胞的这种栓系允许对B细胞白血病进行有效的治疗。
然而，在双特异性抗体的构建、表达和产生方面仍存在相当大的技术难度。尽管双特异性抗体由于其同时结合两种不同抗原的能力而被视为有前景的治疗剂，但它们的实用性由于稳定性和制造复杂性方面的问题而受到限制。
各种形式的蛋白质工程已用于匹配异源重链，加上重链和轻链的适当成对匹配，以有效得到双特异性IgG。此外，各种双特异性抗体型式，包括四价体瘤、化学异源偶联物、使用选择的异源二聚化结构域的重组构建体和由两个最小抗原结合位点组成的最小尺寸的重组构建体。
然而，所有这些努力都存在困难。
因此，除了针对开发双特异性治疗性抗体的努力，仍然存在对开发可引起更有效并灵活地产生双特异性和多特异性抗体的更有效平台的极大需求，从而使此类治疗剂的发现与临床引入之间的时间线缩短并且实现具有多种特异性和/或效价的新型抗体型式的设计和产生。
这对于IgA抗体而言尤其如此，这是鉴于IgA涉及身体中对抗感染(包括细菌和病毒感染)的第一特异性免疫防御，以及二聚IgA抗体对粘膜免疫系统的体液部分的贡献。因此，双特异性和多特异性IgA抗体在治疗呼吸道病毒感染、多种胃肠道细菌感染以及癌症免疫疗法方面具有较大的潜力。因此，呼吸道合胞病毒(RSV)抗原的双特异性IgA抗体可用于治疗肺RSV感染，流感病毒抗原的双特异性IgA抗体可有效治疗流感，艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile，C.difficile)毒素A和B的双特异性IgA抗体可用于治疗大多数住院患者传染性腹泻的艰难梭状芽胞杆菌感染。
发明概述
在一个方面，本发明涉及多特异性结合分子，其包含两个结合单元和至少两种结合特异性，其中所述结合单元中的每个包含与结合靶的结合区偶联的两个IgA重链恒定区序列。
在一个实施方案中，多特异性结合分子为双特异性的。在一个特定实施方案中，在双特异性结合分子中，结合单元中的每个为单特异性的(AA，BB)，各自结合不同的结合靶(分别为A和B)。在另一个实施方案中，在双特异性结合分子中，两个结合单元中的一个为单特异性的(AA)而另一个结合单元为双特异性的，其中双特异性结合单元的结合特异性中的一个与单特异性结合单元(AB)的结合特异性相同。在另一个实施方案中，在双特异性结合分子中，结合单元中的每个为双特异性的，各自具有相同的两种结合特异性(AB，AB)。在另一个实施 方案中，在双特异性结合分子中，结合单元中的每个为双特异性的，并且结合分子具有三种结合特异性(AB，AC)。在另一个实施方案中，在双特异性结合分子中，结合单元中的每个为双特异性的，并且结合分子具有四种结合特异性(AB，CD)。
在一个具体实施方案中，多特异性结合分子为IgA抗体，其中结合区序列包含IgA重链可变区序列。
在另一个实施方案中，IgA抗体包含两个IgA结合单元，各自包含与IgA重链可变区序列融合的IgA重链恒定区序列，任选地还包含IgA J区。
在另一个实施方案中，IgA重链恒定区序列包含至少CA3结构域。
在另一个实施方案中，多特异性结合分子，例如双特异性IgA抗体，还包含与两个结合单元中的至少一个，优选两个结合单元中的每一个的IgA重链可变区序列缔合的至少一个IgA轻链可变区序列。
在一个实施方案中，如果两个结合单元中的至少一个为双特异性的，则例如通过钮入孔偶联(knobs-into-holes)和/或盐桥偶联，例如通过表1和表2中示出的一种或多种修饰来在两个不同的IgA重链恒定区之间产生非对称界面。
在另一个实施方案中，在包含至少一个轻链可变区的多特异性(例如双特异性)IgA抗体中，通过例如使用CrossMab技术(钮入孔偶联和盐桥偶联)中的一种或多种在重链和轻链之间产生非对称界面来使轻链可变区序列与其匹配重链可变区偶联。
在本发明的所有实施方案中，多特异性结合分子可偶联至毒素和/或化学治疗剂，其中所述偶联可通过融合和/或化学接头来实现。
在本发明的所有实施方案中，多特异性IgA抗体可为嵌合抗体或 人源化抗体或人抗体。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少约70％的本发明的多特异性结合分子。
在另外的具体实施方案中，本发明涉及一种二聚双特异性IgA结合分子，其中结合单元中的每个为单特异性的(AA，BB)，各自结合不同的结合靶(分别为A和B)。在另一个实施方案中，两个结合单元中的一个为单特异性的(AA)而另一个结合单元为双特异性的，其中双特异性结合单元的结合特异性中的一个与单特异性结合单元(AB)的结合特异性相同。在另一个实施方案中，结合单元中的每个为双特异性的，各自具有相同的两种结合特异性(AB，AB)。在另一个实施方案中，结合单元中的每个为双特异性的，并且结合分子具有三种结合特异性(AB，AC)。在另一个实施方案中，结合单元中的每个为双特异性的，并且结合分子具有四种结合特异性(AB，CD)。在所有实施方案中，结合分子优选地为二聚双特异性IgA(IgA1或IgA2)抗体，其优选地包含轻链，并且优选地包含J链。
在一个具体实施方案中，多特异性结合分子包含两个呈端到端(end-to-end)构型的IgA结合单元，各自包含与IgA重链可变区序列融合的IgA重链恒定区序列，任选地还包含IgA J区，例如包含SEQ ID NO：3的序列的J区。
在所有实施方案中，IgA重链恒定区序列优选地包含至少CA3结构域。
在所有实施方案中，本文的多特异性结合分子还包含与两个结合单元中的至少一个的IgA重链可变区序列缔合的至少一个IgA轻链可变区序列。
在另一个实施方案中，结合单元中的至少一个为双特异性的，并且其中在两个不同的IgA重链恒定区之间产生非对称界面。在所有实 施方案中，可通过钮入孔偶联和/或盐桥偶联，例如通过表1和表2中示出的一种或多种修饰来产生非对称界面。
在所有实施方案中，在多特异性结合分子中，可通过在轻链和重链之间产生非对称界面来使轻链可变区序列(如果存在)与其匹配重链可变区偶联。在所有实施方案中，可通过CrossMab技术钮入孔偶联和/或盐桥偶联来产生非对称界面。
在各个另外的实施方案中，多特异性结合分子可偶联至毒素或化学治疗剂，其中偶联可例如通过共价键合，例如通过融合或通过化学接头来实现。
在所有实施方案中，本发明的多特异性例如双特异性IgA抗体可为嵌合抗体或人源化抗体。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合呼吸道合胞病毒(RSV)的不同抗原的多特异性二聚IgA抗体。抗体优选地为双特异性的，并且包含针对RSV F的两个结合部分和针对RSV G的两个结合部分。在一个具体实施方案中，针对RSV G的结合部分包含SEQ ID NO：10的重链可变区序列和SEQ ID NO：11的轻链可变区。在另一个具体实施方案中，针对RSV F的结合部分包含SEQ ID NO：12的重链可变区序列和SEQ ID NO：13的轻链可变区序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合不同甲型流感病毒抗原的多特异性二聚IgA抗体。抗体优选地为双特异性的，包含针对每个甲型流感病毒抗原的两个结合部分。在一个具体实施方案中，第一甲型流感病毒抗原的结合部分包含SEQ ID NO：14的重链可变区序列和SEQ ID NO：15的轻链可变区序列。在另一个具体实施方案中，针对第二甲型流感病毒抗原的结合部分包含SEQ ID NO：16的第一可变区序列。在另一个具体实施方案中，针对第二甲型流感病毒抗原的结合部分包含SEQ ID NO：17的第二可变区序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)的不同抗原的多特异性二聚IgA抗体。抗体优选地为双特异性的。在一个优选的实施方案中，抗体包含艰难梭状芽胞杆菌的毒素A的两个结合部分及其毒素B的两个结合部分。在一个具体实施方案中，毒素A的结合部分包含SEQ ID NO：18的重链可变区序列。在另一个具体实施方案中，毒素A的结合部分包含SEQ ID NO：19的轻链可变区序列。在另一个具体实施方案中，毒素B的结合部分包含SEQ ID NO：20的第一可变区序列。在另一个具体实施方案中，毒素B的结合部分包含SEQ ID NO：21的第二可变区序列。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少约70％的本文中所述的任何多特异性IgA结合分子。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含有效量的本文中所述的任何多特异性IgA结合分子。在各实施方案中，药物组合物可用于治疗微生物感染，包括细菌、病毒和真菌感染例如艰难梭状芽胞杆菌感染、呼吸道病毒感染例如流感病毒感染或呼吸道合胞病毒(RSV)感染。
在另一方面，本发明涉及治疗方法以及用于制备治疗微生物感染(包括细菌、病毒和真菌感染，具体包括上文以及公开内容通篇所列出的任何及所有感染)的药物组合物的用途。
附图简述
图1示出IgA、二聚IgA和分泌性IgA(sIgA)的示意性结构。
图2A、2B和2C示出IgG1和IgA1以及IgA2重链恒定区的比对。人IgG1重链恒定区序列来自J00228(Takahashi等，Cell 29：671-679(1982)；SEQ ID NO：22)；人IgA1重链恒定区序列(UniProt P01876-IGHA1-HUMAN；SEQ ID NO：1)和编号来自PDB 2QEJ(Ramsland等，Proc Natl Acad Sci USA 104：15051-15056(2007))以及来 自IgA BUR(Putnam等，J Biol Chem 254：2865-2874(1979))；并且人IgA2重链恒定区序列编号对应于UniProt P01877-IGHA2_HUMAN(SEQ ID NO：2)。
图2A示出作为重链恒定区序列一部分的人IgG1、IgA1和IgA2Fc CG1/CA1重链恒定结构域的比对。
图2B示出作为重链恒定区序列一部分的人IgG1、IgA1和IgA2Fc CG2/CA2重链恒定结构域的比对。
图2C示出作为重链恒定区序列一部分的人IgG1、IgA1和IgA2Fc CG3/CA3重链恒定结构域的比对。
表1示出钮-孔和电荷引入位置中的IgA CA3结构域界面残基。具有#1组、钮、CA3#1突变的人IgA2的序列示为SEQ ID NO：4；具有#1组、孔、CA3#2突变的人IgA2的序列示为SEQ ID NO：5。
表2示出用于潜在电荷交换的IgA CA3结构域界面残基。
表3示出本申请中提及的多肽序列。
发明详述
I.定义
在对本发明进行更详细描述前，应当理解，本发明不限于所述的特定实施方案，因此，当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定实施方案，并非旨在进行限制，因为本发明的范围将只由所附权利要求书限定。
如果提供了值的范围，则应当理解，介于该范围上限与下限之间的每个居间值(直至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确指出)以及所述范围内的任何其他所述值或居间值均涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在涵盖于本发明内的较 小范围中，受所述范围内任何具体排除的限值的约束。
除非另有定义，本文所用技术和科学术语的与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)为本领域技术人员提供了本申请中所用许多术语的一般性指导。
本文提及的所有出版物以引用方式明确并入以公开和描述与所引述的出版物相关的方法和/或材料。
术语″抗原″是指可结合抗体或触发细胞免疫应答的实体或其片段。免疫原是指可在生物体、特别是动物、更特别是哺乳动物(包括人)中诱导免疫应答的抗原。术语抗原包括称为抗原决定簇或表位的区。
如本文所用，术语″免疫原性″是指诱导抗体产生和/或活化T细胞和/或其他针对免疫原抗原的反应性免疫细胞的物质。
当个体针响应于所施用的本发明的免疫原性组合物而产生足够的抗体、T细胞和其他反应性免疫细胞时发生免疫应答以减轻或缓解待治疗的病症。
如本文所用，术语免疫原性是指当对受者施用时，抗原诱导免疫应答(体液或细胞)的能力的量度。本发明涉及降低目标人嵌合抗体或人源化抗体的免疫原性的方法。
术语″抗体″包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、单链分子，以及抗体片段(例如，Fab，F(ab′)2和Fv)。术语″免疫球蛋白″(Ig)在本文可与″抗体″互换使用。基本的4链抗体单元为主要由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚糖蛋白。
就IgG而言，4链单元通常为约150,000道尔顿。每个L链通过 一个共价二硫键连接至H链，同时两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每个H链和L链还具有规律间隔的链内二硫桥键。每个H链在N末端具有可变结构域(VH)，接着α和γ链各自的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域(VL)，接着在其另一端具有恒定结构域。将VL与VH比对并且将CL与重链的第一恒定结构域(CH1)比对。据信特定的氨基酸残基形成轻链可变结构域与重链可变结构域之间的界面。VH和VL的配对一起形成单一抗原结合位点。
血清IgA为单体，但也可聚合。当呈分泌型式时，IgA包含2-5个由J链连接的基本4链单元，其可包括尾端(tail-piece)并且可与分泌组分缔合。与分泌组分(sIgA)缔合的尾端结构二聚IgA和分泌性IgA在图1中示出。IgA抗体可分成IgA1和IgA2子类，其明确地包括于“IgA”的定义内。
来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定结构域的氨基酸序列指定为两种明显不同类型(称为κ和λ)中的一者。
图2A-2C分别示出人IgG1 IgA1和IgA2 Fc CG1/CA1、CG2/CA2 和CG3/CA3恒定结构域的比对。在图中，人IgG1序列来自J00228(Takahashi N.等，Cell 29：671-679(1982))，IgG序列根据来自PDB 1OQO的PDB 1OQOβ链(s)和α-螺旋(h)分配进行编号。人IgA序列和编号来自PDB 2QEJ(Ramsland P.A.等，Proc Natl Acad Sci USA 104：15051-15056(2007)以及来自IgA BUR(Putnam W.F.等，J.Biol.Chem.254：2865-2874(1979))。人IgG1恒定区序列被指定为SEQ ID NO：19；IgA1恒定区序列示为SEQ ID NO：1并且人IgA2恒定区序列示为SEQ ID NO：2。在公开内容通篇中，根据这些比对来对氨基酸位置进行编号。
关于不同类别抗体的结构和性质的进一步细节，参见例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(编)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994年，第71页和第6章。
除非另行指出，否则术语“抗体”特别包括天然人和非人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1、IgA2、IgD和IgM抗体，包括天然存在的变体。
如本文所用，术语“IgA”抗体特别包括所有子类，即IgA1和IgA2抗体，包括二聚形式和多聚形式，具有或不具有分泌组分。在两个子类中，IgA2比IgA1更加稳定，因为IgA2的较短铰链区使得其可抵抗某些细菌蛋白酶。此较短的铰链解释了刚性和非平面结构，该结构有利于IgA2与细菌表面上的抗原的更佳的多价结合。就本发明的目的而言，IgA抗体可为IgA1或IgA2，优选地为二聚体，其中两个尾端优选地通过J链连接(参见图1，SEQ ID NO：3)。在本发明的IgA结合分子中，J链可为全长天然J链，但也可包含氨基酸改变，如取代、插入、缺失、截短，具体包括J链片段，只要J链保持功能即可。就本发明的目的而言，并入全长天然J链是优选的。
与修饰的J链结合的术语“功能性”意指J链保持天然J链例如天然人J链的主要功能，具体而言，实现IgA的有效聚合反应(二聚化)和此类聚合物(二聚体)与分泌组分(SC)/多聚(p)IgR的结合。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语″单克隆″指示抗体是从基本上均质的抗体群体获得的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(参见例如 美国专利号4,816,567)制备。还可使用例如Clackson等(1991)Nature 352：624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中所描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要其展现所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；和Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。
“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的抗体。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的高变区的残基经来诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种(供体抗体)的高变区的具有所需特异性、亲和力和能力的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基也由相应非人类残基置换。另外，人源化抗体可包含在接受者抗体中或在供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环且全部或基本全部的FR区为人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。更多细节参见Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
“物种依赖性抗体”是对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力比对来自第二哺乳动物物种的所述抗原的同源物的结合亲和力强的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”至人类抗原(即具有的结合亲和力(Kd)值不超过约1×10-7M，优选地不超过约1×10-8M并 且最优选地不超过约1×10-9M)，但对来自第二哺乳动物物种的所述抗原的同源物具有结合亲和力，结合亲和力比其对人类抗原的结合亲和力弱至少约50倍、或至少约500倍、或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是上文所定义的各种类型抗体中的任何一种，但优选地是人源化抗体或人类抗体。
如本文所用，“抗体突变体”或“抗体变体”是指参考抗体的氨基酸序列变体，其中参考抗体的一个或多个氨基酸残基已经过修饰。参考抗体可例如为天然抗体，但还可为天然抗体的已知变体。此类突变体必然与参考抗体具有小于100％序列同一性或相似性。在一个优选的实施方案中，抗体突变体将具有与参考抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％并且最优选地至少95％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。关于此序列的同一性或相似性在本文定义为在比对序列并且引入间隙(必要时)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中的氨基酸残基与参考抗体残基相同(即相同的残基)或相似(即基于共同侧链性质来自相同组的氨基酸残基)的百分比。N末端、C末端、或内部延伸、缺失、或插入到可变结构域外的抗体序列中都不应被认为影响序列同一性或相似性。
本文中的“分离的”抗体已被鉴定且与它在重组宿主细胞中的天然环境的组分分离和/或从所述天然环境的组分回收的抗体。它的天然环境的污染物组分是可干扰分子(例如抗体)的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质，以及生产的非所需副产物。因此，就双特异性或多特异性IgA抗体而言，非所需副产物包括单特异性结合单元(就包含AB结合单元的双特异性分子而言的AA和/或BB)，和包含所需数目的子单元的多聚体。在一个优选的实施方案中，双特异性或多特异性抗体将(1)被纯化至如通过SDS-PAGE或SEC-HPLC方法所测定，大于95重量％、或大于98重量％、或大于99重量％，(2)被纯化至足以通过使用氨基酸测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)通过 使用考马斯蓝(Coomassie blue)或优选地银染色，在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE被纯化至均质。通常，分离的双特异性结合分子(例如抗体)将通过至少一个纯化步骤来制备。
术语″特异性结合″或″特异性结合至″或″特异于″是指结合分子(诸如抗体)对靶标分子(例如具体多肽或具体多肽上的表位、肽或其他靶(例如糖蛋白靶))的结合，并且意指可测量地不同于非特异性相互作用(例如，非特异性相互作用可结合至牛血清白蛋白或酪蛋白)的结合。特异性结合可例如通过相较于抗体与对照分子的结合测定抗体与靶标分子的结合来测量。例如，特异性结合可通过与类似于标靶(例如，过量的未标记靶)的对照分子的竞争来测定。在这种情况下，如果标记靶与探针的结合受到过量未标记靶的竞争抑制，则指示为特异性结合。如本文所用，术语″特异性结合″或″特异性结合至″或″特异于″特定多肽或特定多肽靶上的表位可例如由对靶具有至少约200nM、或者至少约150nM、或者至少约100nM、或者至少约60nM、或者至少约50nM、或者至少约40nM、或者至少约30nM、或者至少约20nM、或者至少约10nM、或者至少约8nM、或者至少约6nM、或者至少约4nM、或者至少约2nM、或者至少约1nM或更大的Kd的分子来展现。在某些情况下，术语″特异性结合″是指分子结合至特定多肽或特定多肽上的表位，而不实质上结合至任何其他多肽或多肽表位的结合。
″结合亲和力″是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。例如，Kd可为约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更强。亲和力可通过本领域已知的常见方法包括本文所述的那些方法进行测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并往往容易解离，而高亲和力抗体则更快地结合抗原并往往保持结合更长的时间。测量结合亲和力的多种方法在本领域是已知的。
如本文所用，″Kd″或″Kd值″是指通过适用于抗体和靶对的技术，例如使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.)，在25℃下，用固定抗原CM5芯片在约10反应单位(RU)下，例如使用表面等离子体共振测定来测量的解离常数。
术语″偶联″和″偶联的″是指共价或非共价键合的任何和所有形式，且包括但不限于直接基因融合或化学融合、通过接头或交联剂偶联和非共价缔合，共价键合是优选的。
术语“多特异性IgA”是以最广泛的意义使用来指具有两种或更多种结合特异性IgA抗体。因此，术语“多特异性”包括“双特异性”，例如双特异性抗体或双特异性结合单元，包括IgA二聚体，其包含两个单特异性子单元，各自结合不同的抗原(AA，BB)，或包含两个双特异性子单元，每个子单元结合至两个不同的抗原(AB，AB)。
如本文所用，术语“结合单元”是指包含一对IgA重链恒定区多肽的分子，所述IgA重链恒定区多肽各自包含至少CA3结构域，并且各自偶联至结合靶例如靶抗原的结合区(抗体可变区)。在一个实施方案中，本发明的二聚IgA分子由两个单特异性结合单元组成，每个结合单元具有对于不同结合靶(AA，BB)的结合特异性。在另一个实施方案中，在本发明的二聚IgA分子中，两个结合单元中的至少一个具有两种不同结合特异性(即，为双特异性的，例如AA、A，B或AA、BC)。在另一个实施方案中，两个结合单元各自具有两种特异性，其可为相同的(AB，AB)或不同的(例如AC、CD或AB、AC)。
术语“双特异性IgA抗体结合单元”是以最广泛的意义使用并且特别涵盖与可变结构域序列(VH)的融合一对IgA抗体重链恒定区多肽(包含至CA3恒定结构域)，各可变结构域序列结合至不同靶，与抗体轻链可变结构域(VL)序列缔合或不缔合。在一个实施方案中，双特异性IgA抗体包含两个VHVL抗原结合区，各自能够结合至一个抗原上的不同表位或两个不同抗原上的表位。双特异性IgA抗体结合单元可 为单一物种的全长结合单元，或可为嵌合的或人源化的。
“全长IgA抗体重链”是在N末端向C末端方向上由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链恒定结构域1(CA1或Cα1)、抗体重链恒定结构域2(CM2或Cα2)和抗体重链恒定结构域3(CM3或Cα3)组成的多肽。根据本发明的双特异性或多特异性全长IgA抗体包含两个单体(结合单元)，这两个单体中的每一个为单特异性或双特异性，具有或不具有分泌组分。因此，本发明的多特异性IgA抗体可包括单特异性和双特异性结合单元，前提条件是所得IgA抗体具有至少两种结合特异性。全长抗体的重链或轻链的C末端表示重链或轻链的C末端处的最后一个氨基酸。全长抗体的重链或轻链的N末端表示重链或轻链的N末端处的第一个氨基酸。
如本文所用，术语″价″表示抗体中存在特定数目的结合位点。因此，术语″二价″、″三价″和″六价″分别表示存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。因此，如果在根据本发明的双特异性IgA抗体中每个结合单元为二价的，则双特异性IgA抗体将具有4个化合价。
术语″表位″包括能够特异结合至抗体的任何分子决定簇。术语″表位″包括能够特异结合至抗体的任何分子决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子的化学活性表面集合，且在某些实施方案中可具有特定三维结构特性和/或特定电荷特性。表位是抗原中由抗体结合的区。“结合区”是结合靶上由结合分子结合的区。
“多表位特异性”是指特异性结合至相同或不同靶上的两个或更多个不同表位的能力。″单特异性″是指结合仅一个表位的能力。根据一个实施方案，双特异性IgM抗体以至少10-7M或10-8M或更佳的亲和力结合至各表位。
术语“靶”或结合靶是以最广泛的意义使用并且特别包括多肽、核 酸、碳水化合物、脂质和具有当它们在自然界中存在时的生物学能的其他分子。“靶”可例如是细胞，其中双特异性结合单元靶向两个不同细胞类型、相同细胞类型的不同亚群(例如不同B细胞群)或单一细胞上的两个不同实体。
本发明抗体的“抗原结合位点”或“抗原结合区”通常含有六个互补决定区(CDR)，所述互补决定区以不同程度促成结合位点对抗原的亲和力。存在三个重链可变结构域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR和构架区(FR)的范围通过比较汇编的氨基酸序列数据库来确定，在数据库中所述区已根据序列间的变化性和/或抗体/抗原复合物的结构信息来定义。本发明范围内还包括由较少CDR组成(即，其中结合特异性通过三个、四个或五个CDR来确定)的功能性抗原结合位点。少于一组完整的6个CDR可足够结合至一些结合靶。因此，在一些情况下，单独VH或VL结构域的CDR将是足够的。此外，某些抗体可具有针对抗原的非CDR缔合结合位点。此类结合位点明确地包括在本定义内。
如文本所使用，术语“界面”用于指包含第一IgA重链恒定区中与第二IgA重链恒定区中一个或多个“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团)相互作用的那些“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团，诸如碳水化合物基团)的区。
术语“非对称界面”用于指在两个抗体链如第一IgA重链恒定区与第二IgA重链恒定区之间和/或IgA重链恒定区与其匹配轻链之间形成的界面(如在上文中定义)，其中第一链和第二链中的接触残基在设计上不同，其包含互补接触残基。非对称界面可通过钮/孔相互作用和/或盐桥偶联(电荷交换)和/或本领域已知的其他技术，例如通过用于将α重链偶联至其匹配轻链的CrossMab方法来产生。
″腔″或“孔”是指从第二多肽的界面凹入并且因此容纳第一多肽 的相邻界面上的相应突起(“钮”)的至少一个氨基酸侧链。腔(孔)可存在于原始界面中或可通过合成方式引入(例如通过改变编码界面的核酸)。通常，编码第二多肽的界面的核酸通过改变来编码腔。为了实现这一点，将编码第二多肽的界面中的至少一个″原始″氨基酸残基的核酸用编码至少一个″输入″氨基酸残基的DNA置换，″输入″氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。应理解，可存在超过一个原始残基和相应输入残基。经过置换的原始残基的数目的上限是第二多肽的界面中残基的总数。形成腔的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选地选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)和甘氨酸(G)。最优选的氨基酸残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸，最优选的是丙氨酸。在优选的实施方案中，形成突起的原始残基具有大的侧链体积，诸如酪氨酸(Y)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
″原始″氨基酸残基是由可具有比原始残基更小或更大侧链体积的″输入″残基置换的氨基酸残基。输入氨基酸残基可为天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选的是前者。
所谓″非天然存在的″氨基酸残基是指不由遗传密码编码，但能够共价结合多肽链中的相邻氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的例子为例如正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，例如Ellman等，Meth.Enzym.202：301-336(1991)中所述的氨基酸。为产生此类非天然存在的氨基酸残基，可使用Noren等Science 244：182(1989)和Ellman等(如上)的工序。简言之，该工序涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化抑制子tRNA，接着体外转录和翻译RNA。在某些实施方案中，本发明方法涉及置换IgM重链中的至少一个原始氨基酸残基，但可置换超过一个原始残基。通常，第一多肽或第二多肽的界面中只有总残基将包含经过置换的原始氨基酸残基。针对置换优选的原始残基是″包埋的″。所谓″包埋的″是指残基基本上难以接近溶剂。优选的输入残基不是半胱氨酸以防止可能的氧化或二硫键的错配。
突起″可定位″在腔中是指，分别第一多肽和第二多肽的界面上的突起和腔的空间位置以及突起和腔的大小使得突起可位于腔中而不显著扰乱界面处第一多肽和第二多肽的正常缔合。由于诸如Tyr、Phe和Trp的突起通常不从界面的轴垂直延伸并且具有优选的构象，因此突起与相应腔的对准依赖于基于三维结构(例如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的三维结构)建模突起/腔对。这可使用本领域广泛接受的技术，包括分子建模技术来实现。
所谓″原始核酸″是指编码所关注多肽的核酸，该核酸可经过″改变″(即遗传工程改造或突变)以编码突起或腔。原始核酸或起始核酸可为天然存在的核酸或可包含经受之前变化的核酸(例如人源化抗体片段)。所谓″改变″核酸是指通过插入、缺失或置换至少一个编码所关注氨基酸残基的密码子使原始核酸突变。通常，编码原始残基的密码子由编码输入残基的密码子置换。以这种方式遗传修饰DNA的技术已综述于Mutagenesis：a Practical Approach，M.J.McPherson，编，(IRL Press，Oxford，UK.(1991)中，并且包括例如定点诱变、盒诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。
突起或腔可通过合成手段″引入″到第一多肽或第二多肽的界面中，例如通过重组技术、体外肽合成、先前描述的用于引入非天然存在的氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的某种组合。因此，″引入″的突起或腔是″非天然存在的″或″非原生的″，这意指所述突起或腔不存在于自然界中或原始多肽(例如人源化单克隆抗体)中。
优选地，形成突起的输入氨基酸残基具有相对少量的″旋转异构体″(例如约3-6个)。″旋转异构体″是氨基酸侧链的在能量上有利的构象。各种氨基酸残基的旋转异构体的数目综述于Ponders和Richards，J.Mol.Biol.193：775-791(1987)中。
如本申请中使用的术语″宿主细胞″表示可被工程改造以产生根 据本发明的抗体的任何种类的细胞系统。一个实施方案中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用作宿主细胞。
如本文使用，表述″细胞″、″细胞系″和″细胞培养物″可互换使用，并且全部这些名称均包括子代。因此，词语″转化体″和″转化细胞″包括原代受试细胞以及源自其的培养物，而不考虑转移次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有子代的DNA含量可能不完全相同。包括了与经过筛选用于初始转化细胞具有相同功能或生物活性的变体子代。
当核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，该核酸为″有效连接″的。例如，序列前体或分泌前导序列的DNA在其表达为参与多肽的分泌的蛋白质前体的情况下有效连接于多肽的DNA；启动子或强化子在其影响编码序列的转录的情况下有效连接于所述编码序列；或核糖体结合位点在其位置促进翻译的情况下有效连接于编码序列。通常，″有效连接的″意指所连接的DNA序列是连续的，并且就分泌性前导序列而言是连续的且在阅读框中。然而，增强子不必是连续的。然而，增强子不必是连续的。连接是通过连接于适宜的限制位点处来实现。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“有效量”是指药物或药物组合可有效治疗受试者例如人类患者的目标疾病的量。药物的有效量可治愈和/或减轻目标疾病的严重程度和/或持续时间，并且可引起部分响应(PR)或完全响应(CR)。
详细描述
作为主要的抗体类别，存在于大多数哺乳动物粘膜分泌物中的免疫球蛋白A(IgA)代表对抗吸入和吸收病原体侵入的关键一线防御。IgA也以相当高的浓度存在于许多物种的血清中，IgA在其中作为介导破坏粘膜表面的病原体的清除的二线防御起作用。特异于IgA的 Fc区的受体FcαR是IgA效应子功能的关键介导物。
人IgA可具有两个不同的IgA重恒定区(Cα)基因，它们产生两种物质IgA1和IgA2。IgA1残基和IgA2残基之间的主要差异在于位于两个Fab臂之间的铰链区和Fc区。IgA1由于插入双重拉伸的氨基酸而具有延伸的铰链区，IgA2中不存在该铰链区。人IgA1重链恒定区的序列示为SEQ ID NO：1。人IgA2重链恒定区的序列示为SEQ ID NO：2。
IgA能够形成二聚体，其中各自包含两条重链和轻链的两个单体单元以端到端构型排布，所述端到端构型通过二硫桥键和并入J(接合)链来稳定。天然人J链的序列示为SEQ ID NO：3。粘膜部位产生的二聚IgA跨上皮细胞边界转运并且通过与多聚免疫球蛋白受体(pIgR)相互作用而转出进入分泌物中。在此过程中，pIgR被裂解并且称为分泌组分(SC)的主要片段开始共价附连至IgA二聚体。
本发明的多特异性IgA分子基于IgA抗体的二聚形式，其中可存在两对IgA重链序列，具有或不具有缔合的轻链序列。在一个优选的实施方案中，本文的IgA结合分子为双特异性的，由两个IgA(IgA1或IgA2)二聚体构成，包括J链。
本发明的多特异性IgA抗体可包括单特异性和双特异性结合单元，只要作为整体的分子具有至少两种结合特异性即可。
因此，在一个实施方案中，本文的IgA抗体为双特异性的并且由两个单特异性结合单元(AA，BB)组成，每个结合单元具有针对不同结合靶的结合特异性。
在另一个实施方案中，本文的IgA抗体包含两个双特异性结合单元，每个结合单元结合相同的两个结合靶(AB，AB)以形成双特异性IgA抗体。
在另一个实施方案中，本发明的IgA抗体中存在的一个结合单元 为单特异性的(AA)，而另一个结合单元为双特异性的(BC)，从而产生具有三种(A，B，C)结合特异性的IgA抗体。
在一个不同的实施方案中，每个结合单元为双特异性的，但一种特异性是重叠的(例如AB，AC)，从而产生具有三种(A，B，C)结合特异性的IgA抗体。
在另一个实施方案中，每个结合单元为双特异性的，具有不同结合特异性(AB，CD)。因此，IgA分子具有四种(A，B，C，D)结合特异性。
本文的IgA结合分子的结合单元包含至少CA3(Cα3)结构域并且另外包含CA2(Cα2)结构域。
在一个实施方案中，本发明的多特异性IgA抗体包含完整的IgA重(α)链恒定结构域，以及在两条重链之间产生非对称界面的一种或多种修饰。
在另一个实施方案中，本发明的多特异性IgA抗体包含完整天然J链。J链是产生SIgA的关键蛋白质，因为J链促进IgA的聚合并且据信其在这些聚合物中的存在是它们对SC/pIgR的亲和力所需的。本文的多特异性IgA抗体可包含J链片段，或以其他方式修饰的J链，只要所述片段或修饰的J链保持天然J链的功能，具体地实现IgA的有效聚合反应和此类聚合物与分泌组分(SC)/多聚(p)IgR的结合。J链的结构-功能关系的更多细节参见例如Johansen等，2001；J.Immunol.167(9)：5185-5192。
为了产生具有两条不同α重链的IgA分子(即其中结合单元中的至少一个为双特异性的)，必须找到用于将具有两种不同结合特异性的两条匹配α重链彼此偶联的解决方案。此外，如果需要轻链形成结合区，则必须找到将各重链与其匹配轻链偶联的解决方案以提供所需结合特异性。
偶联可通过某些残基之间的盐桥对电荷切换(也称为电荷交换或 电荷逆转)和/或通过在两条链之间产生钮-孔相互作用来实现。重链还可通过使用CrossMab技术来与它们的匹配轻链配对。为了实现最佳结果，还可将不同方法进行组合。
1.钮入孔技术
为了提高本发明五聚或六聚双特异性结合分子的产率，IgA重链恒定区(例如Cα3结构域)可通过用例如WO 96/027011，Ridgway，J.，B.等，Protein Eng 9(1996)617-621；和Merchant，A.M.等，Nat Biotechnol 16(1998)677-681中的若干实施例详细描述的″钮入孔″技术来改变。在这种方法中，两个IgA重链恒定结构域之间的相互作用表面经过改变以提高具有不同结合特异性的两条重链和/或重链与其匹配轻链之间的异源二聚化。两个重链结构域中的一个可″钮″，而另一个为″孔″。二硫桥键的引入使异源二聚体稳定(Merchant，A.M.等，Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell，S.等，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并且提高产率。同样，匹配重链和轻链可通过这种技术彼此偶联(Zhu，Z.；Presta，L.G.；Zapata，G.；Carter，P.Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation.Prot.Sci.6：781-788(1997))。
按照这种方法，在一条重链的Cα(例如Cα3)结构域的原始界面(其与双特异性IgA结合分子内另一条重链的相应结构域的原始界面相接)内，可将氨基酸残基用具有较大侧链体积的氨基酸残基置换，从而在界面内产生突起，该突起可定位于另一条IgA重链恒定区中相应结构域的界面内的腔中。同样，第二IgA重链可通过如下方式来改变：将具有第一IgA重链恒定区中相应结构域的界面内的氨基酸残基用具有较小侧链体积的氨基酸残基置换，从而在两个重链区之间的界面内产生孔(腔)。
钮入孔位置中的人IgA Cα3结构域界面残基在表1中示出。该表根据图4中所示的编号来标识图4中所示Cα3序列的指示位置处的天然残基，以及可用于产生钮入孔对的潜在突变。因此，例如，在 Cα3结构域中，位置352中的天然亮氨酸(L)残基可突变成甲硫氨酸(M)或位置368处的天然苏氨酸(T)残基可突变成色氨酸(W)以产生钮，其中钮突变可与针对氨基酸位置352、368和414所列举的孔的任何组合进行组合。
应强调，#1-6组中列举的钮入孔突变可如表1中所述用于各种组合中。此外，列举的突变可与其他钮入孔和/或电荷交换和/或电荷引入突变(例如表2所列举的电荷交换突变)进行组合。因此，表1中所述的钮入孔突变中的一个或多个可与表2中所列电荷交换突变中的一个或多个进行组合，如下文所讨论。因此，可选择表1的任何组并且将其以任何顺序或组合与表2的任何组混合。
2.盐桥对电荷切换(电荷交换)
相反电荷彼此吸引，相同电荷彼此排斥。氨基酸分子的电荷是pH依赖性的并且可以pK值来表征，测定游离氨基酸的α氨基(N)、α羧基(C)和侧链的pK值。当氨基酸是蛋白质或肽的一部分时，局部环境可改变侧链的pKa。
氨基酸分子的电荷性质还可以等电点(pI)来表征，其为分子的总电荷为中性时的pH。由于氨基酸在它们的侧链中彼此不同，因此pI反映出侧链pK的差异。
大部分氨基酸(15/20)具有接近于6的pI，所以将它们视为具有中性总电荷。Asp和Glu带负电荷，并且His、Lys、Arg带正电荷。
电荷交换或电荷引入突变的位置和氨基酸残基在表2中列出。如上文所讨论，一个或多个这些突变或突变组可与一组或多组钮入孔突变组合以在两条不同IgA重链之间和/或IgA重链与其匹配轻链之间提供所需非对称界面。
优选地，两个不同IgA重链恒定区之间的非对称界面由一条IgA重链中的至多8个，例如1-8个、或1-7个、或1-6个、或1-5个、 或1-4个、或1-3个、或1-2个突变，或两条IgA重链中的2-10个、或2-9个、或2-8个、或2-7个、或2-6个、或2-5个、或2-4个、或2-3个组合突变产生。
3.CrossMab技术
如上文所讨论，钮入孔技术或电荷交换实现抗体重链的异源二聚化。轻链和它们同源重链的正确缔合可通过将一半双特异性抗体结合单元的抗原结合片段(Fab)内的重链和轻链结构域进行交换来实现。交叉可以在IgA抗体的一半双特异性结合单元内完整VH-CH和VL-CL结构域的交叉、仅VH和VL结构域的交叉或CA和CL结构域的交叉的形式进行。这种“交叉”保留了抗原结合亲和力，但使两个臂不同，使得轻链错配可不再发生。就IgG抗体方面，更多细节参见例如Schaeffer等，(2011)Proc Natl Acad Sci USA 108(27)：11187-11192。
4.多特异性IgA结合分子的产生
具有所需突变(根据钮入孔、电荷交换和/或Cross-Mab技术)的双特异性IgA抗体结合单元的重链的编码序列可通过将适当核苷酸改变引入到抗体DNA中或通过核苷酸合成来产生。抗体可然后通过重组方式产生。
用于重组产生的方法在现有技术状态中广泛已知并且包括在原核和真核细胞中进行蛋白质表达，并随后分离抗体且通常纯化至药学上可接受的纯度。为在宿主细胞中表达抗体，通过标准方法将编码各修饰的重链和任选轻链的核酸插入表达载体中。在适当原核或真核宿主细胞(如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)中进行表达，且自细胞(溶解后的上清液或细胞)回收抗体。用于抗体的重组产生的一般方法描述于例如以下综述文章中：Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282； Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880。
双特异性抗体可通过常规免疫球蛋白纯化工序，例如蛋白A羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基中适当分离。
本发明方法将产生一种组合物，其包含双特异性IgA结合分子(例如双特异性IgA抗体)作为主要组分，以及制造过程的各种副产物，例如单特异性抗体、抗体片段、双特异性结合单元的单体、二聚体、三聚体和/或四聚体，而不是所需五聚或六聚结构。产生的组合物通常含有至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约92％、或至少约95％的所需五聚或六聚双特异性结合分子，例如抗体，其将通过本领域已知的方法进一步纯化以产生具有至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％、或至少约99.5％、或至少约99.9％的纯度的产物。
多特异性IgA抗体和其他多特异性如双特异性结合分子可以类似的方式产生。
5.多特异性IgA结合分子的应用
本发明的多特异性例如双特异性IgA结合分子，例如抗体，具有广泛的治疗和诊断应用。
IgA构成身体体液免疫系统的大组分以及粘膜表面处的保护功能，从而在维持粘膜免疫性方面发挥重要作用。呈二聚体以及更高级低聚物形式的IgA有效地跨细胞膜转运并释放到外分泌物中，其在所述外分泌物中形成对抗感染的第一特异性免疫防御。已证实IgA通过多种机制，包括直接杀伤、凝集、上皮附着和侵袭抑制、酶和毒素灭活、调理素作用和补体激活来对抗细菌感染。分泌物中的IgA还保护免于靶向粘膜表面的病毒性疾病。更多细节参见例如Mostow，K.E.， Annu.Rev.Immunol.1994，12：63-84.
因此，本发明的多特异性IgA抗体独特地适于治疗微生物，例如细菌、病毒或真菌感染。
微生物感染的例子包括但不限于细菌感染例如艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)感染或多重耐药的金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染、真菌感染例如白假丝酵母(Candida albicans)或曲霉属(Aspergillus)菌种引起的感染。病毒感染的例子包括但不限于呼吸道病毒例如流感病毒感染(flu)引起的感染以及呼吸道合胞病毒(RSV)引起的感染。
本发明的多特异性IgA结合分子例如多特异性IgA抗体，例如二聚双特异性IgA抗体可另外用于治疗由以下病毒所引起的感染：水痘-带状疱疹病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒、人类偏肺病毒、西尼罗病毒、引起严重急性呼吸器官综合征(SARS)的病毒等等。本发明的多特异性IgA结合分子例如多特异性IgA抗体，例如二聚双特异性IgA抗体还可用于针对以下细菌的菌株进行治疗：例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、肉毒梭状芽胞杆菌毒素(Clostridium botulinum toxin)、产气荚膜梭菌ε毒素鼠疫耶尔森氏菌(Clostridium perfringens epsilon toxin Yersinia Pestis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tulariensis)、贝氏考克斯菌(Coxiell burnetii)、布鲁氏菌(Brucella)菌种、葡萄球菌肠毒素B。
在一个优选的实施方案中，本发明的多特异性IgA结合分子例如多特异性IgA抗体，例如二聚双特异性IgA抗体用于治疗艰难梭状芽胞杆菌感染。艰难梭状芽胞杆菌为形成通常为人肠道微生物组的较小组分的革兰氏阳性细菌的孢子。然而，在正接受抗生素治疗老年人，婴儿或免疫受损的个体中，艰难梭状芽胞杆菌可爆发，从而导致严重的痢疾、结肠炎和死亡。艰难梭状芽胞杆菌感染的管理包括终止初始抗生素以及采用甲硝唑、万古霉素或非达霉素(fidaxomycin)进行的治疗。初始治疗通常是成功的，但患者具有对治疗的30％的不完全反应 率或感染复发率。因此，存在对有效治疗模式的很大需求。
艰难梭状芽胞杆菌的发病机理主要归因于肠道内的生物所分泌的两种毒素：毒素A和毒素B。这两种毒素在结构上类似并且两者均通过使维持细胞骨架结构所需的关键GTP酶去糖基化而引起细胞变圆、脱离和细胞死亡。单克隆抗体已被鉴定可强效中和毒素A和毒素B，并且这些抗体已在动物模型和人临床试验中显示出治疗艰难梭状芽胞杆菌感染的前景。在动物研究中，中和毒素A或毒素B的个别单克隆抗体不能抑制艰难梭状芽胞杆菌毒素介导的毒性，而两种抗体的混合物却提供显著的保护。特异性靶向毒素A和毒素B的双特异性IgA抗体由于独特的IgA特性而将提供大量的额外益处。
在一个优选的实施方案中，本发明的多特异性IgA结合分子例如多特异性IgA抗体，例如二聚双特异性IgA抗体用于治疗人呼吸道合胞病毒(RSV)感染。RSV是一种遍在的呼吸道病毒，其引起严重的下呼吸道疾病并且是婴儿和老年人的肺炎和细支气管炎的导因。呼吸道合胞病毒(RSV)病毒粒子表面上的两种主要糖蛋白(附着糖蛋白(G)和融合糖蛋白(F))控制着感染的初始阶段。G靶向呼吸道的纤毛细胞，F导致病毒粒子膜与靶细胞膜融合。蛋白F的抗体描述于例如美国专利号5,824,307和号6,818,216中。蛋白G的抗体描述于例如美国专利号7,736,648中。本发明的双特异性IgA二聚体由于独特的IgA特性(包括其被有效递送至肺的能力)而提供大量的额外益处。
在另一个优选的实施方案中，本发明的多特异性IgA结合分子例如多特异性IgA抗体，例如二聚双特异性IgA抗体用于治疗流感病毒引起的感染。流行性感冒感染(也称为“流行性感冒”或“流感”)是人和家畜中最常见的疾病中的一个。三种类型的流感病毒(甲型、乙型和丙型)引起疾病。流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)表现出广泛的抗原变异性，并且是分类流感亚型的基础。HA出现于病毒粒子包膜表面上并且牵涉病毒进入细胞中。HA是一种最初合成为约560个氨基酸的单一多肽链(HA0)的跨膜蛋白，其随后蛋白 水解裂解形成两个子单元HA1和HA2。子单元通过二硫键保持连接，并且该蛋白以同三聚体的形式出现在病毒粒子和受感染细胞的表面上。RA Lamb，RM Krug，Orthomyxoviridae：the viruses and their replication.(参见，DM Knipe，PM Howley，DE Griffin(编)等，FieldsVirology，第4版，Lippincott Williams&Wilkins，2001，第1487-1531页)。HA1形成HA的球状头区，并且负责HA亚型之间的大部分抗原变异性。HA1与宿主细胞上的病毒受体相互作用。HA2形成病毒刺突(spike)的纤维茎，并且认为其牵涉病毒粒子包膜和宿主细胞膜之间的融合。茎区在各种不同HA亚型之间更加保守。(参见例如Wilson等，Nature，289：366-373，1981；Skehel等，Ann.Rev.Biochem.，69：531-569，2000)。
在人类中循环的流感病毒的抗原变异性每年都在变化，因此需要每年接种疫苗，季度疫苗基于对给定年份的最流行亚型的预测进行准备。遗憾的是，预测并非总是正确的。此外，流感病毒的大流行菌株周期性地从动物宿主跃入人群中。此类大流行菌株(如H5N1)可引起不经谨慎控制便会传播的严重疾病。因此，本领域仍需要另外的疗法来控制流感病毒疾病和传播。
作为可供选择的方法，可预防流行性感冒感染或通过病毒中和来治疗已存在的感染的基于抗体的疗法处于开发中。保护免于流感病毒感染的大多数中和抗体的主要靶标是HA的球状头区，但此区的抗原变异性形成了挑战。近来，已鉴定出识别甲型流感病毒和乙型流感病毒的HA的保守茎区的广谱中和抗体，但临床研究的功效还未被证实。(参见例如WO2008/028946、WO 2010/130636和US20140120113A1)。已证实IgA主链的多克隆混合物具有增强的对抗流感病毒的中和效能(He，W.等，J.Virol.Doi：10.1128/JVI.03099-14，被接受的手稿2015年1月14日线上发布)。
本发明的双特异性和多特异性IgA结合分子例如多特异性或双特异性二聚抗体可被设计成靶向各种流感病毒和流感病毒亚型上的 不同抗原，并因此提供管理流感的有效手段。
本发明的多特异性IgA结合分子例如IgA抗体具有许多其他广范围的应用。
在一个实施方案中，本文的多特异性IgA结合分子例如抗体结合同一可溶性靶(例如VEGF、TNFα或IL6)上的两个或更多个位点。目的是可例如拮抗蛋白质上的多个位点和/或增加对给定靶的亲合力。
在另一个实施方案中，本文的多特异性IgA结合分子例如抗体结合同一细胞表面(受体)靶(例如EGFR或HER2(ErbB2))上的两个或更多个位点。因此，例如，双特异性结合分子可同时靶向HER2分子上的4D5表位和2C4表位。此方法可增加生物效能和/或对给定靶的亲和力。
在另一个实施方案中，本发明的多特异性IgA结合分子例如抗体结合两个或更多个不同的可溶性靶(球状蛋白质或肽)，例如TNFα和IL6、VEGFα和Ang2或两个细胞因子。此方法可导致对特定途径的更完全的阻断；所谓细胞因子风暴(cytokine storm)的阻断或协调酶及其底物，例如因子IXa和因子X。
在另一个实施方案中，本文的多特异性IgA结合分子例如抗体可结合一个或多个可溶性靶以及一个或多个细胞表面受体靶例如血管生成因子和新生血管特异性受体。此方法的目的也是增加特定部位和组织处的递送和阻断。
在另一个实施方案中，本文的多特异性IgA结合分子例如抗体被设计成结合两个或更多个不同的细胞表面受体靶，例如HER2(ErbB2)和HER3(ErbB3)。这可导致增强的特异性和选择性和/或对给定途径的更完全的阻断。
本发明的多特异性IgA结合分子例如抗体还可被设计成结合一个可溶性靶或细胞表面受体靶以及长停留时间靶，例如TNFα和血清 白蛋白，或VEGF和血清白蛋白。与不具有白蛋白特异性的结合分子相比，预期这些分子具有较长的循环半衰期。
在另一个实施方案中，本文的多特异性IgA结合分子例如抗体可结合一个或多个可溶性靶以及一个或多个基质蛋白或底物，例如VEGFα和透明质酸。所得双特异性结合分子由于其在眼内空间中的长停留时间而可用于例如眼病症(例如年龄相关性黄斑退化(AMD))的抗血管生成疗法。
双特异性IgA结合分子，例如结合一个可溶性靶或受体靶，加上转运蛋白受体(即转铁蛋白受体)的抗体，例如成胶质细胞瘤中发现并且与抗转铁蛋白特异性组合的抗EGFRvIII(外显子III缺失的突变体形式)可用于跨血脑屏障的抗体递送中。
其他多特异性IgA结合分子例如抗体可结合两个或更多个不同细胞类型例如B细胞和T细胞。此类抗体可用于例如B细胞和/或T细胞相关的疾病或病症例如类风湿性关节炎(RA)或非霍奇金淋巴瘤。
在所有实施方案中，优选使用二聚双特异性IgA抗体。
包含有效量的多特异性IgA-结合分子例如多特异性IgA抗体，例如双特异性二聚IgA抗体(与靶抗原缔合)以用于治疗任何和所有上述以及相关病症的药物组合物连同用于治疗此类病症的方法和用途明确地在本发明的范围之内。
6.组合物、药物组合物和治疗方法
在一个方面，本发明涉及包含本文纯化多特异性IgA抗体的组合物。所述组合物通常包含至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约92％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％的所需双特异性IgA结合分子，例如抗体。所述组合物可为药物组合物，其中双特异性结合分子例如抗体与至少一种药学上可接受的载体混合。
在各实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的有效量的多特异性IgA结合分子例如多特异性IgA抗体例如二聚双特异性IgA抗体以用于治疗上文列举的病症或疾病。在所有实施方案中，优选使用二聚双特异性IgA抗体。
本发明的药物组合物可以利用本领域中已知的多种方法施用。如本领域技术人员所了解，施药途径和/或模式将根据目标疾病或病症和所需结果而变化。为通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能必需将所述化合物用防止其失活的材料涂布或者所述化合物与防止其失活的物质共同施用。例如，化合物可以在适当载体(例如脂质体)或稀释剂中施用于受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药学载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域已知的。
组合物也可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和/或分散剂。可以通过灭菌程序或通过包含各种抗细菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止存在微生物。也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，通过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射用药物剂型的延长的吸收。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能变化，以获得可有效实现对特定患者、组合物和施用方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史、以及医学领域中熟知的其他因素。
组合物必须是无菌的，其流动性必须达到能使组合物可通过注射器递药的程度。除了水，载体优选为等渗缓冲盐水溶液。
本文提及的所有出版物全文以引用方式明确并入公开内容中以公开和描述与这些出版物所被引用的方法和/或材料有关的方法和/或材料。。本文引用的出版物是引用其在本申请的提交日期之前的公开内容。不应将本文的任何内容解释为承认本发明人没有资格由于更早的优先日期或在先的发明日期而先于这些出版物。另外，实际公开日可不同于所示日期并且需要独立验证。
提供以下实施例、序列表和图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所述权利要求书中阐述。应理解，可在阐述的工序中进行修改，而不背离本发明的精神。
实施例1
1.具有设计突变的DNA构建体的产生
a.材料和方法：产生具有设计突变的DNA构建体
b.DNA构建体合成
具有设计突变的所有DNA构建体都由商业供应商(Genescript)，利用在两端处用于亚克隆到相应表达载体中的相容性限制位点来合成。
c.构建表达载体
将合成DNA构建体以1μg/ml重悬于Tris-EDTA缓冲液中。使DNA(1μg)经受酶消化并且将合成基因通过电泳与载体质粒DNA分离。将消化的DNA通过标准分子生物学技术连接至预消化质粒DNA(α链为pFUSEss-CHIg-hA1；κ链为pFUSE2ss-CLIg-hk Invivogen)。将连接的DNA转化成胜任细菌并且接种在具有多种选择性抗生素的 LB板上。挑选若干细菌菌落，并且通过标准分子生物学技术进行DNA制备。将制备的DNA通过测序进行验证。仅DNA序列与设计DNA 100％匹配的细菌菌落用于质粒DNA制备并且随后用于细胞转染。
d.不同大小的α链
为了证实两条不同α链(A和B)能够彼此偶联，在不同分子量和配体特异性的情况下，构建两条不同的α链。
e.A链由与人α链的CA1融合的嵌合OKT3(抗-CD3)VH区的全长α链构成：
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
(SEQ ID NO：23)
A链具有约55kD的分子量并能够结合CD3的可溶性ε链(10977-H08H，Sino Biological)或T细胞。
f.B链具有与人α链的(Gly4Ser)-铰链-CA2-CA3融合的cMyc标签：
GEQKLISEEDLGGGGSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVG点EALPLAFTQNTIDRLAGKFTHVNVSVVMAEVDGTCY
(SEQ ID NO：24)
B链具有约28kD的分子量并且能够结抗myc单克隆抗体9E4或其他抗myc抗体。
g.可供选择B链具有与人α链的铰链-CA2融合的CrossMabVH-CL(VH+CL)利妥昔单抗(抗-CD20)的全长α链：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGATYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
(SEQ ID NO：25)
B链具有约55kD的分子量并能够结合CD20阳性B细胞。
h.不同轻链偶联
i.天然嵌合OKT3κ链
QIVLTQSPAIMSASPGKKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRAVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTRQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO：26)
j.利妥昔单抗的CrossMabVL-CH1
QIVLSQSPAILSASFGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASSVPVRFSGSGSGTSYSITISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAITSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPESC
(SEQ ID NO：27)
轻链具有约25kD的分子量。
k.不同表达载体的不同选择标记物
在用于共转染的不同表达载体上使用不同选择标记物。使用多种药物来选择细胞以适应与IgA产生相关的所有必要的表达载体。使用标准分子生物学技术来将特定DNA克隆到这些载体中。
1.α链利用博莱霉素选择(ant-zn-1，Invivogen)。博莱霉素以100μg/ml的浓度使用。在用包含Sh ble基因的质粒转染之后，然后将细胞以100μg/ml孵育在包含博菜霉素的Opti-CHO培养基中以选择稳定的转染子。
m.κ链利用杀稻瘟菌素S选择(ant-b1-1，Invivogen)。杀稻瘟菌素S以10μg/ml的浓度使用。在用包含bsr基因的质粒转染之后，然后将细胞以10μg/ml孵育在包含杀稻瘟菌素S的Opti-CHO培养基中以选择稳定的转染子。
n.蛋白质表达、纯化和表征
o.转染
p.通过将在等摩尔比或可变摩尔比(5至10倍差异)下的若干不同表达载体共转染到哺乳动物细胞(例如293细胞或CHO细胞)中来制备IgA。将表达载体的DNA与PEI混合，然后添加到CHO-S细胞中。根据确立的技术来用CHO-S细胞进行PEI转染(参见 "Biotechnology and Bioengineering，第87卷，553-545″)。
q.蛋白质纯化
r.Jacalin-Agarose(目录号gel-jac-5，Invivogen)
根据制造商的方案通过亲和力Jacalin-Agarose来纯化来自转染CHO-S细胞上清液的IgA蛋白。
s.Capto-L(目录号17-5478-01，GE Healthcare)
根据制造商的方案通过Capto-L亲和基质来纯化CHO-S细胞上清液中包含κ链的转染IgA蛋白。
t.凝胶电泳
u.非还原SDS PAGE
v.非还原SDS PAGE根据大小分离天然IgA和它的突变体形式。由同二聚重链(AA)与它们的轻链构成的IgA产生大约160kDa分子量的蛋白质条带。由较短型式的同二聚重链(BB)例如与cMyc-标记-IgA-Fc构成的同二聚IgA产生显著较低分子量的蛋白质条带。由异二聚重链(AB)构成的IgA产生具有大于BB并且小于AA的分子量的多种蛋白质。
w.在装载到凝胶上之前，在25℃下将NuPage LDS样品缓冲液(Life Technologies)添加到IgA蛋白样品中持续30分钟。NativePage Novex 3-12％Bis-Tris凝胶(Life Technologies)与Novex Tris-乙酸盐SDS运行缓冲液(Life Technologies)一起使用。进行跑胶，直到前侧染料到达凝胶底部。
x.还原SDS-PAGE
y.将NuPage LDS样品缓冲液(Life Technologies)和NuPage还原 剂二硫苏糖醇(Life Technologies)添加到IgA蛋白样品中并且在装载于NuPage Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Life Technologies，目录号NP0322)上之前加热到80℃持续10分钟。NuPage MES SDS运行缓冲液(Life Technologies，目录号NP0002)用于凝胶电泳。进行跑胶，直到前侧染料到达凝胶底部。
z.在电泳完成之后，从设备除去凝胶并且使用胶体蓝染色(Life Technologies，手册#LC6025)对凝胶染色
aa.凝胶条带定量
将蛋白质凝胶干燥，然后使用图像扫描仪进行数字化。将凝胶图像用图像J工序处理，并且特定条带中蛋白质的量可使用凝胶定量功能来确定
bb.质谱分析，以鉴定/定量双特异性制剂中的各种mAb。
cc.使用差示扫描量热法(DSC)的稳定性分析
dd.双特异性功能分析
ee.两种配体的ELISA分析
通过ELISA分析利用可溶性CD3ε蛋白捕集和抗cMyc(9E10)检测来测定具有OKT3(链A)和cMyc肽(链B)的IgA。将可溶性CD3ε蛋白以2mg/ml于150mM NaHCO3中涂布在ELISA板上，接着用PBS中的3％BSA阻断。在25℃下将包含转染IgA-OKT3-cMyc的上清液(100μl)添加到阻断ELISA板持续4小时。在用PBS洗涤之后，在室温下将9E10抗体添加到ELISA板持续2小时。在用PBS洗涤之后，添加抗小鼠IgG-HRP。在添加HRP底物之后通过在OD 450的情况下读数来检测双特异性IgA的存在。
ff.靶结合的FACS分析
通过使抗体结合至T细胞系(Peer，阳性细胞系)和B细胞系(Daudi，阴性对照细胞系)来确认IgA-OKT3-cMyc结合至T细胞。在洗涤之后，将罗丹明标记的9E10添加到细胞悬浮液中。通过具有或不具有CD3抗原的阳性和阴性对照细胞的MFI来检测细胞靶结合。
gg.双特异性结合的荧光显微术测定
通过所设计CD3xCD20双特异性IgA使两个群体CD3阳性细胞和CD20阳性细胞结合在一起的能力验证其双特异性结合，所述细胞通过在各细胞型上的两种不同活体染料进行预标记。例如：
hh.绿色荧光胞质液活体染料(CellTraceTM钙黄绿素绿AM)，其标记CD3阳性细胞系(Jurkat)
ii.红色荧光胞质液活体染料(CellTraceTM钙黄绿素红色-橙色，AM)，其标记CD20阳性B细胞系(Daudi)
实施例2
双特异性二聚IgA向肺的运输
双特异性二聚IgA递送至肺的能力可通过多种方法来研究。例如，向3-4周龄雌性BALB/c小鼠组静脉注射剂量高达50mg/kg的PBS中的人IgG1/κ或二聚IgA/κ。或者，可使用人或小鼠抗-CD20抗体。注射后4小时，采集血样并进行处理以获得血浆。临处死之前，对小鼠进行麻醉并放血。在去除颈部淋巴结后，通过使气管暴露并用200μL PBS洗涤上气管和鼻腔来采集鼻洗液样品。通过将导管插入气管中并将肺用1mL PBS洗涤三次(总共3mL，通过离心来澄清)来采集支气管肺泡灌洗(BAL)样品。将蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟以1mM的浓度添加到采集后的所有样品中，并将所有样品在-20℃或低于-20℃下储存直至分析。
每个样品中的测试抗体的浓度通过ELISA进行测定。简而言之， 将已用小鼠Ig交叉吸收的山羊多克隆抗人κ轻链抗体涂布于96孔ELISA板的孔上并在4C下过夜，然后用含有3％牛血清白蛋白的PBS阻断未反应位点。或者，板可以涂覆有人CD20的可溶形式。洗涤后，将系列稀释的测试样品和标准品施加到板上并在37C下温育1小时。然后将板用含有0.05％吐温20的PBS洗涤，并用碱性磷酸酶偶联的重链特异性山羊抗人IgG或IgA(其已针对小鼠Ig进行交叉吸收)进行温育。对于小鼠测试抗体，将使用固定抗CD20进行捕集并且将使用碱性磷酸酶偶联的重链特异性山羊抗小鼠IgG或IgA进行检测。将板用磷酸对硝基苯酯显色并在405nm的光密度(OD)下读数。基于来自IgA和IgG的标准曲线的结果，计算每个样品中的测试抗体的浓度。
实施例3
RSV F和G抗原的双特异性二聚IgA抗体
人呼吸道合胞病毒(RSV)是一种遍在的呼吸道病毒，其引起严重的下呼吸道疾病并且是婴儿和老年人的肺炎和细支气管炎的导因。呼吸道合胞病毒(RSV)病毒粒子表面上的两种主要糖蛋白(附着糖蛋白(G)和融合糖蛋白(F))控制着感染的初始阶段。G靶向呼吸道的纤毛细胞，F导致病毒粒子膜与靶细胞膜融合。
根据本实施例，独特的二聚IgA分子经工程化，其由具有可结合RSV F蛋白的序列的一条重链和轻链组合以及具有可结合RSV G蛋白的序列的另一条重链和轻链组合组成。这些抗体的表达(使用实施例1中描述的技术)将产生具有针对RSV F的两个结合部分和针对RSV G的两个结合部分的单一IgA分子。
双特异性人抗-RSV IgA2抗体的RSV G-结合部分的重链可变区序列示为SEQ ID NO：10，其包含表1中列出的#1组、钮、CA3#1突变(加粗)。RSV G蛋白-结合部分的人κ轻链可变区序列示为SEQ ID NO：11。
与工程改造IgA2抗体重链(SEQ ID NO：8)融合的双特异性抗体的抗-RSV F蛋白-结合部分的可变轻区序列的CrossMab型式示为SEQ ID NO：12，其包含#1组、孔、CA3#2、CA1突变。与工程改造κ恒定轻结构域(SEQ ID NO：9)融合的抗-RSV F蛋白-结合部分的可变重区序列的CrossMab型式示为SEQ ID NO：13。
具有针对RSV G和RSV F抗原的结合特异性的双特异性抗-RSV IgA抗体的结合基本上如实施例1.ee中所述进行评价，不同的是根据特异性抗原和双特异性抗体的性质对试剂进行改性。例如，在评价结合F-蛋白和G-蛋白的RSV双特异性IgA抗体的ELISA中，将RSV F-蛋白(或其适当片段)固定并用于ELISA捕集，而将可溶性生物素酰化RSV G-蛋白(或其适当片段)用于检测。或者，G-蛋白可用于捕集，可溶性生物素酰化F-蛋白可用于检测。可通过在添加抗生物素蛋白-HRP和底物之后于OD 450nm下读数来检测双特异性IgA的存在。
RSV的培养和体外RSV病毒中和测定可利用多种标准技术(如在US7736648中所述的那些)进行。简而言之，HEp2细胞以2×105个细胞/孔接种在12孔板中。第二天，培养基中产生系列稀释度的抗体。在存在兔补体血清的情况下将大约200PFU/孔的RSV添加到抗体中并且在室温下温育一小时。将抗体-病毒混合物以200uL/孔添加到HEp2细胞中并且在室温下温育2小时以允许感染。此感染期之后，去除培养基并将含有1％甲基纤维素的培养基添加到所有孔中。将板在35℃下温育6天，此后，将细胞固定并染色以按如下进行斑块数目测定：从细胞层吸取甲基纤维素，然后在室温下将细胞在100％甲醇中固定30分钟。然后将板用PBS中的5％的乳洗涤3次。将一次抗体以在PBS+5％乳蛋白中1∶500的稀释度(山羊抗-RSV多克隆抗体(Chemicon Cat#AB1128))进行添加并保持1小时。将板用PBS中的5％乳再洗涤3次。将二次抗体以在PBS中的5％乳蛋白中1∶500的稀释度(ImmunoPure兔抗-山羊抗体IgG(H+L)过氧化物酶偶联)(ThermoScientific，Cat#31402))进行添加并保持1小时。将板用1x PBS洗涤3次。通过添加1步氯代奈酚底物(1-Step Chloronaphthol substrate) (Pierce，Cat#34012)(200uL/孔，保持10分钟)来使斑块可视化。将板用水冲洗并使其风干。通过人工检测来对每个孔中的斑块进行计数。
体内RSV中和研究可以使用多种标准技术进行，例如在Collarini等2009年(J.Immunol.183_6338-6345)中描述的小鼠的预防研究。简而言之，向6至8周龄的雌性BALB/c小鼠组以高达50mg/kg的剂量注射待测试的抗体(双特异性IgA抗体以及阳性对照和阴性对照)。二十四小时后(预防模型)，用106 PFU的RSV长菌株病毒对小鼠进行鼻内感染。或者，可在病毒攻击(治疗模型)后多达数天施用抗体。5天后，处死动物并切除它们的肺。在第5天通过如下方式对病毒载量进行定量：(i)PFU/克肺组织，或(ii)使用Trizol提取试剂盒(Invitrogen)从肺组织中提取RNA后进行定量PCR。病毒N-基因拷贝数以组织样品的肌动蛋白mRNA含量的百分比表示。对照动物既不接受任何抗-RSV mAb也不接受非免疫同种型对照mAb。
实施例4
流行性感冒抗原的双特异性二聚IgA抗体
流行性感冒感染(也称为“流行性感冒”或“流感”)是人和家畜中最常见的疾病之一。三种类型的流感病毒(甲型、乙型和丙型)引起疾病。流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)表现出广泛的抗原变异性，并且是分类流感亚型的基础。HA出现于病毒粒子包膜表面上并且牵涉病毒进入细胞中。HA是一种最初合成为约560个氨基酸的单一多肽链(HA0)的跨膜蛋白，其随后蛋白水解裂解形成两个子单元HA1和HA2。子单元通过二硫键保持连接，并且该蛋白以同三聚体的形式出现在病毒粒子和受感染细胞的表面上。RA Lamb，RM Krug，Orthomyxoviridae：the viruses and their replication.(参见，DM Knipe，PM Howley，DE Griffin(编)等，Fields Virology，第4版，Lippincott Williams&Wilkins，2001，第1487-1531页)。HA1形成HA的球状头区，并且负责HA亚型之间的大部分抗原变异性。HA1与宿 主细胞上的病毒受体相互作用。HA2形成病毒刺突(spike)的纤维茎，并且认为其牵涉病毒粒子包膜和宿主细胞膜之间的融合。
根据本实施例，独特的二聚IgA分子经工程化，其由具有可结合甲型流感病毒的HA子单元上的两个不同抗原的序列的一条重链和轻链组合组成。这些抗体的表达(使用实施例1中描述的技术)将产生对每个HA表位具有两个结合部分的单一IgA分子。或者，可构建针对HA和NA上的表位的双特异性IgA抗体。
双特异性人抗-流感IgA抗体的第一HA结合部分的重链可变区序列示为SEQ ID NO：14，其包含表1中列出的#1组、钮、CA3#1突变(加粗)。与重链可变区缔合的人κ轻链可变区序列示为SEQ ID NO：15。
与工程改造IgA2抗体重链(SEQ ID NO：8)融合的双特异性抗体的第二HA结合部分的可变轻区序列的CrossMab型式示为SEQ ID NO：16，其包含#1组、孔、CA3#2，CA1突变。与工程改造κ恒定轻结构域(SEQ ID NO：9)融合的第二HA结合部分的可变重区序列的CrossMab型式示为SEQ ID NO：17
双特异性抗-流感IgA抗体与两个抗原的结合基本上如实施例1中所述进行评价，不同的是根据特异性抗原和双特异性的性质对试剂进行改性。例如，在评价结合HA和NA的流感双特异性IgA的ELISA中，将一种流感蛋白或肽固定并用于ELISA捕集，而将不同流感蛋白或肽进行生物素酰化并用于检测。可通过在添加抗生物素蛋白-HRP和底物之后于OD 450nm下读数来检测双特异性IgA的存在。
流感病毒的培养和体外流感病毒中和测定可利用多种标准技术(如在Throsby等2008(PLoS One 3，e3942)中所述的那些)进行。简而言之，在37℃下，将MDCK细胞维持在补有10％胎牛血清(FCS)和1％青霉素-链霉素(PS)的最小必需培养基(MEM)中。在实验当天，将在96孔板中的MDCK细胞用PBS洗涤两次，并在补有1％FCS、1％ PS和1mg/ml TPCK胰蛋白酶(对于非H5病毒)的MEM中温育。将两倍系列稀释的抗体与等体积的病毒种菌混合，接着在37℃下温育2小时。温育后，将混合物(～100TCID50)添加到汇合的MDCK单层中。将细胞培养72小时，然后检查细胞病变效应(CPE)。将CPE与阳性对照(病毒接种细胞)和阴性对照(假性接种细胞)进行比较。在单独细胞中不存在CPE被定义为保护。
体内保护研究可利用多种标准技术(如在Throsby等.2008(PLoS One 3，e3942)中所述的那些)进行。简而言之，向7周龄雌性BALB/c小鼠组以高达50mg/kg(预防模型)的剂量注射待测试的抗体(双特异性IgA抗体以及阳性对照和阴性对照)。二十四小时后，用致死剂量的病毒(通常是10倍到25倍的LD 50)对小鼠进行鼻内接种并观察21天。或者，可在病毒攻击(治疗模型)后多达数天施用抗体。将临床征象用评分体系评分(0＝无临床征象：1＝皮毛粗糙；2＝皮毛粗糙、反应性较差、在处理期间被动状态：3＝皮毛粗糙、蜷缩、呼吸困难、在处理期间被动状态；4＝皮毛粗糙、蜷缩、呼吸困难、反应迟钝)并进行记录，在存活时。还可对体重进行监测。对照动物通常在攻击后的12至15天内死亡。
实施例5
艰难梭状芽胞杆菌毒素A和B的双特异性二聚IgA抗体。
如早先所述，艰难梭状芽胞杆菌为形成通常为人肠道微生物组的较小组分的革兰氏阳性细菌的孢子。然而，在正接受抗生素治疗老年人，婴儿或免疫受损的个体中，艰难梭状芽胞杆菌可爆发，从而导致严重的痢疾、结肠炎和死亡。艰难梭状芽胞杆菌感染的管理包括终止初始抗生素以及采用甲硝唑、万古霉素或非达霉素进行的治疗。初始治疗通常是成功的，但患者具有对治疗的30％的不完全反应率或感染复发率。因此，存在对有效治疗模式的很大需求。
根据本实施例，独特的二聚IgA分子经工程化，其由具有可结合 并中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A的序列的一条重链和轻链组合以及具有可结合并中和毒素B的另一条重链和轻链组合组成。使用本文所述的技术的这些抗体的表达(参见实施例1)将导致将产生具有针对毒素A的两个结合部分和针对毒素B的两个结合部分的单一IgA分子，该分子在全身施用时可有效地运输至艰难梭状芽胞杆菌感染的肠部位。这种独特的IgA分子将对艰难梭状芽胞杆菌复发性感染的治疗具有改善的剂量反应或将提高患有危及生命的艰难梭状芽胞杆菌疾病的患者的初始治疗的有效性。
双特异性人抗-艰难梭状芽胞杆菌抗体的毒素A结合部分的重链可变区序列示为SEQ ID NO：18，其包含表1中列出的#1组、钮、CA3#1突变(加粗)。与重链可变区缔合的人κ轻链可变区序列示为SEQ ID NO：19。
与工程改造IgA2抗体重链(SEQ ID NO：8)融合的双特异性抗体的毒素B结合部分的可变轻区序列的CrossMab型式示为SEQ ID NO：20，其包含#1组、孔、CA3#2，CA1突变。与工程改造κ恒定轻结构域(SEQ ID NO：9)融合的毒素B结合部分的可变重区序列的CrossMab型式示为SEQ ID NO：21。
双特异性抗-艰难梭状芽胞杆菌IgA抗体与两个抗原的结合基本上如实施例1.ee中所述进行评价，不同的是根据特异性抗原和双特异性的性质对试剂进行改性。例如，在评价结合艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B的双特异性IgA的ELISA中，将毒素A(或其适当片段)固定并用于ELISA捕集，而将生物素酰化毒素B(或其适当片段)用于检测。或者，毒素B可用于捕集，可溶性生物素酰化毒素A可用于检测。可通过在添加抗生物素蛋白-HRP和底物之后于OD 450nm下读数来检测双特异性IgA的存在。
体外艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B毒素中和测定可利用多种标准技术(如在Babcock等2006(Infect.Immun.74，6339-6347)描述 的仓鼠保护模型。简而言之，在存在各种浓度的毒素A或毒素B的情况下温育IMR-90肺成纤维细胞，细胞圆缩(round up)并且失去对细胞培养盘的附着。通过对细胞的目视检查来确定细胞病变效应(CPE)，并且基于目视检查的结果来确定0-4的CPE评分。为了测试中和，将IMR-90细胞以1×105个细胞/孔接种在96孔微量滴定板中并在37℃和5％CO2下温育12小时。将毒素A(6ng/ml)或毒素B(20pg/ml)与各种浓度的抗体一起温育1小时，添加到细胞培养物中，并且在37℃下继续温育18小时。然后用显微镜确定细胞病变效应并且评分为0(0％圆化细胞)、1(25％圆化细胞)、2(50％圆化细胞)、3(75％圆化细胞)或4(100％圆化细胞)，并将结果相对于抗体剂量以CPE绘图。从滴定曲线，可计算抗体的IC50。
艰难梭状芽胞杆菌的培养和体内艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B中和测定可利用多种标准技术进行，例如Babcock等2006(Infect.Immun.74，6339-6347)描述的仓鼠保护模型。为保护免于艰难梭状芽胞杆菌诱发的致死性，向叙利亚金黄地鼠(70g至80g)组腹膜内给予总共四剂量的抗体(双特异性IgA抗体以及对照阳性和阴性对照)，持续4天，在施用艰难梭状芽胞杆菌孢子前3天开始。在艰难梭状芽胞杆菌孢子攻击前24小时腹膜内施用克林霉素(10mg/kg)，然后使用标准小动物喂食针经口胃(orogastrically)用140 B1孢子攻击仓鼠。对照动物通常在攻击后的72小时内死亡。