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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610163957.7 (22)申请日 2016.03.22 (71)申请人 李晨露 地址 325007 浙江省温州市鹿城区昆仑路 72号 (72)发明人 李晨露 (51)Int.Cl. C07D 311/76(2006.01) A61K 31/427(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (54)发明名称 一种氨曲南的药物组合物及其医药用途 (57)摘要 本发明公开了一种氨曲南的药物组合物及 其医药用途， 本发明。
2、提供的氨曲南的药物组合物 中含有氨曲南和一种从细辛的干燥根茎中分离 得到的结构新颖的天然产物化合物()， 氨曲南 和该天然产物单独作用时， 防治缺血再灌注损伤 效果一般； 二者联合作用时， 防治缺血再灌注损 伤效果显著提高， 可以开发成防治心肌缺血再灌 注损伤的药物。 本发明与现有技术相比具有突出 的实质性特点和显著的进步。 权利要求书1页 说明书6页 CN 105820150 A 2016.08.03 CN 105820150 A 1.一种具有下述结构式的化合物()， 2.一种氨曲南的药物组合物， 其特征在于： 包括氨曲南、 如权利要求1所述的化合物() 和药学上可以接受的载体。 3.权利要。
3、求1所述的化合物()的制备方法， 其特征在于， 包含以下操作步骤： (a)将细 辛的干燥根茎粉碎， 用7080乙醇热回流提取， 合并提取液， 浓缩至无醇味， 依次用石油 醚、 乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物； (b)步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂， 先用8乙醇洗脱10个柱体积， 再用 70乙醇洗脱12个柱体积， 收集70洗脱液， 减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b) 中70乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离， 依次用体积比为40:1、 20:1、 10:1和5:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组。
4、分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比 为8:1、 5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基 硅烷键合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为75的甲醇水溶液等度洗脱， 收集814个柱 体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物()。 4.根据权利要求3所述的化合物()的制备方法， 其特征在于： 步骤(a)用75乙醇热回 流提取， 合并提取液。 5.根据权利要求3所述的化合物()的制备方法， 其特征在于： 所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。 6.权利要求1所述的化合物()在制备防治缺血再灌注损伤的药物中的应用。 7.权利要求2所述的氨曲南的药物组合。
5、物在制备防治缺血再灌注损伤的药物中的应 用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105820150 A 2 一种氨曲南的药物组合物及其医药用途 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及氨曲南的新用途， 具体涉及一种氨曲南的药物组 合物及其医药用途。 背景技术 0002 氨曲南为一种单酰胺环类的新型 内酰胺抗生素。 抗菌谱主要包括革兰阴性菌， 诸如大肠杆菌、 克雷白杆菌、 沙雷杆菌、 奇异变形杆菌、 吲哚阳性变形杆菌、 枸橼酸杆菌、 流 感嗜血杆菌、 绿脓杆菌及其他假单胞菌、 某些肠杆菌属、 淋球菌等。 与头孢他定、 庆大霉素相 比、 对产气杆菌、 阴沟肠杆菌的作用高于头孢他定， 但低。
6、于庆大霉素； 对绿脓杆菌的作用低 于头孢他定、 与庆大霉素相近； 对其他病原菌的作用都较两者为高(对某些菌则与头孢他定 接近)。 对于质粒传导的 内酰胺酶， 该品较第3代头孢菌素为稳定。 口服不吸收， 肌注1g,1 小时血浓度达峰值， 约为46 g/ml,半衰期约1.8小时； 静注1g， 5分钟血药浓度约为125 /ml， 1小时约为49 g/ml， 半衰期约1.6小时。 体内分布较广， 在脓疱液、 心包液、 胸水、 滑膜液、 胆 汁、 骨组织、 肾、 肺、 皮肤等部位有较高浓度； 在前列腺、 子宫肌肉、 支气管分泌物中也有一定 浓度、 在脑脊液中浓度低。 主要由尿排泄， 在尿中原形药物的浓度。
7、甚高。 在乳汁中的浓度甚 低， 为血药浓度的1,平均0.3 g/ml,一日间母乳内总量约0.3mg。 该品为第一个应用于临 床的单环 内酰胺类抗生素。 主要作用于需氧或兼性厌氧革兰阴性细菌和绿脓杆菌。 脑膜炎 球菌、 淋球菌、 摩拉卡他菌和流感杆菌的不产或产 内酰胺酶菌株均对该品敏感。 90以上 的大肠秆菌、 肺炎杆菌、 变形杆菌属、 普罗菲登菌属、 摩根菌属、 聚团肠杆菌、 沙门菌属、 志贺 菌属、 枸椽酸菌属可为lmg/L或以下的该品所抑制， 其对绿脓杆菌的MIC50和MIC90分别为 3.1mg/L和2.5mg/L。 但不动杆菌属、 假单胞菌属(除绿脓杆菌外)、 革兰阳性菌或厌氧菌均耐 。
8、药。 氨曲南主要与细菌的青霉素结合蛋白3(PBP3)结合而抑制细胞壁的合成， 使细胞迅速溶 解死亡。 该品对细菌产生的质粒介导和大部分染色体介导的 内酰胺酶高度稳定， 因而许多 耐药菌对该品仍呈敏感。 0003 目前， 尚未见氨曲南及其药物组合物与缺血再灌注损伤的相关报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种氨曲南的药物组合物， 该药物组合物中含有氨曲南和 一种从细辛中分离得到的结构新颖的天然产物， 氨曲南和该天然产物可以协同防治缺血再 灌注损伤。 0005 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 0006 一种具有下述结构式的化合物()， 说明书 1/6 页 3 CN 1。
9、05820150 A 3 0007 0008 一种氨曲南的药物组合物， 包括氨曲南、 如上所述的化合物()和药学上可以接受 的载体。 0009 如上所述的化合物()的制备方法， 包含以下操作步骤： (a)将细辛的干燥根茎粉 碎， 用7080乙醇热回流提取， 合并提取液， 浓缩至无醇味， 依次用石油醚、 乙酸乙酯和水 饱和的正丁醇萃取， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a) 中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂， 先用8乙醇洗脱10个柱体积， 再用70乙醇洗脱12个柱 体积， 收集70洗脱液， 减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中70乙醇洗脱浓缩 物用正。
10、相硅胶分离， 依次用体积比为40:1、 20:1、 10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到 4个组分； (d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为8:1、 5:1和2:1的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶 分离， 用体积百分浓度为75的甲醇水溶液等度洗脱， 收集814个柱体积洗脱液， 洗脱液 减压浓缩得到化合物()。 0010 进一步地， 步骤(a)用75乙醇热回流提取， 合并提取液。 0011 进一步地， 所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。 0012 如上所述的化合物()在制备防治缺血再灌注损伤的药物中。
11、的应用。 0013 如上所述的氨曲南的药物组合物在制备防治缺血再灌注损伤的药物中的应用。 0014 本发明的优点： 0015 本发明提供的氨曲南的药物组合物中含有氨曲南和一种从细辛中分离得到的结 构新颖的天然产物， 氨曲南和该天然产物单独作用时， 防治缺血再灌注损伤效果一般； 二者 联合作用时， 防治缺血再灌注损伤效果显著提高， 可以开发成防治缺血再灌注损伤的药物。 本发明与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。 具体实施方式 0016 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明保护范 围。 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解。
12、， 可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 0017 实施例1： 化合物()分离制备及结构确证 0018 试剂来源： 乙醇、 石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇、 二氯甲烷为分析纯， 购自上海凌峰化 说明书 2/6 页 4 CN 105820150 A 4 学试剂有限公司， 甲醇， 分析纯， 购自江苏汉邦化学试剂有限公司。 0019 分离方法： (a)将细辛的干燥根茎(5kg)粉碎， 用75乙醇热回流提取(20L3次)， 合并提取液， 浓缩至无醇味(4L)， 依次用石油醚(4L3次)、 乙酸乙酯(4L3次)和水饱和的 正丁醇(4L3次)萃取， 分别得到石。
13、油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤 (a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂除杂， 先用8乙醇洗脱10个柱体积， 再用70乙醇 洗脱12个柱体积， 收集70洗脱液， 减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中70乙 醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离， 依次用体积比为40:1(8个柱体积)、 20:1(8个柱体积)、 10:1 (8个柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组 分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为8:1(8个柱体积)、 5:1(10个柱体积)和2:1(5个 柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分。
14、； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为75的甲醇水溶液等度洗脱， 收集814个柱体积洗脱 液， 洗脱液减压浓缩得到化合物()(198mg， HPLC归一化纯度大于98)。 0020 结构确证： HR-ESI-MS显示M+H+为m/z457.2442， 结合核磁特征可得分子式为 C27H36O6， 不饱和度为10。 核磁共振氢谱数据 H(ppm， CD3OD， 500MHz)： H-1(6.76， br， s)， H-4 (5.96， s)， H-5(5.38， s)， H-8(3.25， m)， H-9(1.12， s)， H-10(2.67， d，。
15、 J11.4Hz)， H-11 (2.08， m)， H-12(2.83， dd， J11.9， 5.3Hz)， H-12(3.11， dd， J11.9， 7.7Hz)， H-14(2.69， dd， J12.4， 13.3Hz)， H-14(2.92， dd， J12.4， 3.6Hz)， H-16(1.02， d， J6.7Hz)， H-18 (2.81， m)， H-18(3.27， dd， J17.1， 1.9Hz)， H-20(2.64， m)， H-21(1.34， m)， H-21(1.67， m)， H-22(1.20， m)， H-22(1.26， m)， H-23(1.2。
16、4， m， 2H)， H-24(1.24， m， 2H)， H-25(1.25， m， 2H)， H- 26(0.88， t， J7.2Hz)， H-27(1.21， d， J7.2Hz)； 核磁共振碳谱数据 C(ppm， CD3OD， 125MHz)： 143.3(CH， 1-C)， 156.6(C， 3-C)， 110.8(CH， 4-C)， 144.2(C， 4a-C)， 107.3(CH， 5-C)， 199.8(C， 6-C)， 73.4(C， 7-C)， 40.5(CH， 8-C)， 120.3(C， 8a-C)， 21.2(CH3， 9-C)， 62.1(CH， 10- C)， 。
17、16.1(CH， 11-C)， 48.6(CH2， 12-C)， 193.5(C， 13-C)， 59.8(CH2， 14-C)， 207.1(C， 15-C)， 20.3(CH3， 16-C)， 51.1(CH2， 18-C)， 206.3(C， 19-C)， 46.3(CH， 20-C)， 32.7(CH2， 21-C)， 27.6 (CH2， 22-C)， 29.0(CH2， 23-C)， 31.3(CH2， 24-C)， 22.2(CH2， 25-C)， 14.2(CH3， 26-C)， 16.6 (CH3， 27-C)。 红外波谱中的1710cm-1吸收带与UV谱中的224nm吸收带。
18、表明该化合物含有 , - 不饱和羰基结构。 13C-NMR、 DEPT和HSQC谱中显示有27个碳信号， 包括四个甲基， 八个亚甲基， 七个次甲基(三个烯烃碳)， 以及八个季碳(一个连氧碳， 四个羰基碳和三个烯烃碳)， 以上功 能结构再结合不饱和数表明该化合物为三环结构。 1H-NMR谱结合HSQC谱显示四个甲基质子 信号H1.12(3H， s)、 1.02(3H， d， J6.5Hz)、 0.88(3H， t， J7.2Hz)、 1.21(3H， d， J 7.2Hz)， 八组亚甲基质子信号 H3.11(1H， dd， J11.9， 7.7Hz)与2.83(1H， dd， J11.9， 5.。
19、3Hz)、 2.92(1H， dd， J12.4， 3.6Hz)与2.69(1H， dd， J12.4， 13.3Hz)、 3.27(1H， dd， J 17.1， 1.9Hz)与2.81(1H， m)、 1.77(1H， m)与1.34(1H， m)、 1.26(1H， m)与1.20(1H， m)、 1.24 (2H， m)、 1.24(2H， m)、 1.25(2H， m)， 三个烯烃质子信号 H6.81(1H， s)、 6.05(1H， s)、 5.38 (1H， s)， 四个次甲基质子信号 H3.25(1H， m)、 2.67(1H， d， J11.4Hz)、 2.08(1H， m)。
20、， 2.64 (1H， m)。 1H-1HCOSY谱中存在H-10/H-11/H2-12、 H3-27/H-20/H2-21/H2-22/H2-23/H2-24/H2- 25/H3-26相关信号， 结合HMBC谱中显示的H-1与C-4a、 C-8a和C-8， H-4与C-3、 C-4a和C-8a， H- 5与C-4、 C-4a和C-6， H-10与C-3、 C-11、 C-15和C-16， H2-12与C-11、 C-13、 C-14和C-16， H2-14与 C-12、 C-13和C-15， H2-18与C-8和C-19， H-20与C-19相关信号， 通过上述NMR谱中的相关信息 说明书 。
21、3/6 页 5 CN 105820150 A 5 可以构建该化合物的连接方式， 并且根据上述波谱数据确认该化合为Cohaerin衍生物。 综 合氢谱、 碳谱、 HMBC谱和ROESY谱， 以及文献关于相关类型核磁数据， 可基本确定该化合物如 下所示， 立体构型进一步通过ECD试验确定， 理论值与实验值基本一致。 0021 该化合物化学结构式及碳原子编号如下： 0022 0023 实施例2： 对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用 0024 1、 材料与方法 0025 1.1动物 0026SD大鼠， SPF级， 体质量(25020)g， 各半。 上海斯莱克实验动物公司提供， 动物 许可证号： SC。
22、XK(沪)2007-000， 批号： 20120510。 0027 1.2药物与试剂 0028 通心络胶囊由以岭药业提供。 使用时加生理盐水稀释成所需浓度。 水合氯醛， 国药 集团化学试剂有限公司。 乳酸脱氢酶(LDH)、 丙二醛(MDA)、 超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均 由南京建成生物工程研究所提供。 0029 1.3分组及给药 0030 60只大鼠随机分为假手术组、 模型组、 氨曲南组、 化合物()组、 氨曲南与化合物 ()组合物组、 阳性对照组， 每组10只。 0031 阳性对照组： 通心络胶囊100mgkg-1d-1； 0032 氨曲南组： 氨曲南20mgkg-1d-1； 0033。
23、 化合物()组： 化合物()20mgkg-1d-1； 0034 氨曲南与化合物()组合物组： 氨曲南20mgkg-1d-1+化合物()20mgkg-1d -1； 0035 手术前灌胃(ig)给药， 连续10d。 假手术组和模型组分别灌胃(ig)给予相应容积的 生理盐水。 0036 1.4大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型的制备 0037 实验前禁食12h， 10水合氯醛ip麻醉(3.5mlkg-1)大鼠， 仰卧位固定， 气管插管， 接人工呼吸机(呼吸频率： 70次/min， 潮气量： 20ml， 呼吸时比11)。 开胸结扎冠脉左前降支， 胸骨左侧2mm切开皮肤， 钝性分离肌肉见肋骨， 在三四肋间， 。
24、用拉钩拉开胸壁， 小心剪开心包 膜， 在左心耳下缘34mm进针， 进针深约1.5mm， 斜向右上方肺动脉圆锥方向进针， 针距约3 说明书 4/6 页 6 CN 105820150 A 6 4mm。 稳定1min后， 收紧结扎线， 30min后轻拉松结线， 扩开血管再灌注， 缝合。 假手术组仅 分离前室间支， 不结扎。 0038 1.5大鼠血标本和组织标本采集 0039 大鼠心肌缺血再灌注24h后， 颈总动脉取血， 并迅速取出心脏， 去除心脏内的淤血， 中性福尔马林固定或加生理盐水匀浆， 离心取上清， 分装， 置-20冰箱冻存备用。 血液离心 取上清， 分装， 置-20冰箱冻存备用。 全部实验结。
25、束后严格按试剂盒操作测LDH、 SOD、 MDA等 生化指标。 0040 1.6免疫组织化学检测 0041 每组中取2只大鼠心脏用10福尔马林固定， 经脱水、 石蜡包埋， 常规切片4 m。 采 用快速免疫组化方法， 即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒， 检测大鼠心肌中 caspase-3蛋白表达的水平， 采用PBS来代替一抗作为阴性对照。 0042 1.7统计学方法 0043 应用SPSS18.0统计软件进行统计学处理， 计量资料用xs表示， 多组间比较采用 方差分析， 组间比较用t检验。 0044 2、 实验结果 0045 2.1对心肌缺血/再灌注大鼠生化指标的影响 0046 与。
26、假手术组比较， 模型组大鼠血清中LDH活力和MDA含量明显升高， SOD含量明显降 低， 差异有显著性(P0.01)。 与模型组比较， 氨曲南组、 化合物()组均能明显减少LDH活 力， 提高SOD含量， 降低MDA含量， 差异有显著性(P0.05)； 与模型组比较， 氨曲南与化合物 ()组合物组能明显减少LDH活力， 提高SOD含量， 降低MDA含量， 差异有显著性(P0.01)， 接 近于阳性对照组。 结果见表1。 0047 表1心肌缺血/再灌注大鼠血清生化指标的变化 0048 组别LDH(U/L)SOD(kU/L)MDA( M/L) 假手术组70002105.5 模型对照组8400150。
27、7.8 阳性对照组72002006 氨曲南组76001856.5 化合物()组75001806.4 氨曲南与化合物()组合物组70002055.9 0049 2.2对心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞caspase-3蛋白的影响 0050 Caspase-3蛋白心肌细胞质黄色或棕黄色为阳性细胞表达。 与假手术组比较， 模型 组caspase-3蛋白表达明显增加(P0.01)， 氨曲南组、 化合物()组均能明显降低心肌细胞 caspase-3蛋白表达(P0 .05)， 氨曲南与化合物()组合物组能明显降低心肌细胞 caspase-3蛋白表达(P0.01)； 提示氨曲南和化合物()可抑制缺血/再灌注诱导。
28、的大鼠心 肌细胞caspase-3蛋白表达， 减少心肌细胞凋亡； 而且氨曲南和化合物()之间还存在协同 作用。 结果见表2。 0051 表2心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞caspase-3蛋白的表达情况 说明书 5/6 页 7 CN 105820150 A 7 0052 组别IOD/area 假手术组0.8 模型对照组1.4 阳性对照组1.05 氨曲南组0.8 化合物()组0.75 氨曲南与化合物()组合物组0.55 0053 以上结果表明， 氨曲南、 化合物()均可以防治心肌缺血/再灌注大鼠心肌细胞损 伤， 而且氨曲南和化合物()之间还存在明显的协同作用， 可以协同防治心肌缺血/再灌注 大鼠心肌细胞损伤。 0054 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明的保护 范围。 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。 说明书 6/6 页 8 CN 105820150 A 8 。