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1、(10)申请公布号 CN 103667502 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667502 A (21)申请号 201310736720.X (22)申请日 2013.12.27 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 天津国际旅行卫生保健中心 地址 300045 天津市塘沽区新港 2 号路 2-1126 (72)发明人 关淳 王馨 祁军 左锋 刘寅 (54) 发明名称 一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检 测试剂 (57) 摘要 本发明涉及一种新型等温环介导副溶血弧菌 核酸标记检测试剂， 该试剂通过对等温环介导扩。
2、 增所使用的引物组中的前内引物标记一种抗原同 时对后内引物标记另一种抗原， 能够在扩增副溶 血弧菌特异性目的基因的同时对该基因进行标 记。标记后使用配套的胶体金试纸能够快速检测 目的基因的扩增产物， 从而检测副溶血弧菌。本 发明的检测试剂操作简单快速、 特异性强、 灵敏度 高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103667502 A CN 103667502 A 1/1 页 2 1. 一种新型等温环介导。
3、副溶血弧菌核酸标记检测试剂， 其特征在于， 所述的检测试剂 包括副溶血弧菌等温环介导核酸标记扩增反应液， 该反应液中含有前外引物、 后外引物、 前 促环引物、 后促环引物、 5 端标记生物素基团的前内引物、 5 端标记异硫氰酸荧光素基团的 后内引物、 dNTPs 溶液、 具有链置换活性的 DNA 聚合酶 （如 ：Bst DNA 聚合酶） 、 MgSO4、 无菌双 蒸水以及环介导等温扩增的缓冲液。 2. 根据权利要求 1 所述的一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂， 其特征 在于， 使用的前外引物、 后外引物、 前促环引物、 后促环引物、 前内引物和后内引物的序列如 下 ： SEQ ID。
4、 NO:1 5 - AGCTACTCGAAAGATGATCC -3 , SEQ ID NO:2 5 - GGTTGTATGAGAAGCGATTG -3 , SEQ ID NO:3 5 - ACCAGTAGCCGTCAATG -3 , SEQ ID NO:4 5 - TTAGATTTGGCGAACGAGA -3 , SEQ ID NO:5 5 - ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT -3 , SEQ ID NO:6 5 - ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG -3 。 3. 根据权利要求 1 所述的。
5、一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂， 其特征 在于， 使用该试剂， 能够在扩增目的基因的同时将扩增产物 DNA 上标记生物素基团和异硫 氰酸荧光素基团。 4. 根据权利要求 1 所述的一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂， 其特 征在于， 将提取得到的待测 DNA 溶液作为扩增模板加入到装有核酸恒温标记扩增反应液的 PCR 管中， 在 60 65下扩增反应 30 60 分钟， 优选 60下扩增反应 60 分钟。 5. 一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂所使用的胶体金检测试纸， 其特 征在于， 胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗生物素抗体的金颗粒， 胶体金检测试纸 。
6、层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体， 胶体金检测试纸层析膜的质控线上包被 有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。 6. 根据权利要求 4 所述的一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂所使用 的胶体金检测试纸， 其特征在于， 将待测标记扩增产物滴加在检测试纸的样品垫上， 当检测 线和质控线都呈现红色时表明 DNA 样品中含有副溶血弧菌的待测基因， 当检测线无色而质 控线呈现红色表明 DNA 样品中不含有副溶血弧菌的待测基因。 权 利 要 求 书 CN 103667502 A 2 1/5 页 3 一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂 技术领域 0001 本发明涉及一种应。
7、用于核酸检测的试剂， 具体讲， 涉及一种新型等温环介导副溶 血弧菌核酸标记检测试剂。 0002 背景技术 0003 副溶血弧菌是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。副溶血性弧菌食物中毒也 称嗜盐菌食物中毒， 是进食含有该菌的食物所致， 主要来自海产品或盐腌渍品， 常见者为蟹 类、 乌贼、 海蜇、 鱼、 黄泥螺等， 其次为蛋品、 肉类或蔬菜。临床上以急性起病、 腹痛、 呕吐、 腹 泻及水样便为主要症状。副溶血弧菌的快速检测对其引起的疾病防控具有重要的意义。 0004 环介导等温扩增技术 （Loop-mediated isothermal amplification） 是一种新型 的核酸检测技术， 。
8、其特点是针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异引物， 在链置换 DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下， 在 60 65恒温扩增， 60 分钟左右即可实现 109 1010倍的核酸扩增， 具有操作简单、 特异性强等特点。 该技术的优势除了高特异性、 高灵敏度 外， 操作十分简单， 对仪器设备要求低， 一台水浴锅或恒温箱就能实现反应。其扩增结果可 以通过凝胶电泳、 肉眼观察焦磷酸镁沉淀或加入荧光物质后的颜色改变来做初步的判断。 但该方法也有一定的缺陷， 主要表现在扩增结果检测环节， 凝胶电泳检测容易造成污染， 焦 磷酸镁沉淀检测灵敏度较差， 荧光物质变色方法受到荧光。
9、物质的成本或者需要使用检测仪 器的限制。因此， 在产物检测环节的限制， 影响了该技术的推广应用。 0005 本发明公开了一种新型的等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂。 该方法具有 本发明的相对传统环介导等温核酸扩增技术具有灵敏度更高， 结果判断更准确的优势。 发明内容 0006 本发明的首要发明目的在于提供一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测 试剂。 0007 本发明的第二发明目的在于提供一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测 方法。 0008 本发明的第三发明目的在于提供这种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测 试剂盒的应用。 0009 发明的主要技术方案为 ： 1. 等温环介导副溶。
10、血弧菌核酸标记检测试剂的组成为 ： （1） 核酸恒温标记扩增反应试剂 核酸恒温扩增反应液中含有前外引物、 后外引物、 前促环引物、 后促环引物、 前内引物、 后内引物、 dNTPs 溶液、 具有链置换活性的 DNA 聚合酶 （如 ：Bst DNA 聚合酶等） 、 MgSO4、 无菌 双蒸水以及环介导等温扩增的缓冲液。 0010 环介导等温扩增的缓冲液的最终工作浓度为 20 mM Tris-HCl、 10 mMKCl、 10 mM 说 明 书 CN 103667502 A 3 2/5 页 4 (NH4)2SO4、 2 mM MgSO4以及质量浓度为 0.1% Triton X-100， 缓冲液的。
11、 pH 值为 8.8。 0011 其中前外引物、 后外引物、 前促环引物、 后促环引物、 前内引物、 后内引物均为人工 合成的脱氧核糖核酸分子， 其中前外引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:1、 后外引物的核苷酸 序列为 SEQ ID NO:2、 前促环引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:3、 后促环引物的核苷酸序列 为 SEQ ID NO:4、 前内引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:5、 后内引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:6， 上述引物分别与待测基因的相应位置互为反义互补序列， 上述引物能够在等温条件 下以环介导的方式检测待测基因。将前内引物的 5 端标记上生物素基团。
12、， 将后内引物的 5 端标记上异硫氰酸荧光素基团。 0012 各引物的具体核苷酸序列如下 ： SEQ ID NO:1 5 - AGCTACTCGAAAGATGATCC -3 , SEQ ID NO:2 5 - GGTTGTATGAGAAGCGATTG -3 , SEQ ID NO:3 5 - ACCAGTAGCCGTCAATG -3 , SEQ ID NO:4 5 - TTAGATTTGGCGAACGAGA -3 , SEQ ID NO:5 5 - ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT -3 , SEQ ID NO:6 5 - ACGTCGC。
13、AAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG -3 。 0013 （2） 标记核酸胶体金检测试纸条 该试纸条的组成包括样品垫、 金胶垫、 醋酸纤维素膜 （膜上由相应的抗体组成的检测线 和质控线） 和吸水垫等， 具体组成参见附图 1。该胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗 生物素抗体的金颗粒， 胶体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体， 胶体金检测试纸层析膜的质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。 0014 2. 使用等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂的具体步骤为 ： （1） 将待检测的 DNA 溶液， 加入到装有恒温扩增反应液的 PCR 。
14、管中 ； 在对照 PCR 管中分 别加入阳性对照试剂和阴性对照试剂， 将上述 PCR 管在 60 65下扩增反应 30 60 分 钟， 优选条件为 60下扩增反应 60 分钟。 0015 （2） 利用标记核酸胶体金检测试纸条， 检测 PCR 管中反应后的核酸扩增产物。 0016 下面对本发明的技术方案作进一步的解释和说明 ： 等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂能够在 60 65下将副溶血弧菌的 DNA 进 行扩增， 在扩增的同时， 由于前内引物和后内引物分别标记有生物素基团和异硫氰酸荧光 素基团， 因此在 DNA 扩增产物上同时含有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团。 0017 上述扩增产物滴加。
15、在核酸胶体金检测试纸条的样品垫上， 在层析作用下， 扩增产 物在经过金胶垫时双标记的核酸扩增产物由于携带有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团， 因此能够和标记有金颗粒的抗生物素抗体结合形成核酸抗体复合物 ； 核酸抗体复合物在醋 酸纤维素膜上层析， 经过检测线时该复合物由于带有异硫氰酸荧光素基团， 因此能够和检 测线上的抗异硫氰酸荧光素抗体结合， 形成复合物， 该复合物由于携带有有色的标记物 （纳 米金颗粒呈红色） ， 此时检测线呈现红色 ； 当核酸抗体复合物或者单独的标记抗生物素抗体 经过质控线时， 由于质控线上含有能够结合抗生物素抗体的二抗， 所以只要有标记的抗生 物素抗体层析至质控线， 无论该。
16、抗体是否结合有标记的核酸， 均能够形成二抗和标记抗体 的复合物， 该复合物由于携带有有色的标记物 （纳米金颗粒呈红色） ， 此时质控线呈现红色。 0018 本发明的相对传统环介导等温核酸扩增技术具有灵敏度更高， 结果判断更准确的 说 明 书 CN 103667502 A 4 3/5 页 5 优势。首先， 本发明的新型恒温环介导核酸标记检测试剂， 使用标记的引物， 使得环介导等 温扩增后， 扩增产物携带了两种抗原标记物。 这样的双标记核酸扩增产物， 能够被制备好的 胶体金试纸条检测出来。当含有双标记扩增产物的样本在胶体金试纸上层析时， 双标记产 物能够结合携带有有色颗粒标记的抗体， 在检测线上呈。
17、现红色， 这样目的扩增产物可以通 过试纸上检测线的颜色改变显示出来。即使有很少的扩增产物也能够进行准确的检测， 因 此有效地提高了检测灵敏度。 其次， 检测反应的结果通过胶体金检测试纸的检测线得到， 相 对于浊度观察法和荧光燃料变色法读取结果更加准确， 避免了由于检验人员主观判断带来 的结果偏差。上述检测方法扩大了该检测试剂的应用范围， 使之可以广泛应用于野外现场 等特殊环境。 此方法操作简单、 时间短， 同时也降低了检测成本， 使得检测结果更加快速、 可 靠， 具有免疫与核酸诊断试剂各自的优点。该技术由于操作简单、 快速、 低廉的成本和防止 核酸扩增物对实验室的污染， 对于病原体的检测具有重。
18、大意义。 附图说明 0019 附图 1 胶体金试纸条的组成。 0020 该试纸条的组成包括样品垫 （1） 、 金胶垫 （2） 、 醋酸纤维素膜 （3） 、 质控线 （4） 、 检测 线 （5） 和吸水垫 （6） 。该胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗生物素抗体的金颗粒， 胶 体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体， 胶体金检测试纸层析膜的 质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。 0021 附图 2 副溶血弧菌标记扩增检测结果 加入的扩增 DNA 模板如下， 1 号条为副溶血弧菌 DNA 模板标准品其中含目的基因约 104 拷贝 ； 2 号条为副溶血弧菌 DN。
19、A 模板标准品其中含目的基因约 103拷贝 ； 3 号条为副溶血弧 菌DNA模板标准品其中含目的基因约102拷贝 ； 4号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含 目的基因约101拷贝 ； 5号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约100拷贝 ； 6号 为待测样品 ； 7 号条为加入的双蒸水进行阴性对照。 0022 下面结合具体实施例， 进一步详细地阐述本发明。 具体实施方式 0023 本发明的具体实施方式仅对本发明做进一步的解释和说明， 并不对本发明的内容 进行限制。 0024 实施例 1 ： 副溶血弧菌 DNA 基因组梯度稀释标记扩增检测 取浓度已知的副溶血弧菌 DNA 基因组对其进行。
20、 10 倍梯度稀释， 稀释至副溶血弧菌 DNA 中的目的基因终浓度为100拷贝/L， 取副溶血弧菌DNA模板标准品制备的阳性参照物， 阴 性参照物， 以及副溶血弧菌DNA梯度稀释液 （在PCR管中副溶血弧菌特异性目的基因的终浓 度分别为 104拷贝、 103拷贝、 102拷贝、 101拷贝和 100拷贝） ， 做为模板进行标记扩增检测。 0025 等温扩增中的各组分构成比例如下 ： 说 明 书 CN 103667502 A 5 4/5 页 6 1 倍缓冲液中各物质组成如下 ： 20 mM Tris-HCl、 10 mMKCl、 10 mM (NH4)2SO4、 2 mM MgSO4以及质量浓度。
21、为 0.1% Triton X-100， 缓冲液的 pH 值为 8.8， 10 倍缓冲液的各组份浓 度是 1 倍缓冲液中各组份浓度的 10 倍。 0026 将上述混合物加入到 PCR 管中， 在水浴锅中进行等温扩增， 扩增步骤为 ： 60， 30 分钟 ； 80， 2 分钟。 0027 将扩增产物加于胶体金检测试纸条上， 在 15 分钟之内读取结果， 当检测线和质控 线都呈现红色时为阳性结果 ； 当检测线无色、 质控线呈现红色时为阴性结果 ； 当质控线无 色时， 实验失败， 需要重新进行实验。 0028 浓度已知的副溶血弧菌 DNA 基因组进行梯度稀释， 分别加入为副溶血弧菌 DNA 模 板标。
22、准品制备的阳性参照物、 104-100拷贝目的基因的副溶血弧菌 DNA 和用于做参照的无菌 水， 扩增结果为其中阳性参照物和 104-100拷贝目的基因的扩增产物均为阳性， 阴性参照物 的扩增结果为阴性。 0029 实施例 2 ： 副溶血弧菌的检测 样本 ： 某 DNA 样本怀疑为副溶血弧菌。 0030 取该样本进行等温标记扩增检测扩增， 扩增的同时使用副溶血弧菌 DNA 模板标准 品其中含目的基因约 104拷贝 100拷贝的 DNA 样本和无菌双蒸水的阴性对照同时进行检 测。 0031 等温扩增中的各组分构成比例如下 ： 说 明 书 CN 103667502 A 6 5/5 页 7 1 倍缓。
23、冲液中各物质组成如下 ： 20 mM Tris-HCl、 10 mMKCl、 10 mM (NH4)2SO4、 2 mM MgSO4以及质量浓度为 0.1% Triton X-100， 缓冲液的 pH 值为 8.8， 10 倍缓冲液的各组份浓 度是 1 倍缓冲液中各组份浓度的 10 倍。 0032 将上述混合物加入到 PCR 管中， 在水浴锅中进行等温扩增， 扩增步骤为 ： 60， 30 分钟 ； 80， 2 分钟。 0033 将扩增产物加于胶体金检测试纸条上， 在 15 分钟之内读取结果， 当检测线和质控 线都呈现红色时为阳性结果 ； 当检测线无色、 质控线呈现红色时为阴性结果 ； 当质控线。
24、无 色时， 实验失败， 需要重新进行实验。 0034 实施例 2 的结果见附图 2 所示， 各扩增产物中加入的 DNA 模板如下， 1 号条为副 溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约104拷贝 ； 2号条为副溶血弧菌DNA模板标准品 其中含目的基因约 103拷贝 ； 3 号条为副溶血弧菌 DNA 模板标准品其中含目的基因约 102拷 贝 ； 4 号条为副溶血弧菌 DNA 模板标准品其中含目的基因约 101拷贝 ； 5 号条为副溶血弧菌 DNA 模板标准品其中含目的基因约 100拷贝 ； 6 号为待测样品 ； 7 号条为加入的双蒸水进行 阴性对照。 说 明 书 CN 103667502 A 。
25、7 1/2 页 8 天津国际旅行卫生保健中心 一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂 6 patent version 2.1 1 25 DNA 人工序列 1 gtaatcctctgttaaaacacgacgc 2 22 DNA 人工序列 2 tgctgttgtttgttgggatggt 3 21 DNA 人工序列 3 gcggtgaggtagcgagttact 4 25 DNA 人工序列 4 gatgttttcgtccaagtattatctg 5 54 序 列 表 CN 103667502 A 8 2/2 页 9 DNA 人工序列 5 tggagaattgtggttctctaagccgtttcagtgtaatctttagggtgtaatgtg 6 50 DNA 人工序列 6 tggagaattgtggttctctaagccgtttcagtgtaatctttagggtgtaatgtg 序 列 表 CN 103667502 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103667502 A 10 。