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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610251820.7 (22)申请日 2016.04.20 (71)申请人 王丛飞 地址 471000 河南省洛阳市涧西区南昌路 六合国际 (72)发明人 王丛飞 (74)专利代理机构 北京细软智谷知识产权代理 有限责任公司 11471 代理人 王金宝 (51)Int.Cl. C07K 14/78(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种血浆层粘连蛋白提取方法。
2、 (57)摘要 本发明属于生物工程技术领域， 具体提供了 一种血浆层粘连蛋白提取方法， 主要由以下步骤 组成： 制备备用血浆、 加入硫酸铵离心、 盐水溶解 离心所得沉淀物得溶解液、 微孔滤膜过滤所述溶 解液得滤液、 超滤离心管离心所述滤液得层粘连 蛋白液， 冷冻干燥所述层粘连蛋白液得血浆层粘 连蛋白终产品。 达到的有益效果是： 首次采用动 物血为原料制备层粘连蛋白， 原料来源丰富， 克 服了传统层粘连蛋白制备过程中原材料短缺的 问题； 且提取原料为新鲜动物血液， 价廉易得， 极 大的降低了层粘连蛋白的生产成本。 可以将动物 血浆中极其微量的层粘连蛋白浓缩提纯得到高 浓度、 高纯度的层粘连蛋白。。
3、 提取步骤简洁易行， 易控制易实现， 适于工业上大规模推广使用。 权利要求书1页 说明书4页 CN 105820235 A 2016.08.03 CN 105820235 A 1.一种血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于， 包括如下步骤： S1制备备用血浆； S2向所述备用血浆中加入硫酸铵， 搅匀后静置， 静置完毕后离心取沉淀物； S3使用盐水溶解所述沉淀物得溶解液， 使用微孔滤膜过滤所述溶解液， 取滤液； S4使用超滤离心管离心S3所得滤液， 得层粘连蛋白液， 冷冻干燥得血浆层粘连蛋白产 品。 2.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于： S1中备用血浆通过以 下步骤制备获。
4、得： 采集新鲜动物血液， 加入抗凝剂， 离心分离血球和血浆， 收集血浆置于-20 下冷冻得冷冻血浆； 将所得冷冻血浆快速融化后进行离心或过滤， 取清液即得备用血浆； 所述快速融化具体为： 在410条件下， 融化20min40min。 3.根据权利要求2所述的血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于： 将所得冷冻血浆快速 融化后， 在410条件下， 进行离心， 离心时间为1020分钟， 离心转速为30005000r/ min。 4.根据权利要求3所述的血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于： 所述抗凝剂为质量分 数4的柠檬酸三钠水溶液， 所述新鲜动物血液与所述柠檬酸三钠水溶液的重量份比例为 1:710。
5、， 分离血球和血浆的离心操作中： 离心时间为1020min， 离心转速为30005000r/ min。 5.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于： S2中向所述备用血浆 中加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为2025， 静置2小时以上之后再进行离心取沉淀物 操作。 6.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于： S3中所述盐水为生理 盐水， 所述生理盐水与所述沉淀物的重量之比为35:1。 7.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于： S3中所述微孔滤膜的 孔径为0.22 m。 8.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于： S4中。
6、所述超滤离心管 的截留分子量为300kD。 9.根据权利要求8所述的血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于： S4中使用超滤离心管 离心时： 离心时间为515min， 离心转速为40005000r/min。 10.根据权利要求1所述的血浆层粘连蛋白提取方法， 其特征在于： S4中先将所述层粘 连蛋白液中层粘连蛋白浓度稀释至0.05mg/ml后， 再进行冷冻干燥操作。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105820235 A 2 一种血浆层粘连蛋白提取方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 具体涉及一种血浆层粘连蛋白提取方法。 背景技术 0002 层粘连蛋白(Laminin， LN。
7、)是一种细胞外间质中的非胶原糖蛋白， 分子量约900kD。 层黏连蛋白是机体生长发育必须的物质， 广泛参与基膜的构建及细胞的黏附、 生长、 增殖、 迁移和分化， 并且与肝纤维化、 银屑病、 宫颈癌、 肿瘤等多种疾病的发生和发展密切相关。 多 项研究表明层粘连蛋白在促进血管形成及抑制肿瘤扩散等疾病治疗中具有重要医用开发 价值。 0003 目前， 我国层粘连蛋白制备方法仍然处于实验室阶段， 主要是从小鼠肉瘤细胞中， 经组织分离、 层析等方法制备， 工艺复杂、 成本高、 原料来源稀缺， 不适合工业化大规模生 产， 大大限制了层粘连蛋白的大规模应用， 严重阻碍了层粘连蛋白在生物医药领域的研究 和开发。。
8、 同时， 现有的层粘连蛋白制备及分离提取方法获得的层粘连蛋白的低纯度和低收 率进一步限制了其应用。 发明内容 0004 为了解决现有技术存在的上述问题， 本发明提供了一种工艺简洁、 操作步骤易控 制易实现、 适合大规模生产制备的血浆层粘连蛋白提取方法。 同时本发明的血浆层粘连蛋 白提取方法还具有原料来源广泛， 原料成本低， 提取获得的层粘连蛋白纯度高收率高等优 点。 0005 本发明所采用的技术方案为： 0006 本发明的血浆层粘连蛋白提取方法包括以下步骤： 0007 S1制备备用血浆； 0008 S2向所述备用血浆中加入硫酸铵， 搅匀后静置， 静置完毕后离心取沉淀物； 0009 S3使用盐水。
9、溶解所述沉淀物得溶解液， 使用微孔滤膜过滤所述溶解液， 取滤液； 0010 S4使用超滤离心管离心S3所得滤液， 得层粘连蛋白液， 冷冻干燥得血浆层粘连蛋 白产品。 0011 本发明提供的血浆层粘连蛋白提取方法所用原材料为新鲜动物血液， 原料来源广 泛， 且价廉易得。 完全改变了传统技术中使用小鼠肉瘤细胞作为层粘连蛋白提取原料存在 的原料来源苛刻和原料培养费用高昂等缺陷。 同时， 传统的层粘连蛋白提取过程需要进行 多次的层析纯化操作， 极大的提高了层粘连蛋白的提取成本以及操作难度， 由于其限制， 无 法在工业上大规模推广应用。 而本发明提供的血浆层粘连蛋白提取方法步骤简洁、 步骤控 制条件易实。
10、现、 适于大规模工业推广生产应用， 且通过本发明的血浆层粘连蛋白提取方法 提取获得的层粘连蛋白还具有纯度高， 收率高的优点， 通过高效液相色谱检测纯度可达 95以上。 0012 优选改进， S1中备用血浆通过以下步骤制备获得： 采集新鲜动物血液， 加入抗凝 说明书 1/4 页 3 CN 105820235 A 3 剂， 离心分离血球和血浆， 收集血浆置于-20下冷冻得冷冻血浆； 将所得冷冻血浆快速融 化后进行离心或过滤， 取清液即得备用血浆； 所述快速融化具体为： 在410条件下， 融 化20min40min。 对收集到的血浆进行快速冷冻， 然后再快速升温， 目的是分了分离出一部 分杂质， 以。
11、获得纯度更高的层粘连蛋白。 0013 优选改进， 将所得冷冻血浆快速融化后， 在410条件下， 进行离心， 离心时间 为1020分钟， 离心转速为30005000r/min。 进一步优选改进， 所述抗凝剂为质量分数4 的柠檬酸三钠水溶液， 所述新鲜动物血液与所述柠檬酸三钠水溶液的重量份比例为1:7 10， 分离血球和血浆的离心操作中： 离心时间为1020min， 离心转速为30005000r/min。 在本段优选方案的控制参数条件下能够在尽量分离出杂质的同时， 减少层粘连蛋白的流 失， 进而提高目标产品的收率和纯度。 0014 优选改进， S2中向所述备用血浆中加入硫酸铵直至硫酸铵的饱和度为2。
12、025， 静置2小时以上之后再进行离心取沉淀物操作。 体系中硫酸铵的不同饱和度下， 析出的蛋白 类型不同。 本发明控制下的体系硫酸铵饱和度， 能够在尽量减少层粘连蛋白析出流失的同 时， 尽可能促使层粘连蛋白之外的其他蛋白的析出， 进一步保证最终产品质量和收率。 0015 优选改进， S3中所述盐水为生理盐水， 所述生理盐水与所述沉淀物的重量之比为3 5:1。 0016 优选改进， S3中所述微孔滤膜的孔径为0.22 m。 进一步优选改进， S4中所述超滤离 心管的截留分子量为300kD。 通过多层次的其他蛋白截留拦截过滤和离心， 进一步保证了终 产品的纯度质量。 0017 优选改进， S4中使。
13、用超滤离心管离心时： 离心时间为515min， 离心转速为4000 5000r/min。 0018 优选改进， S4中先将所述层粘连蛋白液中层粘连蛋白浓度稀释至0.05mg/ml后， 再 进行冷冻干燥操作。 先稀释层粘连蛋白液， 再进行冷冻干燥， 可以避免层粘连蛋白析出时带 出过多杂质， 进一步保障终产品层粘连蛋白的纯度。 0019 综上所述， 本发明的血浆层粘连蛋白提取方法的有益效果如下： 0020 其一， 首次采用动物血为原料制备层粘连蛋白， 原料来源丰富， 克服了传统层粘连 蛋白制备过程中原材料短缺的问题； 且提取原料为新鲜动物血液， 价廉易得， 极大的降低了 层粘连蛋白的生产成本。 0。
14、021 其二， 提取步骤简洁易行， 易控制易实现， 适于工业上大规模推广使用。 0022 其三， 提取过程中杂质及其他蛋白去除率高， 层粘连蛋白流失量少， 进而获得的终 产品层粘连蛋白纯度和收率都较高。 具体的， 本发明可以将动物血浆中极其微量的层粘连 蛋白浓缩提纯得到高浓度、 高纯度的层粘连蛋白， 经放射免疫分析法(RIA)测定， S4中所得 层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量可达0.21mg/ml， 经高效液相色谱分析终产品层粘连蛋 白的纯度可达95以上。 0023 其四， 采用了冷冻离心、 盐析和超滤离心管离心等技术相结合的方法， 即可提高投 料量， 也可以节省昂贵的层析介质和生产周期， 成本。
15、低廉， 适合大规模生产。 具体实施方式 0024 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。 说明书 2/4 页 4 CN 105820235 A 4 0025 实施例1： 0026 本实施例提供一种血浆层粘连蛋白的提取方法， 步骤如下： 0027 采集新鲜动物血液， 加入所取新鲜动物血液7倍重量的抗凝剂柠檬酸三钠水溶液， 所述柠檬酸三钠水溶液中柠檬酸三钠的质量分数为4。 于转速3000r/min下离心20min分 离血球和血浆， 收集血浆置于-20下冷冻得冷冻血浆。 将所得冷冻血浆在4条件下， 进行 40min快速融化后， 保持4离心20min， 离心转速为3000r/min， 离心完毕取清液。
16、即得备用血 浆。 0028 向备用血浆中添加硫酸铵直至血浆中硫酸铵的饱和度为20， 静置2小时后离心 取沉淀物。 使用所述沉淀物3倍重量的生理盐水溶解所述沉淀物得溶解液。 使用孔径为0.22 m的微孔滤膜过滤所述溶解液， 取滤液。 使用截留分子量为300kD的超滤离心管， 于4000r/ min转速下离心所得滤液， 离心15min， 即得层粘连蛋白液， 放射免疫分析法(RIA)测定， 所得 层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量为0.2mg/ml。 冷冻干燥所得层粘连蛋白液即得终产品层粘 连蛋白， 经高效液相色谱分析终产品层粘连蛋白的纯度为95.2。 0029 实施例2： 0030 本实施例提供一种血浆。
17、层粘连蛋白的提取方法， 步骤如下： 0031 采集新鲜动物血液， 加入所取新鲜动物血液10倍重量的抗凝剂柠檬酸三钠水溶 液， 所述柠檬酸三钠水溶液中柠檬酸三钠的质量分数为4。 于转速5000r/min下离心10min 分离血球和血浆， 收集血浆置于-20下冷冻得冷冻血浆。 将所得冷冻血浆在10条件下， 进行20min快速融化后， 保持10离心10min， 离心转速为5000r/min， 离心完毕取清液即得 备用血浆。 0032 向备用血浆中添加硫酸铵直至血浆中硫酸铵的饱和度为25， 静置2.5小时后离 心取沉淀物。 使用所述沉淀物5倍重量的生理盐水溶解所述沉淀物得溶解液。 使用孔径为 0.22。
18、 m的微孔滤膜过滤所述溶解液， 取滤液。 使用截留分子量为300kD的超滤离心管， 于 5000r/min转速下离心所得滤液， 离心5min， 即得层粘连蛋白液， 放射免疫分析法(RIA)测 定， 所得层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量为0.8mg/ml。 将所得层粘连蛋白液稀释至0.05mg/ ml， 然后冷冻干燥稀释后的层粘连蛋白液即得终产品层粘连蛋白， 经高效液相色谱分析终 产品层粘连蛋白的纯度为96.7。 0033 实施例3： 0034 本实施例提供一种血浆层粘连蛋白的提取方法， 步骤如下： 0035 采集新鲜动物血液， 加入所取新鲜动物血液8倍重量的抗凝剂柠檬酸三钠水溶液， 所述柠檬酸三钠。
19、水溶液中柠檬酸三钠的质量分数为4。 于转速4200r/min下离心13min分 离血球和血浆， 收集血浆置于-20下冷冻得冷冻血浆。 将所得冷冻血浆在7条件下， 进行 28min快速融化后， 保持7离心15min， 离心转速为3500r/min， 离心完毕取清液即得备用血 浆。 0036 向备用血浆中添加硫酸铵直至血浆中硫酸铵的饱和度为22， 静置4小时后离心 取沉淀物。 使用所述沉淀物4倍重量的生理盐水溶解所述沉淀物得溶解液。 使用孔径为0.22 m的微孔滤膜过滤所述溶解液， 取滤液。 使用截留分子量为300kD的超滤离心管， 于4500r/ min转速下离心所得滤液， 离心10min， 即。
20、得层粘连蛋白液， 放射免疫分析法(RIA)测定， 所得 层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量为1mg/ml。 将所得层粘连蛋白液稀释至0.05mg/ml， 然后冷 说明书 3/4 页 5 CN 105820235 A 5 冻干燥稀释后的层粘连蛋白液即得终产品层粘连蛋白， 经高效液相色谱分析终产品层粘连 蛋白的纯度为95.1。 0037 实施例4： 0038 本实施例提供一种血浆层粘连蛋白的提取方法， 步骤如下： 0039 采集新鲜动物血液， 加入所取新鲜动物血液7倍重量的抗凝剂柠檬酸三钠水溶液， 所述柠檬酸三钠水溶液中柠檬酸三钠的质量分数为4。 于转速4000r/min下离心11min分 离血球和血浆。
21、， 收集血浆置于-20下冷冻得冷冻血浆。 将所得冷冻血浆在6条件下， 进行 25min快速融化后， 保持6过滤取清液即得备用血浆。 0040 向备用血浆中添加硫酸铵直至血浆中硫酸铵的饱和度为21， 静置3小时后离心 取沉淀物。 使用所述沉淀物3倍重量的生理盐水溶解所述沉淀物得溶解液。 使用孔径为0.22 m的微孔滤膜过滤所述溶解液， 取滤液。 使用截留分子量为300kD的超滤离心管， 于4800r/ min转速下离心所得滤液， 离心13min， 即得层粘连蛋白液， 放射免疫分析法(RIA)测定， 所得 层粘连蛋白液中层粘连蛋白含量为0.9mg/ml。 将所得层粘连蛋白液稀释至0.05mg/ml， 然后 冷冻干燥稀释后的层粘连蛋白液即得终产品层粘连蛋白， 经高效液相色谱分析终产品层粘 连蛋白的纯度为97.3。 0041 本发明不局限于上述最佳实施方式， 任何人在本发明的启示下都可得出其他各种 形式的产品， 但不论在其细节上作任何变化， 凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案， 均落在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 105820235 A 6 。