《芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因及其编码产物和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因及其编码产物和应用.pdf（12页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210296844.6 (22)申请日 2012.08.21 C12N 15/54(2006.01) C12N 9/10(2006.01) C12N 15/63(2006.01) (73)专利权人 中国中医科学院中药研究所 地址 100700 北京市东城区东直门内南小街 16 号 (72)发明人 黄璐琦 袁媛 汪周勇 CN 102899389 A,2013.01.30, CN 102333866 A,2012.01.25, Chan,A et al.1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase, puta。
2、tive Ricinus communis.GenBank 登录 号 XP_002514364.1 .2009, 翁小刚 . 芍药科植物的研究概况 .中国实 验方剂学杂志 .2003, 第 9 卷 ( 第 1 期 ),55-59. Chan,A et al.Ricinus communis 1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase, putative, mRNA.GenBank 登录号为 XP_002514318.1 .2009, (54) 发明名称 芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶 (PLDXS) 基因 及其编码产物和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种芍药。
3、脱氧木酮糖 -5- 磷酸 合酶 (PLDXS) 基因及其编码蛋白与用途， 该基因 为首次利用构建 cDNA 文库从芍药中克隆而得， 填 补了从我国传统中药材芍药中分离克隆出脱氧木 酮糖 -5- 磷酸合酶基因的空白。本发明所提供的 芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶 (PLDXS) 基因具有 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列或者添加、 取代、 插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等 位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的 蛋白质具有 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列或者 添加、 取代、 插入或缺失一个或多个氨基酸的同源 序列。本发明提供的芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合 酶 。
4、(PLDXS) 基因可以通过生物技术提高芍药中脱 氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径代谢产物的含量， 在 药材芍药的品质改良、 活性成分合成生物学等方 面， 具有很好的应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李有朝 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表4页 附图2页 CN 103627717 B 2016.03.23 CN 103627717 B 1/1 页 2 1.一种芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示。 2.一种芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶， 其特征在于其氨基酸序列如。
5、SEQ ID No.2所示。 3.重组载体， 其特征在于 ： 含有权利要求 1 所述的芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶基因 全序列。 权 利 要 求 书 CN 103627717 B 2 1/4 页 3 芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶 (PLDXS) 基因及其编码产物 和应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 主要涉及利用芍药cDNA文库克隆脱氧木酮糖-5-磷酸 合酶基因及其编码产物与应用， 尤其涉及生物合成有药理活性成分的有机酸、 萜类酶基因 及其编码产物与应用， 属于药用植物基因工程领域。 背景技术 0002 药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。 随着。
6、植物功 能基因组研究的广泛与深入， 独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功 能基因的研究逐渐成为研究的热点， 这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合 成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础， 同时为利用生物技术提高目标 成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。药用植物的化学成分复杂、 种类繁多， 其中主要含有有机酸类、 黄酮类、 挥发油、 萜类、 二萜类、 微量元素等多种成分， 芍 药 Paeonia lactiflora 不仅是名花， 还是一味常用中药， 其根可供药用。其中白芍具有镇 痉、 镇痛、 通经等作用。 芍药根中含有芍药苷、 安息香酸等。
7、活性成分， 其中芍药苷属于单萜类 化合物， 具有显著的镇痛、 镇静、 抗惊厥、 ， 解痉、 解热、 抗炎、 抗溃疡、 抗过敏、 降血糖、 调节免 疫、 保护肝脏等作用 ( 杨俊， 方红编。芍药 M。北京 ： 中国中医药出版社， 2001， 113)。 0003 脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase， DXS)是 位于质体中的萜类化合物生物合成途径脱氧木酮糖 -5- 磷酸 (DXP) 途径的起始酶， 能将丙 酮酸和甘油醛 -3- 磷酸转化生成 DXP， 现在普遍认为 DXS 是 DXP 途径的关键酶和限速酶， 其 表达量可能与芍。
8、药苷等萜类成分的含量密切相关。芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶 (PLDXS) 基因的克隆， 为利用基因工程提高芍药活性成分含量提供重要物质基础， 在药材芍药的品 质改良、 活性成分合成生物学等方面， 具有很好的应用前景。在本发明被公布之前， 尚未有 任何公开或报道过本专利中请中所提及的芍药中脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶基因及其氨基 酸序列。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶 (PLDXS) 基因。 0005 本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。 0006 本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。 0007 本发明的另一个目的在于提供该基。
9、因的应用。 0008 本发明所提供的芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶 (PLDXS) 基因， 为以下核苷酸序列 之一 ： 0009 (1) 具有 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列 ； 0010 (2)SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列添加、 取代、 插入或缺失一个或多个核苷酸的 同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。 说 明 书 CN 103627717 B 3 2/4 页 4 0011 该基因所编码的蛋白质为芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶 (PLDXS) 基因， 是以下氨 基酸序列之一 ： 0012 (1) 具有 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列 ； 0013 。
10、(2)SEQ ID NO.2 添加、 取代、 插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。 0014 本发明所提供的脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因是首次从芍药中克隆制备 的， 体外实验表明， PLDXS 具有催化丙酮酸和甘油醛 -3- 磷酸生成 DXP 的活性。利用本发明 可以通过基因工程技术来提高芍药等植物中萜类物质含量。 附图说明 ： 0015 图 1 ： PLDXS 功能域预测分析 ( 来源于 NCBI 数据库 ) ； 0016 图 2 ： PLDXS 系统进化树 ( 邻接法 ) ； 0017 图 3 ： 表达载体 pET32-PLDXS 构建 ； 具体实施方式 0018 实施例 。
11、1、 芍药 cDNA 文库的构建 0019 1、 芍药总 RNA 的分离和检测 0020 取芍药 (Paeonia lactiflora) 的根 2g， 在研钵中用液氮快速研磨成粉末， 快速转 移至 65预热的 10mL 提取缓冲液中 (CTAB(W/V)2， Tris-HCl(pH8.0)100mmo1L-1， EDTA 25mmolL-1， NaCl 2.0molL-1， PVP402， 亚精胺 0.5g/L， 巯基乙醇 2 )， 充分振荡混匀 ； 用等体积氯仿抽提两次， 7500g 离心 15 分钟。上清液加入 1/4 体积的 10M LiCl， 混匀后放 置 4沉淀过夜 ； 7500g。
12、 离心 20 分钟， 沉淀用 500L SSTE(SDS 0.5， NaCl 1molL-1， Tris-HCl(pH8.0)10mmolL-1， EDTA 1mmolL-1， 在 65溶解 5 分钟。用等体积氯仿抽提， 13000g 离心 5 分钟 ； 上清液加入 2 倍体积无水乙醇， -70放置 2 小时 ； 4 13000g 离心 20 分钟， 沉淀室温干燥 10 分钟后溶于 100L DEPC 处理的水中， 用 1.0琼脂糖电泳检测 RNA 的完整性， 用 GenQuant 核酸定量仪测定 A260、 A280 比值和浓度。置于 -80冰箱备用。 0021 2、 cDNA 文库的构建 。
13、0022 采用 mRNA 纯化试剂盒 (QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit， Pharmacia 公司 ) 分离 mRNA 后， 采用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library Construction Kit(Cat.No.634903) 进行建库， 原理为 SMART(switch mechanism at 5 end of mRNA template)。 0023 实施例 2 ： 芍药相关基因的克隆 0024 随机挑取 5000 个单克隆进行菌落 PCR 鉴定。取适量 PCR 薄壁管， 置于冰上， 每 管先。
14、加入 17.3ul 的灭菌水。用灭过菌的 10ul 小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中， 振荡 混匀。依次加入 ： Taq buffer 2.5L， MgCl2(25mM)1.8L， dNTP(2.5mM)1L， M13+ 引物 (10pmol)1L， M13- 引物 (10pmol)1L， Taq 酶 0.4L。PCR 反应条件为 94预变性 5 分 钟后， 94 40 秒， 54 40 秒， 72 4 分钟， 35 个循环后 72延伸 10 分钟， 4保存。待 PCR 反应进入 4后， 取下 PCR 薄壁管， 取 7ulPCR 产物加入 3ul 溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳， 半 小时后照相， 观。
15、察胶图， 根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。 选择条带单一扩增 产物送至华大基因公司进行测序， 获得芍药相关基因序列。 说 明 书 CN 103627717 B 4 3/4 页 5 0025 实施例 3、 PLDXS 基因的生物信息学分析 0026 本发明涉及的芍药脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶基因全长 cDNA 的长度为 2160bp， 详细序列见序列表中的序列 1， 其中开放读码框位于 1-2160bp。将芍药全长 cDNA 序列 用 BLAST 程 序 在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBank CDS。
16、 translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR 数 据 库 中 进 行 核 苷 酸 同 源 性 检 索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的 DXS 有较高的同源性， 同时具有典型的 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 结构域。如图 1。 0027 实施例 4、 PLDXS 基因功能的研究 0028 1. 重组质粒的构建 0029 以 PLDXS cDNA 为 模 板，利 用 引 物 P1 ： 5 -GGATCCATGGGTACTGCTTCTGCTCATT AC-3， P2 ： 5 -GGTACCCTAGCACATCA。
17、AAAGGAGAGCTTCA-3进行 PCR 反应， 反应体系同实验 例 2。取 5ul 扩增产物加入 3ul 溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳， 半小时后照相， 观察胶图， 扩 增片段为 2172bp。用 BamH I 和 Kpn I 在 37下双酶切扩增产物 2 小时， 利用回收试剂盒 (Takara 公司， 中国 ) 纯化酶切产物。同时利用 BamH I 和 Kpn I 在 37下酶切 pMD19-T 载 体 2 小时， 加入 5ul 溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳， 观察胶图， 并利用回收试剂盒回收片段。 0030 回收片段经 T4 连接酶在 8连接过夜。电击转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 在 。
18、含有氨苄青霉素的 LB 平板上筛选重组子。含 PLDXS 克隆的 pMD19 质粒经 PCR 和限制性内 切酶酶切鉴定和 DNA 序列分析， 保存具有正确目标序列的重组质粒 pMD 19-PLDXS。 0031 2. 原核表达及载体构建 0032 BamH I 和 Kpn I 双酶切 pMD 19-PLDXS 质粒和 pET 32a 质粒， 分别回收目标片段 PLDXS和开环的pET32a片段。 回收片段PLDXS和pET 32a于16连接过夜， 获得重组质粒， 经 PCR 和限制性内切酶酶切鉴定和 DNA 序列分析， 证明含有正确序列的 PLDXS， 该表达载体 命名为 pET32-PLDX。
19、S( 图 3)。 0033 用目标质粒 pET32-PLDXS 利用 CaCl2方法转入 E.coli BL21 感受态细胞， 培养筛 选含有 pET32-PLDXS 质粒的阳性菌株。挑取单菌落的工程菌于 3ml 含 100g/ml 氨苄青霉 素 LB 培养基中振摇培养过夜， 按 1 100 的浓度吸取培养液于新的 LB 培养基 ( 含 100g/ ml 氨苄青霉素 ) 中培养约 3 小时， 至 OD600 达 O.5 后， 取 1ml 菌液作为诱导前对照， 然后加 入终浓度为 1mmol/L 的异丙基硫代 -D- 半乳糖苷 (IPTG)， 在 37振荡培养中诱导工程 菌表达， 于诱导 3h 。
20、后取样 1ml， 以含有 pET32a 空载体的 E.coli BL21 培养物为阴性对照。 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明， 在分子量约为 78.89kD 处， 出现一条明显的特异蛋白 质表达条带， 与理论值一致。 0034 3.PLDXS 基因功能分析 0035 BamH I 和 Kpn I 双酶切 pMD 19-PLDXS 质粒和 pTrc-AtIPI 质粒， 分别回收目标片 段PLDXS和大片段pTrc骨架， 于16连接回收片段， 获得重组质粒， 经PCR和限制性内切酶 酶切鉴定和 DNA 序列分析， 证明含有正确序列的 PLDXS， 0036 将 pTrc-PLDXS 转 化 。
21、携 带 pAC-LYC 质 粒 的 大 肠 杆 菌 XL1-Blue，并 在 含 有 Amp(100g/ml) 和 Cm(50g/ml) 的 LB 培养基上筛选阳性克隆。 0037 将携带番茄红素生物合成途径上香叶基香叶基焦磷酸合成酶 (crtE)、 八氢番茄红 素合成酶 (crtB)、 八氢番茄红素脱饱和酶 (crtl)3 个关键酶基因的原核表达载体 pAC-LYC 说 明 书 CN 103627717 B 5 4/4 页 6 导入大肠杆菌菌株 XLl-Blue 后， 可以在本底水平上表达番茄红素。当把 pTrc-PLDXS 导入 上述重组菌后， 由于突破了上游途径的代谢瓶颈， 推动代谢流向。
22、番茄红素合成的方向流动， 使该菌能大量积聚番茄红素。 0038 本发明挑取分别含有 XL1-Blue+pTrc-PLDXS、 XL1-Blue+pTrc-PLDXS+pAC-LYC 的 大肠杆菌单克隆， 在含有 Amp(100g/ml) 和 Cm(50g/ml) 的 LB 培养基上， 于 28倒 置暗培养， 2 3 天后观察菌落颜色变化情况。以含有 XL1-Blue、 XL1-Blue-+pAC-LYC、 XL1-BIue+pTrc+pAC-LYC 大肠杆菌单克隆为对照。 0039 实 验 结 果 表 明， 72h 培 养 后， XL1-Blue 空 菌、 XL1-Blue+pTrc-PLDX。
23、S、 XL1-Blue+pAC-LYC 都不能生长 ； XL1-Blue+pTrc+pAC-LYC 未携带 PLDXS， 不能过量表达番茄 红素， 所以菌落仍呈现 XLI-Blue 本身的淡黄色 ； 只有 XL1-Blue+pTrc-PLDXS+pAC-LYC 由于 能大量表达番茄红素， 经培养后， 菌落呈现番茄红素特有的红色。从而证明了 PLDXS 可以推 动代谢流向番茄红素合成的方向流动， 使该菌能大量积聚番茄红素。 0040 4. 突变 DXS 活性测定 0041 以 PLDXS cDNA 为模板， 利用突变引物 P3 ： 5 -GGATCCATGGGTACCGCTTCTGCTCATTA。
24、 C-3， P4 ： 5 -GGTACCCTAGCACATCAAAAGGAGAGCTTCA-3进行 PCR 反应， 重组质粒的构建、 原核表达及载体构建、 PLDXS 功能分析方法同上， 结果表明突变 PLDXS 转基因工程菌株与正 常 PLDXS 没有显著差异。 说 明 书 CN 103627717 B 6 1/4 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103627717 B 7 2/4 页 8 0003 序 列 表 CN 103627717 B 8 3/4 页 9 0004 序 列 表 CN 103627717 B 9 4/4 页 10 序 列 表 CN 103627717 B 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103627717 B 11 2/2 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 103627717 B 12 。