测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN200910181644.4	申请日：	2009.07.24
公开号：	CN101609062A	公开日：	2009.12.23
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):G01N 27/26申请日:20090724授权公告日:20121010终止日期:20130724\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N27/26; C12Q1/32	主分类号：	G01N27/26
申请人：	南京大学
发明人：	毕树平; 王娜; 章福平; 程炯佳
地址：	210093江苏省南京市鼓楼区汉口路22号
优先权：
专利代理机构：	南京天翼专利代理有限责任公司	代理人：	王玉梅
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内容摘要

本发明涉及一种测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法，操作简单，设备轻便，有利于对环境中的多壁碳纳米管进行监控。所述测定多壁碳纳米管致毒效应的方如下：在MWCNTs溶液中加入乳酸脱氢酶(LDH)，搅拌均匀后，加入丙酮酸(Pyr)和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH)，记录产物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)在悬汞电极产生的还原峰电流。MWCNTs溶液按下述方法得到：将MWCNTs置于三(羟甲基)氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)缓冲溶液中，快速搅拌后再超声处理10min。本发明可以为构建小型、便携的生物电化学传感器提供新思路，在研究生物氧化还原体系以及环境污染监控等方面都具有良好的应用前景。

权利要求书

1.  一种测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法，其特征在于在多壁碳纳米管溶液中加入乳酸脱氢酶，搅拌均匀后，加入丙酮酸和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐，记录产物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸在悬汞电极产生的还原峰电流。

2.  如权利要求1所述的测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法，其特征在于根据3min内的i_p，NAD⁺与时间呈线性关系，由i_p，NAD⁺的值与标准曲线比对后，计算得反应的初速率v，根据3min内反应速率v，NADH浓度和反应速度存在如下的关系式：
1v=Kmvmax×CNADH+1vmax]]>
其中：
v：反应的初速率(μmol·L^-1·min^-1)；
K_m：米氏常数(μmol·L^-1)；
v_max：最大反应速率(μmol·L^-1·min^-1)；
C_NADH：还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐的浓度(μmol·L^-1))，
以v^-1对C_NADH^-1作图，得到一条直线，求得K_m和v_max，表示乳酸脱氢酶的活性。

3.  如权利要求1所述的测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法，其特征在于测定条件是：乳酸脱氢酶浓度为1×10^-4-1.5×10^-4g·L^-1，丙酮酸浓度为6.0×10^-4-10.0×10^-4mol·L^-1，还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐浓度为1.0×10^-4-4.0×10^-4mol·L^-1。

4.  如权利要求1所述的测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法，其特征在于在pH值为6.0～10.2、氮气气氛中测定，采用0.15-1.0mol·L^-1KCl作为支持电解液。

5.  如权利要求1所述的测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法，其特征在于在多壁碳纳米管溶液中加入乳酸脱氢酶后搅拌5-15min。

6.  如权利要求1-5中任一项所述的测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法，其特征在于多壁碳纳米管溶液按下述方法得到：将多壁碳纳米管母液置于三(羟甲基)氨基甲烷-HCl缓冲溶液中，快速搅拌后再超声处理10-20min。

说明书

测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法
技术领域
本发明涉及一种测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法。
背景技术
纳米技术是21世纪科学技术的象征，由于纳米材料的特殊性质使得其在各领域有广阔的应用前景。但近几年来有很多的文章相继讨论其负面影响，其中Carbon第44卷第6期连载6篇文章讨论碳纳米管对健康的潜在危害。碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)是一种完全人造的一维结构的纳米材料，最早在1991年由Iijima发现，属于富勒(fullerene)碳系，是碳纳米材料的一种，有良好的机械、电学和磁学性质，可分为单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)。未被处理过的碳纳米管非常轻，有可能通过空气到达人的肺部。因此，单壁碳纳米管对环境和生物的安全性也最先被人们关注。而由于碳纳米材料的表面效应，即具有巨大的表面积，在其表面可以吸附更多的有毒有害物质，从而产生更复杂的生物效应。例如近年来用碳纳米材料(碳纳米管和C₆₀)除去水体中的痕量重金属和有机污染物的研究报道也不少，但是残留在水体中的碳纳米材料也会对人体和动植物的健康产生影响，而且吸附了重金属或有机污染物的碳纳米材料在环境中迁移、转化后可能有更大的毒性。关于碳纳米管生物效应和毒理学的研究已有不少，研究对象多为小鼠、大鼠和细胞，分析方法也多为滴注法结合MTT法，结果发现实验对象有时间和剂量依赖型的反应出现，其损伤也多归于氧化应激，其细胞毒性与粒子尺寸有关，酸化处理后其细胞毒性会增大。上述分析方法操作复杂，设备体积较大，不利于随时随地对环境进行监控，测定多壁碳纳米管的致毒效应。
发明内容
本发明提供一种测定多壁碳纳米管致毒效应的电化学方法，操作简单，设备轻便，有利于对环境中的多壁碳纳米管进行监控。
所述测定多壁碳纳米管致毒效应的方如下：在MWCNTs溶液中加入乳酸脱氢酶(LDH)，搅拌均匀后，加入丙酮酸(Pyr)和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH)，记录产物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)在悬汞电极产生的还原峰电流。
本领域的普通技术人员可以根据上述测量体系的特性选定具体的测定条件。优选的测定条件是：LDH浓度为1×10^-4-1.5×10^-4g·L^-1，Pyr浓度为6.0×10^-4-10.0×10^-4mol·L^-1，NADH浓度为1.0×10^-4-4.0×10^-4mol·L^-1。更优选的条件是在pH值为6.0～10.2、氮气气氛中测定，采用0.15-1.0mol·L^-1KCl作为支持电解液。
MWCNTs溶液按下述方法得到：将MWCNTs置于三(羟甲基)氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)缓冲溶液中，快速搅拌后再超声处理10-20min。
LDH是一种胞浆酶，广泛存在于心、肝、肺以及其它多种组织器官中。LDH是由H及M两种亚基组成的一组四聚体分子，几乎存在于脊椎动物的所有细胞中，是生物无氧呼吸中的一个关键酶，是胞液的标志酶。它有五种同工酶，不同的酶有不同的动力学特性，在辅酶NADH存在下，LDH能催化丙酮酸转化为乳酸和NAD+，对生物的能量新陈代谢有重要意义。本发明首次直接将MWCNTs与LDH作用后通过测定悬汞电极上NAD+还原峰电流的变化来指示其对LDH活性的影响。将0.1mol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5)25mL置于三电极系统，支持电解液0.15mol·L^-1KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入35mg L^-1的MWCNTs(d＜10nm，长5-15μm)，快速搅拌2min后再超声处理10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌5分钟，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH(2.0×10^-4mol·L^-1)，记录不同反应时间下NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p，NAD⁺。在MWCNT(d＜10nm)-LDH反应体系中，悬汞电极上有电化学响应的物质是丙酮酸和NAD⁺。酶促反应开始前，只有底物丙酮酸在-1.38V的位置上有一个还原峰(pH＝7.5)。反应开始后，随着反应时间的延长，位于-0.89V处NAD⁺的还原峰逐渐增大(pH＝7.5)，而丙酮酸的还原峰逐渐减小(如图1所示)。反应结束后，NAD⁺的还原峰不再增大，而丙酮酸的还原峰也不再变化。在最初反应的5min，i_p随反应时间的延长而线性增加，在反应达到19min后i_p基本趋于稳定。由3min内的线性关系，可由i_p，NAD⁺的值与标准曲线比对，得NAD⁺的浓度，然后计算得反应的初速率v。采用不同浓度的NADH进行测定，然后记录3min时NAD⁺的还原峰电流。3min内反应速度v，NADH浓度和反应速度存在如下的关系式【李元宗，常文保.生化分析，北京：高等教育出版社，2003，p.6-14.】：
1v=Kmvmax×CNADH+1vmax]]>
其中：
v：反应的初速率(μmol·L^-1·min^-1)；
K_m：米氏常数(μmol·L^-1)；
v_max：最大反应速率(μmol·L^-1·min^-1)；
C_NADH：NADH的浓度(μmol·L^-1))，
以v^-1对C_NADH^-1按Lineweaver-Burk法作图，得到一条直线，根据直线的斜率和截距可求得LDH催化体系的动力学参数K_m和v_max，进而表示酶活性。
以NAD⁺的还原峰电流的大小来指示LDH活性的变化。一方面因其是产物，可以简单、方便表示酶活性的变化，另一方面丙酮酸的还原峰电流跳跃较大，不稳定。
通过考察，证实了溶解的少量MWCNTs也会对LDH活性有显著的影响，且该影响与MWCNTs的吸附作用无关，而是一种致毒效应的表现。鉴于LDH在医学、生物研究、环境检测等方面特别是在生物指示方面的重要作用，本发明可以为构建小型、便携的生物电化学传感器提供新思路，在研究生物氧化还原体系以及环境污染监控等方面都具有良好的应用前景。这不仅有助于理解MWCNTs对酶反应过程的影响，也有助于研究不同环境条件下对酶的影响。
综上所述，本发明操作简单，设备轻便，有利于对环境中的多壁碳纳米管进行监控。
附图说明
图1是随着反应时间进行MWCNTs-LDH体系的示差脉冲伏安分析图，其中a→h依次代表反应时间为1，3，5，7，9，15，19，23min时的伏安曲线；
图2是循环伏安扫描信号图；
图3是Pyr示差脉冲伏安扫描的标准曲线图；
图4是NAD⁺示差脉冲伏安扫描的标准曲线图；
图5是注入LDH溶液后搅拌时间对LDH活性的影响图-LDH反应体系；
图6是注入LDH溶液后搅拌时间对LDH活性的影响图-MWCNTs-LDH反应体系；
图7是pH值对LDH活性的影响图-LDH反应体系；
图8是pH值对LDH活性的影响图-MWCNTs-LDH反应体系；
图9是MWCNTs浓度对MWCNTs-LDH反应体系中的LDH活性的影响图，其中MWCNTs浓度为：a-0；b-24mg·L^-1；c-48mg·L^-1；d-90mg·L^-1；e-160mg·L^-1；
图10是MWCNTs浓度对MWCNTs-LDH反应体系中的LDH活性的影响图，其中MWCNTs浓度为：a-0；b-6mg·L^-1；c-12mg·L^-1；d-20mg·L^-1；
图11是MWCNTs的长度对LDH活性的影响图-MWCNTs直径＜10nm；
图12是MWCNTs的长度对LDH活性的影响图-MWCNTs直径＝10-20nm；
图13是MWCNTs的长度对LDH活性的影响图-MWCNTs直径＝40-60nm；
图14是MWCNTs的直径对LDH活性的影响图-MWCNTs长1-2μm；
图15是MWCNTs的直径对LDH活性的影响图-MWCNTs长5-15μm；
图16是v^-1对C_NADH^-1直线图，其中a：MWCNTs-LDH体系，b：LDH体系。
具体实施方式
1仪器与试剂
(1)试剂
丙酮酸(生化试剂)，纯度＞98.5％，中国医药(集团)上海化学试剂公司。三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，中国医药(集团)上海化学试剂公司。β-还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(β-NADH)，β-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD⁺)(生化试剂)，纯度＞90.0％，均为上海伯奥生物科技有限公司产品。牛心乳酸脱氢酶(LDH)(10mg·mL^-1)为Sigma公司产品，稀释100倍后待用。MWCNTs(直径分别为：＜10nm，10-20nm，40-60nm；长度：1-2μm和5-15μm)，共六种规格，纯度≥99.5％，灰≤0.02wt％，比表面积40-300m²·g^-1，无定形碳＜3％，深圳市纳米港有限公司。实验用pH值的Tris-HCl缓冲液按分析化学手册配置而成，支持电解液为0.15mol·L^-1KCl。所用化学试剂除特别说明外均为分析纯。实验器皿使用前在1∶10(v/v)硝酸浸泡24h后再用自来水、蒸馏水和二次蒸馏水依次洗净。实验用水均为二次蒸馏水。
(2)仪器
三电极系统：悬汞电极为工作电极(S＝0.022cm²，江苏电分析仪器厂)，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。CHI660B电分析仪(上海辰华公司)。示差脉冲伏安参数为：扫速20mV·s^-1，脉冲幅度50mV，脉冲宽度50ms。KH2200B型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司。79-1型磁力加热搅拌器(国华仪器厂)。雷磁PHS-2F数字酸度计(上海精密科学仪器有限公司)。501型超级恒温器(上海实验仪器厂)。UV3600紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。
2.实验方法
(1)示差脉冲伏安法(简称DPV)测定MWCNTs对LDH活性的影响
0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲溶液25mL置于三电极系统，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入一定量的MWCNTs，快速搅拌2min后再超声处理10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌反应，静置1分钟，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH，记录不同反应时间下NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p。
(2)Pyr或NAD⁺的标准曲线
0.10mol·L^-1Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5)25mL置于三电极系统，支持电解液为0.15mol·L^-1的KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入MWCNTs快速搅拌2min，再超声10min。维持氮气气氛，注射Pyr或NAD⁺溶液，电磁搅拌5min后，静置1分钟，用DPV进行扫描，记录示差脉冲还原峰电流，改变Pyr或NAD⁺溶液的浓度，用Pyr或NAD⁺的还原峰电流对其浓度作图得标准曲线，得到在前述加入MWCNTs条件下的Pyr或NAD⁺溶液标准曲线，经计算，得到Pyr或NAD⁺的标准曲线方程。
3.吸附对实验的影响
LDH作为一种生物分子在悬汞电极上可能会有吸附，而且MWCNTs对LDH也可能有很强的吸附性。LDH酶促反应体系中存在五种物质：反应物丙酮酸(Pyr)、NADH，生成物乳酸(Lac)、NAD⁺以及LDH酶。为确认本实验中MWCNTs对LDH活性的影响因其直接对LDH的影响而不是因为对反应中的其它物质的作用而引起的，我们对上述问题进行了探讨。
(1)LDH在悬汞电极上的吸附
①0.10mol·L^-1Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5)25mL置于三电极系统，支持电解液为0.15mol·L^-1的KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，循环伏安法扫描，得到空白的Tris曲线；再将悬汞电极置于含有LDH的0.10mol·L^-1Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5)25mL中10min，取出用二次水洗过后将悬汞电极放入三电极系统，在同样条件下循环伏安法扫描，得到Tris-LDH曲线，结果见图2，说明LDH在悬汞电极上即使有吸附也是很弱的，不会对LDH酶活性造成影响。
②本实验中所用的LDH的量不多，与其它物质(丙酮酸为8.0×10^-4mol·L^-1，NADH为2.0×10^-4mol·L^-1)相比小很多。因此，LDH在悬汞电极上即使有吸附，量也会非常小，不会影响LDH酶活性。
(2)MWCNTs对LDH酶促体系中各种组分的吸附
①作用时间对Pyr或NAD⁺的影响
0.10mol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5)25mL置于三电极系统，支持电解液为0.15mol·L^-1的KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入MWCNTs(d＝10-20nm，5-15μm)快速搅拌2min，再超声10min。维持氮气气氛，注射Pyr或NAD⁺溶液，电磁搅拌5min后，静置1分钟，用DPV进行扫描，记录示差脉冲还原峰电流，改变Pyr或NAD⁺溶液的浓度，用Pyr或NAD⁺的还原峰电流对其浓度作图得标准曲线，再改变加入MWCNTs的浓度，得到一系列标准曲线，如图3、4。结果表明，加入MWCNT前后的标准曲线几乎是重合的，这就说明了MWCNT对Pyr和NAD⁺几乎是没有影响的。
②为进一步验证上述结果，通过化学平衡计算可以看出反应体系中各物质基本符合酶促反应前后的化学计量比。0.1mol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液25mL(pH＝7.5)置于三电极系统，支持电解液0.15mol·L^-1KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入35mg L^-1的MWCNTs(d＝10-20nm，长5-15μm)，快速搅拌2min后再超声处理10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌5分钟，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH(2.0×10^-4mol·L^-1)，记录Pyr示差脉冲伏安还原峰电流i_p，Pyr和NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p，NAD⁺，根据加入35mg L^-1的MWCNTs(d＝10-20nm，长5-15μm)时的Pyr和NAD⁺标准曲线方程进行计算，得到不同反应时间下的Pyr和NAD⁺浓度，具体见表1。反应开始加入8.0×10^-4mol·L^-1的Pyr和2.0×10^-4mol·L^-1的NADH，当反应达到平衡后计算得溶液中剩余约有6.0×10^-4mol·L^-1的Pyr，并生成了约2.0×10^-4mol·L^-1的NAD⁺，且反应过程中生成的NAD⁺与剩余的Pyr的和约为8.0×10^-4mol·L^-1，符合酶促反应前后的化学计量比。证明MWCNTs对LDH酶促反应体系中的其它物质在反应时间内几乎是没有影响的。其中：
NAD⁺的标准曲线：i_p，NAD⁺(μA)＝0.00406+2.559C_NAD⁺(mM)；
Pyr的标准曲线：i_p，Pyr(μA)＝-0.06591+2.610C_Pyr(mM)。
表1

t(min) i_p，NAD⁺(nA) C_NAD⁺(mM) i_p，Pyr(μA) C_Pyr(mM) C_NAD⁺₊C_Pyr(剩余)(mM) 1 50.14 0.018 1.949 0.772 0.79 3 188.8 0.072 1.913 0.758 0.83 5 247.3 0.095 1.778 0.707 0.80 7 320.3 0.124 1.694 0.674 0.80 9 296.9 0.1114 1.387 0.557 0.67 12 437.8 0.17 1.628 0.649 0.82 15 424.3 0.164 1.434 0.575 0.74 17 489.7 0.19 1.551 0.62 0.81 19 520.1 0.2 1.514 0.605 0.81 23 489.1 0.19 1.475 0.59 0.78

③上述原因影响不大主要可以归因于动力学原因。从动力学角度来看，在碳纳米材料除去水中的有毒有害物质多环芳烃等的实验中，CNTs吸附去除水中的1，2-二氯苯时需要40min才能达到平衡，而去除水中的四种三卤甲烷(CHCl₃、CHBrCl₂、CHBr₂Cl、CHBr₃)时，在低浓度时均约需要450min才能达到平衡，而高浓度时均约需要350min达到平衡，本实验中MWCNTs与LDH酶促体系中各组分总的作用时间不超过10min，在这么短的时间内反应体系中的各组分物质即使在MWCNTs上有吸附，也只是很少量的，不会对实验结果产生影响；从而就说明MWCNTs对LDH活性的影响是因为其对LDH酶的影响而并不是因其对体系中物质的吸附而引起的，因此可以用LDH活性指示环境中MWCNTs等纳米粒子的影响。
对照实施例1
0.1mol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5)25mL置于三电极系统，支持电解液0.15mol·L^-1KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH(2.0×10^-4mol·L^-1)，记录不同反应时间下NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p，NAD⁺，改变注入LDH液体后的搅拌时间进行系列实验，结果如图5所示。结果表明，将LDH放置在缓冲液中，搅拌不同时间后，一定反应时间下的i_p，NAD⁺变化并不很明显，放置5min时i_p，NAD⁺是最大的，而随着放置时间的延长，LDH活性变化并不明显。
实施例1
0.1mol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5)25mL置于三电极系统，支持电解液0.15mol·L^-1KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入35mg L^-1的MWCNTs(d＝10-20nm，长1-2μm)，快速搅拌2min后再超声处理10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌一定时间，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH(2.0×10^-4mol·L^-1)，记录不同反应时间下NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p，NAD⁺，改变注入LDH液体后的搅拌时间进行系列实验，并与对照实施例1中搅拌时间为5min的LDH反应体系进行对比，结果如图6所示。从图中可以看出LDH与MWCNT作用5min后i_p，NAD⁺的下降相对于不加碳纳米管已经很明显。10min与15min的两条曲线几乎重合，而且两条曲线明显的与5min的有差别。结合图5、6结果，注入LDH后，搅拌时间定为5分钟比较合适。
对照实施例2
0.1mol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液25mL置于三电极系统，支持电解液0.15mol·L^-1KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌5分钟，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH(2.0×10^-4mol·L^-1)，记录不同反应时间下NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p，NAD⁺，改变缓冲溶液的pH值，进行系列实验，结果如图7所示。
实施例2
0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲溶液25mL置于三电极系统，支持电解液0.15mol·L^-1KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入35mg L^-1的MWCNTs(d＝10-20nm，长1-2μm)，快速搅拌2min后再超声处理10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌5分钟，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH(2.0×10^-4mol·L^-1)，记录不同反应时间下NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p，NAD⁺，改变缓冲溶液的pH值，进行系列实验，结果如图8所示。
由图7、8可知，两种酶促体系、相近pH的缓冲液、同一反应时间下i_p，NAD⁺很接近，这可能是因为酸度对MWCNTs的溶解度无影响或是影响很小的缘故。pH值低于6.0时，NADH不能稳定存在，因而无法用i_p，NAD⁺指示酶活性的变化，而且此时丙酮酸的还原峰也发生分裂；pH太高后反应速率很慢，达到平衡的时间加长。所以实验中仅选择了pH在6.0-10.2的Tris-HCl缓冲液进行实验。
实施例3
0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲溶液25mL(pH＝7.5)置于三电极系统，支持电解液0.15mol·L^-1KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入MWCNTs(d＝10-20nm，长1-2μm)，快速搅拌2min后再超声处理10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌5分钟，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH(2.0×10^-4mol·L^-1)，记录不同反应时间下NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p，NAD⁺，改变MWCNTs的加入量，进行系列实验，结果如图9、10所示。结果表明：加入少量的MWCNT水溶液后i_p，NAD⁺峰电流变化比较明显，i_p，NAD⁺到12min后电流才开始有明显差别，可能是因为MWCNT在水中的溶解度很小的缘故，但仅分散均匀的MWCNT也会对LDH活性产生影响，加入较多量的MWCNT(d＝10-20nm)水溶液后电流变化相对明显。两组数据均说明随MWCNT浓度越大对LDH活性的影响越明显。
实施例4
0.1mol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液25mL(pH＝7.5)置于三电极系统，支持电解液0.15mol·L^-1KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入35mg L^-1的MWCNTs，快速搅拌2min后再超声处理10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌5分钟，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH(2.0×10^-4mol·L^-1)，记录不同反应时间下NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p，NAD⁺，改变MWCNTs的直径和长度，进行系列实验，并与同等实验条件下，未加入MWCNTs的LDH反应体系进行比较，结果如图11-15所示。
由图11-13可知，长度1-2μm的MWCNT对LDH活性的影响要比长度5-15μm的MWCNT对LDH活性的影响大，而直径为40-60nm的两种长度的MWCNTs对LDH活性影响的差别相对很小。
由图14、15可知，对长度1-2μm的碳纳米管而言，直径越短的MWCNTs对LDH活性的影响越大；而对于长度5-15μm的碳纳米管，三个不同直径的MWCNTs对LDH活性的影响却差不多。在本实验条件下长度较短的(1-2μm)、不同直径的MWCNTs对LDH活性的影响差别较大。
实施例5
0.1mol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液25mL(pH＝7.5)置于三电极系统，支持电解液0.15mol·L^-1 KCl，恒温(25℃)、通氮除氧10min，加入35mg L^-1的MWCNTs(d＝10-20nm，长5-15μm)，快速搅拌2min后再超声处理10min，维持氮气气氛，注入LDH液体30μL，搅拌5分钟，加入丙酮酸(8.0×10^-4mol·L^-1)和NADH，记录反应3min时NAD⁺示差脉冲伏安还原峰电流i_p，NAD⁺，改变NADH的浓度，进行系列实验。由i_p，NAD⁺与标准曲线进行比对，得到C _NAD⁺，除以反应时间3min，得到反应初速率。以v^-1对C_NADH^-1按Lineweaver-Burk法作图，得到一条直线(如图16中直线a所示)，根据直线的斜率和截距可求得MWCNTs-LDH体系的动力学参数K_m和v_max。同样的条件，不加入MWCNTs，进行实验，作图(如图16中直线b所示)，经计算得到LDH体系的动力学参数K_m和v_max。结果见表2。
表2

从图16中可以看出，pH＝7.5，25℃时MWCNT对LDH的抑制机理符合竞争型抑制机制。尽管实验条件不尽相同，但从数据来看所求得K_m和v_max的数量级与文献【袁勤生.现代酶学，上海：华东科技大学出版社，2001，p.31-44.】中的结果是一样的，从而说明我们的实验结果是合理的。从表2可以看出，加入MWCNT对v₀、v_max几乎没有影响，但K_m相对变化大，由97增大到125μM，由于K_m是离解常数，其值越小时酶的活性越大，也就是说加入MWCNT后影响了LDH的活性，使其活性降低了。