乙型脑炎病毒PRM/M蛋白B细胞抗原表位多肽及应用.pdf

乙型脑炎病毒PrM/M蛋白B细胞抗原表位多肽及应用
技术领域
本发明涉及抗原表位多肽，尤其涉及乙型脑炎病毒PrM/M蛋白B细胞抗原表位多肽，本发明还涉及该抗原表位多肽在诊断乙型脑炎病毒中的应用，属于分子免疫学领域。
背景技术
流行性乙型脑炎乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitisvirus，JEV)引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。该病毒首先于1953年在日本从患者脑组织中分离获得，因此称日本脑炎病毒，所致疾病在日本称日本乙型脑炎。在我国最早于1940年分离此病毒，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎，简称乙脑。在世界范围内每年有30,000-50,000例乙脑病例，约25％-30％死亡，50％导致永久性中枢神经系统后遗症。我国近年每年的乙脑病例大于5000例，死亡200例以上。对于流行性乙型脑炎病毒多种动物易感，但除人、马和猪外通常不呈现临床症状。对人主要引起中枢神经系统的急性感染，人感染临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。母猪感染可引起流产、产死胎或木乃伊胎，公猪感染导致睾丸肿大影响繁殖性能为特征，少数猪只感染可能呈现发热和神经症状，而其他猪则大多数不呈显症状。给养猪业造成巨大的经济损失。马属动物易感染，少数引起脑炎与神经症状，马是终末宿主。蚊是JEV的主要传播媒介，猪是该病毒在自然界中最重要的贮存与增殖宿主。乙型脑炎病毒主要在亚洲流行，而最近发现在南半球也有报道，这说明流行性乙型脑炎可能在世界范围内威胁着人类健康。
乙型脑炎病毒属黄病毒科，黄病毒属，为单链正链RNA病毒。基因组约11kb，包含一个大的开放阅读框架(ORF)，两端是5’端和3’端非编码区(UTR)。基因组5’端有帽子结构，但在3’端没有poly(A)尾。ORF编码含3432个氨基酸的前体蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为10个成熟蛋白，包含3个结构蛋白(C，PrM/M，E)，7个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。病毒粒子呈球形，直径约30nm，有囊膜。JEV只有一个血清型，在抗原性上与西罗病毒、墨罗河谷脑炎病毒、圣路易脑炎病毒等属同一血清群，存在抗原交叉反应。E蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白，在诱导机体免疫及病毒感染细胞过程中都起着重要的作用，也是基因工程疫苗和诊断试剂研究最常用的靶蛋白。但也是E蛋白在黄病毒科不同病毒间和血清学交叉反应最大。因此以E蛋白为靶蛋白进行的血清学诊断不能对不同黄病毒感染进行鉴别诊断。研究表明黄病毒科中乙型脑炎病毒，西尼罗病毒，登革热病毒的PrM/M蛋白在血清学上不存在交叉反应。所以将乙型脑炎病毒PrM/M蛋白作为血清学诊断检测的靶蛋白具有更好的特异性(Cardose M J，Wang S M，Sum M S，et al.Antibodiesagainst prM protein distinguish between previous infection with dengueand Japanese encephalitis viruses.BMC Microbiology，2002，2：9)。
乙型脑炎病毒PrM/M蛋白是病毒粒子的膜蛋白，该蛋白全长167氨基酸残基长，1～92aa为信号肽序列，在病毒粒子成熟的过程中被剪切掉，成为成熟的M蛋白。该蛋白分子量较小，属膜蛋白，在基因工程表达中因其对宿主细胞具有一定毒性而难以表达。那么鉴定出该蛋白的抗原表位，利用抗原表位进行诊断试剂研究较表达全长M蛋白更具优势。抗原表位中的线性表位是由蛋白抗原中连续的氨基酸残基组成，这种表位在变性蛋白中仍能被抗体识别。由于线性表位的特点，分析鉴定线性抗原表位的具体序列结构信息较为容易。同时线性抗原表位也是较容易被直接用于诊断、基因工程疫苗、合成肽疫苗等相关应用研究。在乙型脑炎病毒的主要抗原蛋白中关于抗原表位鉴定分析研究较多的是E蛋白。如Seif等(Seif S A，Morita K，Matsuo S，et al.Finer mappingof neutralizing epitope(s)on the C-terminal of Japanese encephalitis virusE-protein expressed in recombinant Escheriachia coli system.Vaccine，1995，13(16)：1515～1521.)通过构建4种分别表达E蛋白各个中和抗原决定簇的重组质粒，检测到了JEV特异性的抗原性和免疫原性，他们进一步证明仅有E蛋白中的一段27个氨基酸残基(373～399)的片段可以诱生中和抗体。该研究对E蛋白线性表位的确定最少长度为27氨基酸残基。Wu等(Wu C J，Huang H W，Tao M H，et al.Induction ofcross-protection against two wild-type Taiwanese isolates of Japaneseencephalitis virus using Beijing-1 strain DNA vaccine.Vaccine，2003，21(25-26)：3938～3945.)将JEV CH2195LA分离株的E蛋白结构域III(E292～402)的基因片段克隆到原核表达载体pET32a，在E.coli中表达重组融合，纯化融合硫氧化还原蛋白(TrxD3)与弗氏佐剂或阳离子脂质体混合免疫小鼠，结果说明TrxD3融合蛋白能够使小鼠产生中和抗体和免疫保护。该研究所分析出有中和活性的E蛋白片段长度为111氨基酸残基。这些研究所报道的线性表位序列过长，因为真实的线性抗原表位的长度一般为6至12氨基酸残基长，那么111氨基酸残基的片段中绝大部分序列是与表位无关的序列，或者该片段中根本不是一个线性表位，可能包含2个3个或多个线性抗原表位。即使是27氨基酸残基的片段中也可能包含多个线性抗原表位。Kutubuddin等(KutubuddinM，Gore M M，Banerjee K，et al.Analysis of computer-predicted antibodyinducing epitope on Japanese encephalitis virus.Acta Virol，1993，37(6)：417～428.)通过计算机软件预测74-CPTTGEAHNEKRAD-87是一个线性中和表位。Dewasthaly等(Dewasthaly S，Ayachit V M，Sarthi S A，et al.Monoclonal antibody raised against envelope glycoprotein peptideneutralizes Japanese encephalitis virus.Arch Virol，2001，146：1427～1435.)通过生物信息学软件预测Indian株的表位，制备了预测表位的单抗，通过ELISA、间接免疫荧光及动物实验证明149-SENHGNYSAQVGASQ-163为Indian株的线性中和表位。
本发明采用覆盖PrM/M蛋白重叠短肽融合表达技术，对PrM/M蛋白进行系统的抗原表位作图(Epitope Mapping)。本发明是首次全面对PrM/M蛋白进行线性抗原表位分析。通过融合表达21个相互重叠且覆盖全长PrM/M蛋白的短肽融合蛋白，利用JEV阳性血清进行ELISA与免疫印迹扫描，鉴定出了一个线性抗原表位。为了对这该表位的核心序列进行确定，针对该抗原表位设计依次从N端和C端进行氨基酸残基缩减的短肽，融合表达后于乙型脑炎抗血清进行结合分析。确定出抗原表位的核心序列，即该抗原表位的基本序列，只能向两侧延伸而两端都不能进一步缩减任何氨基酸残基的序列。
乙型脑炎病毒的各个毒株虽然常在毒力和血凝特性等方面有比较明显的差异，但抗原性差异不大，没有不同的血清型。乙型脑炎病毒在抗原上与墨罗山谷脑炎病毒(Murray Vally Encephalitis Virus，MVEV)，西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)，圣路易脑炎病毒(St.LouisEncephalitis Virus)有血清学交叉反应，在黄病毒科中属同一血清群。此外，JEV还与登革病毒(Dengue Virus，DV)存在血清交叉反应。这些病毒都是蚊媒性人兽共患传染病，各种病毒也慢慢突破了早期的流行地域范围，不断在世界范围内扩散对人类健康及公共卫生造成威胁。及时准确地检测与诊断对预防控制该类病毒病意义重大，那么要克服它们之间的血清学交叉反应，建立以上各种病毒病的特异的诊断方法是一项重要的工作。
发明内容
本发明的目的之一是提供乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位多肽。
本发明的目的之二是将所述的乙型脑炎病毒JEV PRM/M蛋白B细胞抗原表位多肽应用于制备成诊断或检测乙型脑炎病毒的试剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus)PrM/M蛋白B细胞抗原表位多肽，该抗原表位多肽氨基酸序列中含有SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39所示的任意一种或多种氨基酸序列。
优选的，所述的抗原表位多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：33、SEQID NO：38或SEQ ID NO：39所示的任意一种。
在本发明的一个实施方式中，可以对所述的抗原表位多肽的N端或C端进行化学修饰。所述的化学修饰为多肽链N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。
本发明中所述的抗原表位多肽可以通过固相多肽合成方法合成得到，也可以通过基因工程技术制备得到，这些都为本领域人员所通晓。
本发明将所鉴定出的抗原表位序列与存在血清学交叉反应的各黄病毒进行了蛋白质序列的同源性分析，对与乙型脑炎病毒抗原表位同源的其它黄病毒短肽也进行了融合表达，表达后进一步与乙型脑炎病毒阳性血清进行反应性分析。确定了部分乙型脑炎病毒PrM/M蛋白抗原表位可以用于乙型脑炎与其它黄病毒之间的鉴别诊断。将鉴定的表位合成多肽，单独或与载体蛋白偶联后包被ELISA板，可以用于乙型脑炎病毒抗体的检测。
本发明抗原表位多肽或其连接物可用于制备成检测抗乙型脑炎病毒JEV抗体或抗乙型脑炎病毒JEV多肽抗体的试剂。
将本发明所述的抗原表位多肽制备成抗原，至少包括所述的一个或全部抗原表位，这些多肽通过自身连接、相互连接或与载体连接。
检测乙型脑炎病毒JEV可以针对PrM/M蛋白抗原表位的单克隆抗体或针对抗原表位多肽的多克隆抗体，检测方法可以包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA、直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术，快速检测试纸条免疫膜层析技术等。
检测乙型脑炎病毒JEV抗体，包括野毒感染产生抗体，疫苗免疫产生抗体，母源抗体，抗JEV单克隆抗体等。检测方法可以包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA，快速检测试纸条免疫膜层析技术等。
蛋白质抗原B细胞抗原表位鉴定的方法有多种，如基因工程定点突变表达抗原蛋白分析法、噬菌体随机肽库筛选技术、合成多肽检测技术等。本项发明在鉴定抗原表位中主要采用的是基因工程技术多肽融合重叠(overlapping)表达JEV PrM/M蛋白，体外免疫反应检测多肽融合蛋白组与JEV抗血清的结合性鉴定抗原表位序列，进一步缩短与突变表达表位融合蛋白，鉴定抗原表位的序列结构；再应用合成多肽技术验证表位的正确性；用表位融合蛋白抗原免疫动物制备表位特异性单因子血清，分析抗原表位功能。
编码本发明B细胞抗原表位多肽(SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39所示氨基酸)核苷酸序列也属于本发明的保护范围；当然，含有上述核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也属于本发明所要保护的技术方案。
本发明的有益效果如下：
1.由本发明乙抗原表位多肽设计的免疫原免疫动物机体后能够产生针对JEV的抗体，利用针对PrM/M蛋白抗原表位的单克隆抗体或多克隆抗体可以检测乙型脑炎病毒JEV或乙型脑炎病毒PrM/M蛋白。
2.本发明的抗原表位多肽或其连接物能够检测乙型脑炎病毒JEV抗体或抗乙型脑炎病毒JEV多肽抗体。
附图说明
图1为表位多肽SEQ ID NO：33与GST融合表达蛋白与抗JEV血清Western blot检测结果。图中从左至右依次为：M，蛋白质分子量标准；1，GST对照；2，SEQ ID NO：33。
图2为表位多肽序列SEQ ID NO：33与不同毒株JEV同源序列的比较结果。
图3为表位多肽序列SEQ ID NO：33与不同黄病毒的同源序列比较结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1  JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位的筛选
根据JEV(SA14-14-2株)PrM/M蛋白氨基酸序列，设计一总数为20个的系列多肽，这些多肽相互重叠，且覆盖JEV PrM/M蛋白全长(1-167aa)。根据每一条多肽氨基酸序列，设计合成一对DNA链，将DNA链插入表达载体pGEX-6p-1与GST进行融合表达。融合表达的系列重组蛋白与抗JEV血清进行间接ELISA分析，分析JEV PrM/M蛋白抗原表位，结果见表1所示。
其具体流程如下：
设计多肽序列→合成编码多肽序列的DNA链→多肽融合表达载体构建→诱导表达→表达融合蛋白亲和层析纯化→表达产物与抗JEV血清免疫反应性检测→分析JEV PrM/M蛋白抗原表位。
表1  多肽融合蛋白与抗JEV血清间接ELISA反应结果

  编号  代号  位置(AA)  GST融合多肽序列  OD值  SEQ ID NO：1  M1  1～16  MKLSNFQGKLLMTINN  0.266  SEQ ID NO：2  M2  9～24  KLLMTINNTDIADVIV  0.219  SEQ ID NO：3  M3  17～32  TDIADVIVIPTSKGEN  0.271  SEQ ID NO：4  M4  25～40  IPTSKGENRCWVRAID  0.265  SEQ ID NO：5  M5  33～48  RCWVRAIDVGYMCEDT  0.237  SEQ ID NO：6  M6  41～56  VGYMCEDTITYECPKL  0.211  SEQ ID NO：7  M7  49～64  ITYECPKLTMGNDPED  0.181  SEQ ID NO：8  M8  57～72  TMGNDPEDVDCWCDNQ  0.212  SEQ ID NO：9  M9  65～80  VDCWCDNQEVYVQYGR  0.234  SEQ ID NO：10  M10  73～88  EVYVQYGRCTRTRHSK  0.264  SEQ ID NO：11  M11  81～96  CTRTRHSKRSRRSVSV  0.299  SEQ ID NO：12  M12  89～104  RSRRSVSVQTHGESSL  0.256  SEQ ID NO：13  M13  97～112  QTHGESSLVNKKEAWL  0.18  SEQ ID NO：14  M14  105～120  GST-VNKKEAWLDSTKATRY  1.051  SEQ ID NO：15  M15  113～128  DSTKATRYLMKTENWI  0.187  SEQ ID NO：16  M16  121～136  LMKTENWIIRNPGYAF  0.218  SEQ ID NO：17  M17  129～144  IRNPGYAFLAAVLGWM  0.206  SEQ ID NO：18  M18  137～152  LAAVLGWMLGSNNGQR  0.219  SEQ ID NO：19  M19  145～160  LGSNNGQRVVFTILLL  0.28  SEQ ID NO：20  M20  153～167  VVFTILLLLVAPAYS  0.229  对照  GST  0.22
注：包被抗原分别为多肽融合蛋白，GST为对照包被抗原，抗原包被浓度为10μg/ml；抗JEV血清为200倍稀释，TMB底物显色，读取450nm波长OD值。
结果分析表明，初步鉴定出的抗原表位序列为SEQ ID NO：14。进一步用Western blot分析，GST-M14融合蛋白能被JEV阳性血清识别，而GST对照则不能，表明M14(SEQ ID NO：14)是一个线性抗原表位(图1)。
实施例2  抗原表位的核心序列定位
根据实施例1中初步鉴定出的抗原表位序列，进一步设计小片段多肽，即设计从C端至N依次缩减一个氨基酸残基的系列多肽以及从N端至C端依次缩减一个氨基酸残基的系列多肽，融合表达后与JEV阳性血清进行间接ELISA分析，两端分别缩减至多肽融合蛋白丧失与JEVPrM/M蛋白单克隆抗体结合的能力时确定该表位的核心序列，反应结果见表2所示。
表2  多肽融合蛋白与抗JEV血清间接ELISA反应结果
  编号  代号  GST融合多肽序列  Western blot  检测结果  SEQ ID NO：14  M14  VNKKEAWLDSTKATRY  1.073  SEQ ID NO：21  M14-1  VNKKEAWLDSTKATR  1.032  SEQ ID NO：22  M14-2  VNKKEAWLDSTKAT  0.991  SEQ ID NO：23  M14-3  VNKKEAWLDSTKA  0.124  SEQ ID NO：24  M14-4  VNKKEAWLDSTK  0.055  SEQ ID NO：25  M14-5  VNKKEAWLDST  0.061  SEQ ID NO：26  M14-6  VNKKEAWLDS  0.058  SEQ ID NO：27  M14-7  VNKKEAWLD  0.058  SEQ ID NO：28  M14-8  VNKKEAWL  0.055  SEQ ID NO：29  M14-9  VNKKEAW  0.061  SEQ ID NO：30  M14-10  VNKKEA  0.069  SEQ ID NO：31  M14-11  NKKEAWLDSTKAT  1.064  SEQ ID NO：32  M14-12  KKEAWLDSTKAT  1.096  SEQ ID NO：33  M14-13  KEAWLDSTKAT  1.063
  SEQ ID NO：34  M14-14  EAWLDSTKAT  0.271  SEQ ID NO：35  M14-15  AWLDSTKAT  0.109  SEQ ID NO：36  M14-16  WLDSTKAT  0.191  SEQ ID NO：37  M14-17  LDSTKAT  0.071  对照  GST  0.056
注：包被抗原分别为多肽融合蛋白，GST为对照包被抗原，抗原包被浓度为10μg/ml；抗JEV PrM/M蛋白单克隆抗体为200倍稀释，TMB底物显色，读取450nm波长OD值。
结果分析表明，经两端依次缩减后确定的抗原表位核心序列为SEQID NO：33(M14-13)。
实施例3  抗原表位核心序列的突变分析
实施例2中确定的抗原表位核心序列与不同毒株乙型脑炎PrM/M蛋白序列比较(图2)以及与西尼罗病毒(WNV)，尤苏它病毒(UsutuVirus，UV)，昆津病毒(Kunjin virus，KUN)以及登革病毒(DengueVirus，DV)等黄病毒PrM/M蛋白进行同源性分析比较(图3)。
比较根据实施例2中确定的抗原表位核心序列与其它病毒的同源性，先取同源性大于50％的同源序列短肽，将其进行GST融合表达后Western blot分析与JEV阳性血清(SA14-14-2株)的反应性，反应结果见表3所示。
表3  多肽融合蛋白与抗JEV血清Western blot反应结果


注：检测抗原分别为表中所示多肽的GST融合蛋白，GST为对照抗原，抗JEV血清为200倍稀释。
结果分析表明表位SEQ ID NO：33(M14-13)序列为JEV不同毒株的共有序列、少数突变毒株同源序列如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39同样也能与JEV SA14-14-2株阳性血清作用。且该表位具有病毒特异性，其它黄病毒如WNV NY99株、KUN MRM61C株、UV的同源序列不能被JEV阳性血清所识别。
实施例4  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位的合成
根据JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位的氨基酸序列，应用固相多肽合成技术，采用自动多肽合成仪或人工多肽合成方法。固相树脂采用Fmoc保护的氨基酸Wang树脂或其它树脂，树脂经DMF溶涨、piperidine胶Fmoc保护后，根据氨基酸序列顺序，加入Fmoc保护的氨基酸，在HBTU存在情况下进行酰化反应。酰化反应完成后经过洗涤，再加入第二位的Fmoc-氨基酸进行酰化反应，并洗涤。如此循环，从多肽序列C末端超起始向N末端，按照顺序合成完整的多肽链。合成完成后，根据组成肽链氨基酸不同选取适当试剂用TFA法裂解肽链与树脂的连接并用冷乙醚沉淀TFA多肽，经脱盐纯化、LC-MS和HPLC分析鉴定后备用。在整个合成过程中，每个氨基酸酰化反应后可以应用Kaiser法或TMBS法测试反应的完成情况。为了便于使表位多肽和载体蛋白连接，在合成多肽时可以在多肽序列的N末端加一个半胱氨酸。
按照上述方法，分别合成了SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38、SEQID NO：39所示氨基酸序列的多肽片段。
实施例5  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位的化学修饰
按照实施例4的方法合成的多肽片段，其N末端为自然氨基修饰，C末端为自然羧基修饰。
N末端乙酰化修饰方法：按照以上介绍的多肽合成至最后一个Fmoc保护氨基酸偶联结束，并进行N末端Fmoc保护基团的去除，然后进行以下操作。取150μl乙酸酐和20μL EIPEA溶于4.8ml DMF中，充分混合并在冰浴中冷却。然后将以上混合液加入多肽合成反应管中反应5min。再依次用5ml DMF和二氯甲烷(DCM)洗2次，每次5min。氮气吹干后按照常规方法进行侧链保护基团的去除、裂解、纯化和鉴定。
C末端酰胺化修饰方法：C末端酰胺化的多肽合成时应选用树脂为Rink树脂。执行合成程序时应对树脂用DMF溶涨20min，然后从C末端第一位氨基酸开始执行合成程序，同前过Fmoc-wang树脂合成方法。
实施例6  乙型脑炎JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位与载体蛋白KLH和BSA的偶联：
载体蛋白KLH或BSA 4mg溶于0.5ml含5mM EDTA的PBS(pH7.2)缓冲液中，加入1.0mg连接剂Sulfo-SMCC，充分溶解后在室温孵育60min或37℃孵育30min。应用Sephadex G-25柱或透析方法脱盐纯化Sulfo-SMCC处理的载体蛋白，并用BCA法测定蛋白含量后备用。
称取实施例4所合成的表位多肽4mg，加入0.5ml重蒸馏水溶解多肽，然后将溶解后的多肽与Sulfo-SMCC处理的载体蛋白混合，4℃孵育2小时或反应过夜，分装备用。
实施例7  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位氧化实现自身的连接
含半胱氨酸的多肽可以通过巯基的氧化反应形成自身连接。一般情况下应用DMSO介导的氧化反应实现连接，根据多肽的酸碱性，氧化反应可以在微酸或微碱性条件下进行。
微酸性环境下的氧化反应：用适当浓度的醋酸溶解多肽，使多肽的浓度在0.5-1.5mM范围内，醋酸的终浓度不超过5％，用(NH4)2CO3调整多肽溶液的pH为6.0左右，加入10-20％的DMSO，25℃反应5-25h，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后，用1％TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽。
微碱性环境下的氧化反应：用0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.5，溶解多肽至终浓度1.0mM，加入浓度DMSO至终浓度1％，25℃反应过夜，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后用1％TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽。
实施例8  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测猪抗JEV抗体
用JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位SEQ ID NO：33合成表位多肽与载体的连接物为包被抗原，包被96孔聚苯乙烯酶标板。用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度为10μg/ml，按100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。然后用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗涤酶标板3次；含1％BSA的PBST封闭酶标板，37℃封闭2h，封闭后用洗液PBST洗板3次，立即用于检测或-20℃存放备用。
抗体检测操作程序：加入待检测猪血清(定性检测血清100倍稀释，抗体效价检测血清进行倍比稀释，同时设立阳性血清对照与阴性血清对照以及不加血清的空白对照)，37℃孵育1h，PBST洗液洗涤3次，每次3分钟；加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG(Goat-anti-pigIgG-HRP)，37℃孵育1h，PBST洗液洗涤4次，每次3分钟；加入HRP显色底物(TMB显色剂)，室温孵育5-15分钟观察显色反应；充分显色后，加入2M硫酸终止显色反应；用酶标仪测量450nm波长的吸光值；判定结果。结果见表4所示。
表4  表位多肽包被间接ELISA检测猪抗JEV抗体

注：包被抗原为抗原表位SEQ ID NO：33合成多肽与BSA的连接物，10μg/ml。该阳性血清效价为200。
判定结果时：空白对照及阴性血清孔吸光值小于或等于0.2，阳性血清对照孔吸光值大于0.4时结果有效；计算P/N值＝(检测孔OD值-空白对照孔OD值)/(阴性血清OD值-空白对照孔OD值)，P/N值等于或大于2时为阳性；以反应阳性血清的最大稀释倍数为该样品血清的抗体效价。
用同样方法分别以JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39合成表位多肽与载体的连接物为包被抗原检测猪血清中抗JEV抗体，检测结果见表5。
表5  表位多肽包被间接ELISA检测猪抗JEV抗体

注：包被抗原分别为抗原表位SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39合成多肽与BSA的连接物，10μg/ml。
实施例9  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测人抗JEV抗体
实施方法同实施例8，待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清为人血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG(Goat-anti humanIgG-HRP)。
实施例10  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测马抗JEV抗体
实施方法同实施例8，待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清为马血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗马IgG(Goat-anti horseIgG-HRP)。
实施例11  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测猪抗JEV抗体
用JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39中的一种或多种表位多肽与载体的连接物的混合物为包被抗原，以BSA为对照抗原。在硝酸纤维素膜上定点包被抗原，2μg/点，37℃固定30min，PBST洗涤6次，2％BSA中4℃封闭过夜，PBST洗涤6次后即可用于抗体检测。
检测抗体时，将待检测血清样品适当稀释后与抗原包被膜于37℃孵育30min，PBST洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG(Goat-anti-pig IgG-HRP)，37℃孵育1h，PBST洗液洗涤6次；加入AEC或DAB底物显色，室温避光孵育10min观察颜色反应。
结果判定时，以包被抗原点呈现棕红色颜色反应，对照抗原点不出现颜色反应者为阳性。
实施例12  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测人抗JEV抗体
实施方法同实施例11，待检血清为人血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG(Goat-anti human IgG-HRP)。
实施例13  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测马抗JEV抗体
实施方法同实施例11，待检血清为马血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗马IgG(Goat-anti horse IgG-HRP)。
实施例14  乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位免疫原的制备及免疫实验
乙型脑炎病毒JEV PrM/M蛋白B细胞抗原表位免疫原可以是合成抗原表位多肽，抗原表位多肽自身连接物，抗原表位多肽与载体连接物，抗原表位融合表位蛋白等。本实施例中用抗原表位多肽SEQ ID NO：33与BSA连接物为免疫原；首次免疫免疫原用弗氏完全佐剂和抗原乳化，小动物免疫抗原量为100μg每只；二三免时用弗氏不完全佐剂与抗原乳化，小动物免疫抗原量为50-100μg每只进行免疫。免疫途径可为皮下注射、皮内注射或肌肉注射。各次免疫期间隔两周。加强免疫两次后检测抗体水平。试验结果分别见表6。
表6  小鼠抗表位多肽M14-13抗体间接ELISA效价

注：包被抗原为抗原表位多肽SEQ ID NO：33，10μg/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至、等效，但都将落入本发明的保护范围内。
序列表
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>乙型脑炎病毒PrM/M蛋白B细胞抗原表位多肽及应用
<130>KLPI05688
<160>41
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>Japanese Encephalitis virus
<400>1
Met Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile Asn Asn
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<210>2
<211>16
<212>PRT
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<400>2
Lys Leu Leu Met Thr Ile Asn Asn Thr Asp Ile Ala Asp Val Ile Val
1               5                   10                  15
<210>3
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<212>PRT
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Thr Asp Ile Ala Asp Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly Glu Asn
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<212>PRT
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<212>PRT
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<212>PRT
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<400>7
Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro Glu Asp
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Thr Met Gly Asn Asp Pro Glu Asp Val Asp Cys Trp Cys Asp Asn Gln
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<212>PRT
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Cys Thr Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val Ser Val
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<400>12
Arg Ser Arg Arg Ser Val Ser Val Gln Thr His Gly Glu Ser Ser Leu
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Leu Ala Ala Val Leu Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Asn Gly Gln Arg
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<213>Japanese Encephalitis virus
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<213>Japanese Encephalitis virus
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<213>Japanese Encephalitis virus
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<213>Japanese Encephalitis virus
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<213>Japanese Encephalitis virus
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<213>West Nile virus
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