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1、(10)申请公布号 CN 103667449 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667449 A (21)申请号 201310548365.3 (22)申请日 2013.11.07 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国水产科学研究院淡水渔业研究 中心 地址 214081 江苏省无锡市滨湖区大浮镇戚 塘北村 1 号 (72)发明人 唐永凯 李建林 李红霞 俞菊华 徐跑 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 一种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光 PCR 。
2、方 法及引物组 (57) 摘要 本发明涉及一种吉富罗非鱼鱼种性别的实时 荧光PCR方法， 属于分子生物学技术领域。 本研究 通过选择吉富罗非鱼性别相关基因 AMH， 该基因 在雌雄鱼中表达量存在显著的差异。设计一对特 异的实时荧光PCR引物， 通过和成鱼卵巢AMH基因 的表达量进行比较来鉴定罗非鱼鱼种性别。本发 明所建立的方法具有特异性强、 可信度高， 可应用 于罗非鱼鱼种阶段的性别鉴定。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 (10。
3、)申请公布号 CN 103667449 A CN 103667449 A 1/1 页 2 1. 一种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光 PCR 方法， 包括如下步骤 ： 第 1 步、 提取吉富罗非鱼的 RNA， 反转录成 cDNA ； 第 2 步、 以吉富罗非鱼的 AMH 基因的正向和反向引物、 以及 -actin 管家基因的正向 和反向引物， 对反转录的 cDNA 进行实时荧光 PCR 扩增 ； 第3步、 通过双标准曲线法测定吉富罗非鱼的AMH基因的相对表达量， 如果鱼种性腺中 AMH 表达量比成鱼卵巢高 10 倍以上， 鱼种则为雄鱼， 如果小于或等于 10 倍， 鱼种则为雌鱼 ； 其中， AMH。
4、 基因的正向引物的序列如 SEQ ID NO.1 所示， 反向引物的序列如 SEQ ID NO.2 所 示 ； -actin基因的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示， 反向引物的序列如SEQ ID NO.4 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光 PCR 方法， 其特征在于 ： 所 述的第2步中实时荧光PCR扩增的程序是 ： 94 3min, 然后40个循环94 5s， 62 20s， 最后 72 3min， 4保存。 3. 根据权利要求 1 所述的鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光 PCR 方法， 其特征在于 ： 所 述的在第 3 步中， 双标准曲线法的标准曲线。
5、是以反转录的 cDNA 为模板， 进行 5 倍系列稀释， 选取 5 个浓度梯度进行实时荧光 PCR， 以 Ct 值为坐标， 以稀释倍数的对数为纵坐标， 获得相 对定量标准曲线。 4. 一种鉴别吉富罗非鱼性别的引物组， 其特征在于 ： 所述的引物组的一对正向和反向 引物的序列如 SEQ ID NO. 1 2 所示。 权 利 要 求 书 CN 103667449 A 2 1/4 页 3 一种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光 PCR 方法及引物组 0001 技术领域 0002 本发明涉及一种吉富罗非鱼鱼种性别的实时荧光 PCR 方法， 还涉及该方法所用的 引物组， 属于分子生物学技术领域。 0003 背。
6、景技术 0004 吉富罗非鱼属于鲈形目、 鲡鱼科， 罗非鱼属。由于它食性杂， 耐低氧， 生长快， 抗病 力强， 现已成为世界性的养殖鱼类。 在养殖过程中雌雄罗非鱼生长差异明显， 雄鱼比雌鱼生 长快， 常常导致出池规格相差悬殊， 从而降低了商品鱼的质量， 减少了经济效益。因此开展 吉富罗非鱼性决定机制研究， 探索吉富罗非鱼全雄育种技术， 对于罗非鱼养殖产业的发展 具有重要的经济效应和社会效应。 0005 在吉富罗非鱼性别决定机制研究中， 常常涉及到性别相关基因的克隆及其时空表 达研究。在时空表达研究中， 鱼种阶段是个关键期， 这时性别已经分化， 但仅凭肉眼观察很 难分辨雌雄鱼。 通过乳酸醋酸地衣。
7、红压片法可区分雌雄鱼， 但该方法费时费力， 也影响后续 实验的连贯性。因此迫切需要通过一种简便的方法来鉴定吉富罗非鱼鱼种阶段的性别。 0006 发明内容 0007 本研究通过选择吉富罗非鱼性别相关基因 AMH， 该基因在雌雄鱼中表达量存在显 著的差异， 设计一对特异的实时荧光PCR引物， 通过和成鱼卵巢AMH基因的表达量进行比较 来鉴定吉富罗非鱼鱼种性别。 0008 一种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光 PCR 方法， 包括如下步骤 ： 第 1 步、 提取吉富罗非鱼的 RNA， 反转录成 cDNA ； 第 2 步、 以吉富罗非鱼的 AMH 基因的正向和反向引物、 以及 -actin 管家基因的正向。
8、 和反向引物， 对反转录的 cDNA 进行实时荧光 PCR 扩增 ； 第3步、 通过双标准曲线法考察吉富罗非鱼的AMH基因的相对表达量， 如果鱼种性腺中 AMH 表达量比成鱼卵巢高 10 倍以上， 鱼种则为雄鱼， 如果小于或等于 10 倍， 鱼种则为雌鱼 ； 其中， AMH 基因的正向引物的序列是 ： 5 -3 GGAACGGGAACTGATACGAGATG(SEQ ID NO.1)， 反向 引物的序列是 ： 5 -3 AGCAGGGTCTCGCTGGAGGA(SEQ ID NO.2) ； -actin 基因的正向引物的序列是 ： 5 -3 ATCCGTAAGGACCTGTACGCC(SEQ 。
9、ID NO.3)， 反向引物的序列是 ： 5 -3 GTGGGGCAATGATCTTGATCTTC(SEQ ID NO.4)。 0009 进一步地， 第2步中实时荧光PCR扩增的程序可以是 ： 94 3min, 然后40个循环 94 5s， 62 20s， 最后 72 3min， 4保存。 说 明 书 CN 103667449 A 3 2/4 页 4 0010 进一步地， 在第3步中， 双标准曲线法的标准曲线是以反转录的cDNA为模板， 进行 5 倍系列稀释， 选取 5 个浓度梯度进行实时荧光 PCR， 以 Ct 值为坐标， 以稀释倍数的对数为 纵坐标， 获得相对定量标准曲线。 0011 有益。
10、效果 ： 本研究通过选择吉富罗非鱼性别相关基因 AMH， 该基因在雌雄鱼中表 达量存在显著的差异。设计一对特异的实时荧光 PCR 引物， 通过和成鱼卵巢 AMH 基因的表 达量进行比较来鉴定罗非鱼鱼种性别。 本发明所建立的方法具有特异性强、 可信度高， 可应 用于罗非鱼鱼种阶段的性别鉴定。 0012 附图说明 0013 图 1 是实施例第二部分中的 AMH 基因表达的标准曲线 图 2 是实施例第三部分中 -actin 基因表达的标准曲线 具体实施方式 0014 第一部分吉富罗非鱼 AMH 基因的测序 吉富罗非鱼血液基因组 DNA 提取， 设计引物、 PCR 扩增， 产物纯化， 转入载体， 蓝白。
11、斑筛 选， 质粒测序， 所设计的引物序列为 ： 正向 ： GCTGTGTGCATTTCAGGAGACA 反向 ： TGTCTCCTGAAATGCACACAGC 用此方法克隆所得吉富罗非鱼 AMH 基因含内含子的部分序列为 (SEQ ID NO.5) ： GCTGTGTGCATTTCAGGAGACACACAGTACGTACTCCTGACAGGAAAATCATCAGAGGGGAGTGTTAACGA CAGGTGGCATATTACGGCACAGACAAAACTGCCTCATATGAgtgagatatcatcttcttcattttatttccccatc tctggttcattgtgtaccctactt。
12、acatttcctctcattgtagAGCAAAACCTAAAAAGCATCTTGATTGGTGAAA AATCAGGAAGTAACATCAGCACGAGTCCACTTCTACTTTTCTCCGGGGGAACGGGAACTGATACGAGgtcagcccg gctttctttctgctgacattcactgtcgtcagagacgcgctcagctttggtttttatttttgctttcccagATGT GCTTCAGGCTCGCCCCCGGCATCTCTGCAAACCTCCTTCCTTTGTGAGATGAATCGCTTGCTGGGTGCTGTGCTC CCTCAGGAACACTTCGCG。
13、TCCCCTCCACTTCCTCTGGACTCCTTACAGTCTCTGCCTCCCCTCTCGCTTGGCTTA TCCTCCAGCGAGACCCTGCTGGCAGTAATGATCAACTCCACAGCTCCCACAGTCTTTGGCTTCACGAGTTGGGGC TCCGTGTTGCCGGTGTGGCACGGAGAGCTAGCCCTGTCTGCTGCAATGTTAGAGGAGCTCAGACAGAGACTCGAC CAGACTTTGGTGCAAATGACAGAAATAATCAGAGAGGAATAGGTTTCACCGGGAGCCAAGGAGAGCCTGGGGAGG CTCAAAGAACTGAG。
14、TGCATTACAGGAGAAAGA 其中， 大写字母为外显子， 小写字母为内含子， 下划线为 real tim PCR 引物设计时采 用的序列。PCR 扩增的反应条件为 ： 95 3min ； 30 循环 94 30s、 57 30s、 72 1min ； 72延长 8min ； 4度保存。 0015 然后根据该基因序列设计正向和反向实时荧光 PCR 扩增引物。 0016 第二部分吉富罗非鱼 AMH 基因标准曲线的建立 取吉富罗非鱼成鱼卵巢， 参照说明书， 用Trizol 裂解法抽提总RNA。 用1g总RNA， 以 Oigo dT Primer 和 Random 6 mers 为引物 (Ta。
15、kara, 大连 )， 根据 M-MLV(Takara, 大连 ) 使用说明进行反转录反应， 反应总体积为 10l。以反转录的 cDNA 为模板， 进行 5 倍系列 说 明 书 CN 103667449 A 4 3/4 页 5 梯度稀释， 选取选取 505-4共 5 个浓度梯度进行实时荧光 PCR 扩增， 引物见表 1。以 Ct 值 为坐标， 以稀释倍数的对数为纵坐标， 获得相对定量标准曲线。结果显示， 标准曲线方程为 y=-0.2874X+10.30， 其相关系数为 r2=0.973， 如图 1。 0017 表 1 实验中的实时荧光 PCR 引物 第三部分吉富罗非鱼 -actin 基因标准曲。
16、线的建立 取吉富罗非鱼成鱼卵巢， 参照说明书， 用 Trizol 裂解法抽提总 RNA。用 1g 总 RNA， 以 Oigo dT Primer 和 Random 6 mers 为引物， 根据 M-MLV 使用说明进行反转录反应， 反应 总体积为 10l。以反转录的 cDNA 为模板， 进行 5 倍系列稀释， 选取 5 个浓度梯度进行实时 荧光 PCR 扩增， 引物见表 1。以 Ct 值为坐标， 以稀释倍数的对数为纵坐标， 获得相对定量标 准曲线。结果显示， 标准曲线方程为 y=-0.2504X+7.51， 其相关系数为 r2=0.979， 如图 2。 0018 第四部分吉富罗非鱼鱼种的性别鉴。
17、定验证 通过乳酸醋酸地衣红压片法对吉富罗非鱼的性别进行确定， 随机选取吉富罗非鱼鱼 种雌、 雄鱼各三尾， 另取吉富罗非鱼成鱼雌鱼三尾。参照说明书， 用 Trizol 裂解法抽提总 RNA。用 1g 总 RNA， 以 Oigo dT Primer 和 Random 6 mers 为引物， 根据 M-MLV 使用说明进 行 RT 反应， 反应总体积为 10l， 然后以此 RT 液为模板进行实时荧光 PCR 扩增， 共 3 个重 复， 荧光染料为 SYBR Green I， 引物见表 1。反应条件为 ： 94 3min， 然后 40 个循环 94 5s， 62 20s， 最后 72 3min， 4保。
18、存。根据双标准曲线法方法计算鱼种雌鱼、 雄鱼、 以及 成鱼雌鱼的相对表达量。 0019 结果显示鱼种雌鱼和成鱼雌鱼 AMH 表达量无显著性的差异， 鱼种雄鱼 AMH 表达量 显著的高于成鱼雌鱼， 通过如下判定标准 ： 如果鱼种性腺中 AMH 表达量比成鱼卵巢高 10 倍 以上， 鱼种则为雄鱼， 如果小于或等于 10 倍， 鱼种则为雌鱼， 则判定准确率为 100%， 说明此 方法特异性强、 可信度高， 可应用于罗非鱼鱼种阶段的性别鉴定。 0020 表 2 吉富罗非鱼AMH在不同发育期性腺的相对表达量 ( 平均值 标准偏差 ) 鱼种雌鱼鱼种雄鱼成鱼雌鱼 相对-actin的初始模板量0.0050.0。
19、0092b12.171.18a0.0270.0031b 相对表达量124345.4 注 ： 同行数据不同上标字母表示差异显著 （P0.05） 。 表格中， 初始模板量是指AMH基因 与内参基因的相对表达量。相对值是指以鱼种雌鱼样本为参照， 鱼种雄鱼和成鱼雌鱼样本 说 明 书 CN 103667449 A 5 4/4 页 6 的相对表达量的相对值。 说 明 书 CN 103667449 A 6 1/1 页 7 SEQUENCE LISTING 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光 PCR 方法及引物组 无 4 PatentIn version 3.5 1 23 DNA 人工序列 1 ggaacgggaa ctgatacgag atg 23 2 20 DNA 人工序列 2 agcagggtct cgctggagga 20 3 21 DNA 人工序列 3 atccgtaagg acctgtacgc c 21 4 23 DNA 人工序列 4 gtggggcaat gatcttgatc ttc 23 序 列 表 CN 103667449 A 7 1/2 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103667449 A 8 2/2 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 103667449 A 9 。