一种重组艾塞那肽的生产工艺.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102618552 B (45)授权公告日 2014.08.20 CN 102618552 B (21)申请号 201210094557.7 (22)申请日 2012.04.01 C12N 15/16(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C07K 14/575(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (73)专利权人 东莞市麦亘生物科技有限公。

2、司 地址 523808 广东省东莞市松山湖留创园 15 号楼 306 室 (72)发明人 张严冬 李相鲁 孟建军 (74)专利代理机构 郑州中原专利事务所有限公 司 41109 代理人 张绍琳 孙诗雨 CN 101665799 A,2010.03.10,说明书实施例 1， 5， 附图 3. CN 101586138 A,2009.11.25, 说明书第 3-4 页 . KR 20100071769 A,2010.06.29, 全文 . CN 101511868 A,2009.08.19, 全文 . 天津大学等编.实验3-25基因工程菌发酵及 其蛋白药物 .制药工程专业实验指导 . 化学工 业出。

3、版社 ,2005,104 105. XU ZHI nan 等 .Effects of medium composition on the production of plasmid DNA vector potentially for humman gene therapy.Journal of Zhejiang University SCIENCE .2005,396-400. 张怀 . 人 Hepcidin 融合表达载体的构建、 在 大肠杆菌中的表达及制备研究 .中国博士学位 论文全文数据库 医药卫生科技辑 .2005,( 第 7 期 ),E059-23. Eng,J.,et al.AAB。

4、22006 exendin-4. Genbank .1993, Julius Bogomolovas， et al.Screening of fusion partners for high yield expression and purification of bioactive viscotoxins.Protein Expression and Purification .2008, 第 64 卷 16-23. (54) 发明名称 一种重组艾塞那肽的生产工艺 (57) 摘要 一种重组艾塞那肽的生产工艺， 通过对 pET-31b（+）进 行 了 改 造， 将 pET-31b（+）中 的 。

5、KSI 融合蛋白序列完全删除， 同时删除蛋氨 酸裂解位点 （ALWN 切割位点）和 C 末端 （多肽羧 基端的）组氨酸标记 （His6-tag）以及终止子 , 在删除的位置， 取代以蛋氨酸 +His6-tag+GB1 突变序列 + 肠激酶裂解序列， 然后构建工程菌 pET-31(b+)-Exendin-4/BL21(DE3)plays。 利 用 了 pET-31b(+) 本身的可以大规模， 高产量的生产 多肽的优点， 保留了它的功能强大的启动子， 克服 了目前其他生产工艺中该蛋白产物容易形成包涵 体的缺点， 利用了肠激酶的切割特性在目的蛋白 的 N 末端进行切割， 切割后的蛋白质完全是具有 天。

6、然序列的 Exendin-4。经过工程菌的发酵表达 和目的蛋白的纯化后得到重组艾塞那肽。产量可 以达到 500mg/ 升以上， 比目前最先进的工艺产量 提高了 20 倍， 且均为可溶性蛋白。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 毛颖 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书12页 附图4页 (10)授权公告号 CN 102618552 B CN 102618552 B 1/1 页 2 1. 一种重组艾塞那肽的生产工艺， 包括工程菌的构建、 工程菌的发酵表达和目的蛋白 的纯化， 其特征在于 ：。

7、 所述的工程菌的构建是按下述步骤进行的 ： （1） 重组 Exendin 4 多肽基因序列的人工合成 ： 根据大肠杆菌密码子偏爱性， 设计编 码 Exendin 4 的核苷酸序列， 改造为如 SEQ ID No.1 所示的目的基因 ； （2） MAG2010 质粒 ： 取 pET31b(+) 质粒， 将 pET31b(+) 中的 KSI 融合蛋白序列完全删 除， 同时删除蛋氨酸裂解位点和 C 末端组氨酸标记以及终止子， 在删除的位置， 取代以蛋氨 酸 +His6-tag+GB1 序列 + 肠激酶裂解序列， 将改造的 pET31b(+) 形成的新质粒重新命名为 Mag2010 ； （3）工程菌的。

8、构建 ： 将扩增后的 Exendin-4 序列切割并纯化， 然后克隆到改造好的 Mag2010 质粒中， 并在 C 末端添加双重终止子， 得到重组质粒 pET31b(+)-Exendin-4， 将 重组质粒 pET31b(+)-Exendin-4 以 CaCl2法转化受菌体 BL21(DE3) plys， 在 37下在 LB 培养基中进行培养， 收集菌体， 筛选阳性克隆， 作为重组 Exendin-4 融合表达的工程菌 pET31b(+)-Exendin-4/ BL21(DE3) plys ； 所述的工程菌的发酵表达包括下述步骤 ： （1） 挑单菌落到装有 30 mL 目标培养基中， 31， 。

9、200rpm 活化过夜 ； （2） 将 30mL 菌液接到 200 mL 2XYT 培养基中， 32， 200rpm 培养约 2.6 hr ； （3） 以 10的接种量， 接到 5 L MMBL 培养基中， 32， 240rpm 培养约 3 hr ； （4） 接到 60 L 发酵培养基中 ； （5） 控制生长期pH为6.8 ； 用搅拌速度及通气量使DO10% ； 待培养基中葡萄糖的浓度 降至 0.2g/L 时开始补料 ； 当 OD550达到 10 左右时加入 13 mL 1M IPTG 诱导， 终浓度为 0.2mM， 把 pH 缓慢调至 7.00， 继续培养 10 小时后结束。 权 利 要 求。

10、 书 CN 102618552 B 2 1/12 页 3 一种重组艾塞那肽的生产工艺 技术领域 0001 本发明属于生物多肽的合成技术领域， 具体涉及一种重组艾塞那肽的生产工艺。 背景技术 0002 糖尿病是继心脑血管疾病、 肿瘤之后的另一个严重危害人类健康的慢性非传染 性疾病， 近年来， 随着人们生活方式的改变， 糖尿病患病率呈急剧上升趋势。目前我国糖 尿病患者已逾 7000 万， 并且糖尿病患者增长率是欧美国家的 2 倍。2 型糖尿病 (Type 2 Diabetes， T2DM)是糖尿病的主体， 占糖尿病患者的90左右。 T2DM是由遗传和多种环境因 素相互作用而引起胰岛索分泌或作用缺陷。

11、。 其患病率较高， 尤以中老年人为多， 并呈现年轻 化趋势。 胰岛口细胞数目减少或分泌功能障碍是导致T2DM发病的中心环节。 治疗一般遵循 生活方式干预 ( 如饮食控制、 运动治疗等 )、 口服降糖药和联合使用胰岛素等方式。传统治 疗 T2DM 的药物的副作用都较大， 长期使用会因胰岛素分泌过度导致胰岛口细胞功能衰竭。 0003 近年来胰高血糖素样肽 1 （GLP1） 和 enendin 4 成为糖尿病治疗研究的热点。因 为它们具有在血糖浓度较高的情况下促进胰岛素分泌的特性， 而在血糖正常的情况下不发 挥作用， 不仅可使初治的型糖尿病患者血糖恢复正常， 而且对磺脲类药物治疗失效者也 有降血糖作。

12、用。 0004 Exendin-4 是一条 39 个氨基酸组成的直链多肽， 最初由南美巨蜥的唾液分离提取 获得。它的氨基酸残基与哺乳动物 GLP-1 序列有 53的同源性， 并且生物学效应也几乎完 全一致其与 GLP-1 的最大不同之处在于 N 端第 2 位的甘氨酸 (Gly) 耐血液中二肽基肽酶 （DPP- ） ， GLP-1的相同位置则为极易被DPP-切断的丙氨酸 （Ala） ， 故Exendin-4被吸收 入血后的半衰期较长 （t1/2 =9.7h ） 。Exendin-4 是一种强效 GLP-1 受体激动剂， 能模拟 GLP-1 这种内源性多肽的糖调控作用， 降低空腹和餐后血糖。艾塞那。

13、肽 （Exenatide） 的活性 主要通过与人体胰脏 GLP-1 受体结合而介导， 由环腺苷酸 （cAMP） 依赖和 细胞分化机制 引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。因为 Exendin-4 的氨基酸结构及生物活性与 GLP-1 均具有相关性， 故通常也被视为肠促胰岛素的一种。 由于Exendin-4的降糖作用时间较长， 延缓胃排空和抑制摄食冲动对肥胖病人体重的有益作用又有别于传统的降糖药物， 因此其 作为 2 型糖尿病治疗药物开发的潜力巨大。 0005 目前对 Exendin-4 进行的药物研究主要为制备工艺， 作用机制， 内分泌代谢病临 床， 分子药理学和药剂学研究。已上市的 Exend。

14、in-4 药物 （Exenatide） 采用的是多肽合成 法的制备工艺。 0006 化学合成成本高 （对原料氨基酸及仪器设备要求极高） 、 产量少， 而利用基因工程 生产 Exendin 4， 不仅可以实现工业化的大规模生产、 有效地降低生产成本， 而且对环境 影响小， 产品品质更安全。但用基因工程方法直接表达生产 Exendin-4 这样的 39 肽， 表达 水平低， 且容易降解， 可采用与载体蛋白 ( 如硫氧还蛋白等 ) 连结融合表达的方法。但这种 方法也存在融合蛋白分子中的目的多肽分子所占比例很小， 产量很低， 且融合蛋白裂解后 多肽种类很多， 分离纯化困难的问题。行之有效的增加基因的表。

15、达产物的方法是构建基因 说 明 书 CN 102618552 B 3 2/12 页 4 串联体， 根据目标基因的特点和表达产物的特性， 运用适当的分子生物学操作技术将目的 基因按一定的方式串联在一起， 置于表达载体启动子控制之下进行表达， 再将表达的串联 体产物用特定的物质 ( 酶或化学试剂 ) 裂解， 以获得目标肽单体。比如 pET-31b（+） 是一 个常用的生产多肽的质粒， 但是它用来生产多肽， 当初设计是为了避免多肽容易被大肠杆 菌体内的蛋白水解酶水解， 所以让目的多肽和 KSI 融合蛋白一起表达， 形成了包涵体， 这对 生产 Exendin-4 来说是个很大的缺点， 如果让 Exen。

16、din-4 先生成包涵体再复性会造成纯化 成本的大大提高和活性的难以恢复， 这已是重组艾塞那肽的产业化生产的瓶颈。 发明内容 0007 本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述技术问题， 提供一种重组艾塞那肽 的生产工艺。 0008 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 0009 本发明的重组艾塞那肽的生产工艺， 包括工程菌的构建、 工程菌的发酵表达和目 的蛋白的纯化， 所述的工程菌的构建是按下述步骤进行的 ： 0010 （1） 重组 Exendin 4 多肽基因序列的人工合成 ： 根据大肠杆菌密码子偏爱性， 设 计编码 Exendin 4 的核苷酸序列， 改造为如 SEQ ID N。

17、o.1 所示的目的基因 ； 0011 （2） MAG2010 质粒 ： 取 pET31b(+) 质粒， 切割掉 SEQ ID No.2 所示 KSI 融合基因片 段， 更换为 SEQ ID No.3 所示的基因， 删除限制性内切酶 AlwnI 酶切位点和蛋氨酸和后继序 列， 取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因， 切割掉组氨酸标记序列， 在 GB1 蛋白的前面 添加组氨酸标记， 在目的蛋白的羧基末端添加双终止子 ； 构建的质粒顺序为 ： 蛋氨酸编码 序列+6XHis-tag编码序列 + GB-1编码序列 + 肠激酶酶切位点编码序列 + 和目的蛋白的基 因 + 甘氨酸编码 + 双终止子 ； 00。

18、12 （3）工 程 菌 的 构 建 ： 按 照 启 动 子 -6X 组 氨 酸 -GB1-tag- 肠 激 酶 的 裂 解 位 点 -exedin-4- 双终止密码子 的顺序得到的基因片段， 利用 CloneEZ 试剂盒连接到 已经切割好的 MAG2010 质粒中， 得到重组质粒 pET-31(b+)-Exendin-4， 将重组质粒 pET-31(b+)-Exendin-4 以 CaCl2法 转 化 受 菌 体 BL21(DE3) plays， 在 37 下 在 LB 培 养基中进行培养， 收集菌体， 筛选阳性克隆， 作为重组 Exendin-4 融合表达的工程菌 pET-31(b+)-Ex。

19、endin-4/ BL21(DE3) plays。 0013 要使生物合成 Exendin-4 能进行扩大规模的生产应用， 关键之一是对发酵过程优 化， 最大可能的利用菌株 Exendin-4 高产能力， 以最经济的方式进行生产。 0014 一般来说， 生产可溶性蛋白时不能采用高密度发酵的方法， 因为这样容易形成包 涵体， 目前国内外利用的培养基大多为2XYT培养基或者LB培养基来进行培养， 利用的大多 是实验室内研究型的摇瓶法培养。 0015 本发明的工程菌的发酵表达包括下述步骤 ： 0016 （1） 挑单菌落到装有 30 mL 目标培养基中， 31， 200rpm 活化过夜 ； 0017 。

20、（2） 将 30mL 菌液接到 200 mL 2XYT 培养基中， 32， 200rpm 培养约 2.6 hr ； 0018 （3） 以 10的接种量， 接到 5 L MMBL 培养基中， 32， 240rpm 培养约 3 hr ； 0019 （4） 接到 60 L 发酵培养基中 ； 0020 （5） 控制生长期 pH 为 6.8 ； 用搅拌速度及通气量使 DO 10% ； 待培养基中葡萄糖 说 明 书 CN 102618552 B 4 3/12 页 5 的浓度降至 0.2g/L 时开始补料 ； 当 OD550达到 10 左右时加入 13 mL 1M IPTG 诱导， 终浓度为 0.2mM， 。

21、把 pH 缓慢调至 7.00， 继续培养 10 小时后结束。 0021 所述的目的蛋白的纯化步骤采用离子交换层析-柱层析-三明治型的亲和层析进 行分离和纯化 ； 该工程菌经过发酵、 纯化得到的重组艾塞那肽的产量达到500毫克/升的产 率。 0022 所述的三明治型的亲和层析包括亲和层析一、 酶裂解和亲和层析二， 具体步骤如 下 ： 0023 （1） 亲和层析一 ： 采用 GE 公司的 IgG- sepharose-fast flow column, 首先用 3 个 柱体积的 50 mM Tris， pH 7.5， 150 mM NaCI 的缓冲液平衡柱子， 然后用将用相同缓冲液透析 过的蛋白质。

22、上柱， 用 1 倍体积上述缓冲液洗然后用 5mM 乙酸钠， pH5.0 的缓冲液洗去未结合 的杂质， 接着用 500mM 乙酸钠， pH5.0 的缓冲液将目的蛋白洗脱下来， 收集、 浓缩， 用足量的 20mM Tris-HCl， 100mM NaCl， pH7.6 透析 12 小时 ； 0024 （2） 肠激酶处理 ： 1 l 的重组牛肠激酶轻链亚基在 20， 20mM Tris-HCl， 100mM NaCl， pH7.6 的条件下 8h 可以完全切割融合蛋白 ； 0025 （3） 亲和层析二 ： 将上述处理过的重组 Exendin-4 结合在镍柱上， 先用起始缓冲液 冲洗脱磷酸盐缓冲液， 。

23、保留洗脱组分， 浓缩， 冷冻干燥， 得到重组的艾塞那肽。 0026 由于艾塞那肽是一个分子量比较小的多肽， 并不适合用大分子蛋白的体系进行表 达， 所以我们采用专门用来改造后的生产多肽表达体系 ： pET-31b （+） 质粒 和 E. Coli (DE3) PlyS 进行生产， 采用这个体系有以下优点 ： pET-31b （+） 是一个生产多肽的质粒， 目的多肽 和 KSI 融合蛋白一起表达， 形成了包涵体， 可以避免生产的多肽被大肠杆菌体内的蛋白水 解酶水解， 但是这对生产Exendin-4来说是个很大的缺点， 如果让Exendin-4首先生成包涵 体的形式然后再复性会造成纯化成本的大大提。

24、高和活性的难以恢复， 所以我们对 pET-31b （+） 进行了改造， 将 pET-31b（+） 中的 KSI 融合蛋白序列完全删除， 同时删除蛋氨酸裂解位 点 （ALWN 切割位点） 和 C 末端 （多肽羧基端的） 组氨酸标记 （His6-tag） 以及终止子 , 在删除 的位置， 取代以蛋氨酸 + His6-tag+GB1 突变序列 + 肠激酶裂解序列， 我们将改造的 pET-31b （+） 形成的新质粒重新命名为 Mag2010， 有了这个质粒， 我们首先取得 Exendin-4 的原始序 列， 然后按照大肠杆菌对于遗传密码子的偏好进行了改造， 采用适合大肠杆菌表达的遗传 序列， 人工合。

25、成改造的 Exendin-4 的全序列， 然后克隆岛 PUC57 质粒中进行大规模扩增， 将 扩增后的 Exendin-4 序列切割并纯化， 然后克隆到改造好的 Mag2010 质粒中， 并在 C 末端 添加双重终止子， 这么做的好处是利用了 pET-31b(+) 本身的可以大规模， 高产量的生产多 肽的优点， 保留了它的功能强大的启动子， 克服了该质粒容易形成包涵体的缺点， 利用了肠 激酶的切割特性在目的蛋白的 N 末端进行切割， 切割后的蛋白质完全是具有天然序列的 Exendin-4。利用大肠杆菌 E.Coli BL21(DE3)PlyS 表达体系的原因在于 Exendin-4 没有需 要。

26、糖基化修饰等翻译后修饰， DNA 转录时也不需要转录后修饰， 所以特别适合用大肠杆菌体 系进行生产， 再加上我们克服了形成包涵体的问题， 而 E.Coli BL21(DE3)PlyS 的优点在于 可以大量表达外源蛋白， 而且耐外源蛋白等毒素的干扰。 0027 本发明通过连接GB1标记融合蛋白将艾塞那肽有90%的形成包涵体的可能性变成 了 90% 的形成可溶性蛋白。实验证明， 绝大部分重组产生的艾塞那肽都处于可溶蛋白中。 0028 在国内外进行的艾塞那肽表达的体系中， 很多人采用了 His6-Thioredoxin A 说 明 书 CN 102618552 B 5 4/12 页 6 (TrxA)。

27、 融合蛋白和 Exendin-4 进行融合表达， 融合蛋白分子量为 14.7+4.2=18.9kd, exendin 在融合蛋白中的比率为 4.2/18.9=22.2%. 我们采用了自身分子量较小的 GB1 和 Exendin-4 进行融合表达， 融合蛋白分子量为 14.7+4.2=18.9kd, exendin 在融合蛋白中的 比率为 4.2/11.9=35.3%。也就是说， Exendin-4 在融合蛋白中的比重大大增加了， 在类似的 体系下， 假如表达的融合蛋白总量相等， 那么 exendin-4 在我们的体系中产量是其他体系 的 1.59 倍。 0029 本发明采用GB1和His-ta。

28、g双标记的体系使得在纯化过程中既可以采用镍柱亲和 层析， 又可以采用 GB1 亲和层析， 相对于其他的纯化方法， 可以有更多的纯化选择方式。 0030 在现有的文献报道中， 产量很低， 最多的也就是28毫克/升的产量， 利用本发明的 发酵体系， 我们可以达到 500 毫克 / 升的产率， 这个产量为目前发酵工艺的 20 倍左右， 所以 规模化生产后可以大大降低成本。 对于艾塞那肽类的药物成本价格降低和药物的普及有着 难以估量的意义， 就像重组人胰岛素开发成功后对于胰岛素的普及那样有着重要的社会价 值和经济价值。 0031 本发明的生产工艺相对于目前的工艺有着显著的特点 ： 产量可以达到 500。

29、mg/ 升 以上， 比目前最先进的工艺产量提高了 20 倍， 且均为可溶性蛋白， 在生产过程中， 我们采用 了本公司独特具有自主知识产权的的发酵工艺， 产量大大提高， 我们采用的双重亲和纯化 工艺， 配合传统的纯化方法， 纯化效率有了极大的提高， 前期粗提取的纯化， 减轻了后继纯 化的压力， 降低了纯化的成本。 附图说明 0032 图 1 发酵过程中细菌生长曲线图。 0033 图 2 是发酵过程参数监测结果图。 0034 图 3 是质粒的稳定性分析结果图。 0035 图 4 是质粒的细胞内含量图。 0036 图 5 是活性细胞的检测结果图。 0037 图 6 是聚丙烯酰胺凝胶电泳图。 具体实施。

30、方式 0038 下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。 0039 一、 工程菌的构建 0040 （1） 重组 Exendin 4 多肽基因序列的人工合成 ： 根据大肠杆菌密码子偏爱性， 设 计编码 Exendin 4 的核苷酸序列， 改造为如 SEQ ID No.1 所示的目的基因 ； 合成后的基因 克隆进质粒 PUC57 中， 转化进大肠杆菌 DH5 中进行扩增， 然后用 EZ Bioresearch 公司的 质粒提取试剂盒进行纯化， 切割后的目的基因出纯化备用。 0041 （2） MAG2010 质粒 ： MAG2010 质粒 ： 取 pET31b(+) 质粒， 切割掉 SEQ ID N。

31、o.2 所示 KSI 融合基因片段， 更换为 SEQ ID No.3 所示的基因， 删除限制性内切酶 AlwnI 酶切位点和蛋氨 酸和后继序列， 取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因， 切割掉组氨酸标记序列， 在 GB1 蛋白的前面添加组氨酸标记， 在目的蛋白的羧基末端添加双终止子 ； 构建的质粒顺序为 ： 蛋氨酸编码序列+6XHis-tag编码序列 + GB-1编码序列 + 肠激酶酶切位点编码序列 + 和目 说 明 书 CN 102618552 B 6 5/12 页 7 的蛋白的基因 + 甘氨酸编码 + 双终止子。 0042 （3）工 程 菌 的 构 建 ： 按 照 启 动 子 -6X 组 。

32、氨 酸 -GB1-tag- 肠 激 酶 的 裂 解 位 点 -exedin-4- 双终止密码子 的顺序得到的基因片段， 利用 CloneEZ 试剂盒连接到 已经切割好的 MAG2010 质粒中， 得到重组质粒 pET-31(b+)-Exendin-4， 将重组质粒 pET-31(b+)-Exendin-4 以 CaCl2法 转 化 受 菌 体 BL21(DE3) plays， 在 37 下 在 LB 培 养基中进行培养， 收集菌体， 筛选阳性克隆， 作为重组 Exendin-4 融合表达的工程菌 pET-31(b+)-Exendin-4/ BL21(DE3) plays。 0043 亚克隆所用。

33、的质粒购自美国Novagen公司, 大肠杆菌DH5和BL21(DE3)PlyS 分 别购自北京索莱宝生物科技有限公司公司和红叶生物科技有限公司， 所用的限制性内切酶 购自大连宝生物 （Takara） , 肠激酶购自美国西格玛公司 （Sigma） ， 质粒提取试剂盒采用本 公司销售的美国 EZ Bioresearch 小量质粒提取试剂盒。 0044 二、 工程菌的发酵表达 0045 1、 种子活化 ： 0046 （1） 种子活化 ： 取冻存的工程菌划线在含 100ul/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上， 37培养 16 小时。挑选生长良好的单菌落， 接种于 20ml LB 培养液中 （含 A。

34、mp100ul/ml） ， 37培养过夜。 0047 （2）种子液制备 ： 取活化种子， 按 5接种量接种于 200ml 2XYT 培养液中 （含 Amp100ul/ml） ， 37培养 6 小时。 0048 （3） 5L 发酵罐发酵 ： 将种子液按 5接种量接种于装有 MMBL 培养基的发酵罐中， 37， 控制pH在7.0左右， 通过通气及转速控制溶氧在30。 OD600为20左右时， 加入IPTG 至终浓度为 0.2mM， 诱导 10 小时后下罐。离心， 收集菌体。 0049 2、 培养基配方 0050 （1） L B 液体培养基 （一级摇瓶） 0051 0052 （2） MMBL 液体培。

35、养基 ( 二级培养基 ) 说 明 书 CN 102618552 B 7 6/12 页 8 0053 0054 3、 发酵生产步骤 ： 0055 （1） 挑单菌落到装有 30 mL 目标培养基中， 31， 200rpm 活化过夜。将 30mL 菌液 接到 200 mL 2XYT 培养基中， 32， 200rpm 培养约 2.6 hr。 0056 （2） 以 10的接种量， 接到 5 L MMBL 培养基中， 32， 240rpm 培养约 3 hr。 0057 （3） 接到 60 L 发酵培养基中。 0058 （4） 控制生长期 pH 为 6.8 ； 用搅拌速度及通气量使 DO 10% ； 待培养。

36、基中葡萄糖 的浓度降至 0.2g/L 时开始补料。当 OD550达到 10 左右时加入 13 mL 1M IPTG 诱导 （终浓度为 0.2mM） ， 把 pH 缓慢调至 7.00， 继续培养 10 小时后结束。 0059 发酵记录见下表 说 明 书 CN 102618552 B 8 7/12 页 9 0060 说 明 书 CN 102618552 B 9 8/12 页 10 0061 实验结果 ： 0062 图 1 发酵过程中细菌生长曲线图。将 4ml MMBL 培养基倒入比色杯中， 选用 550nm 波长分光光度计上调节零点， 作为空白对照， 并对不同时间培养液从 0h 起依次进行测定， 。

37、对浓度大的菌悬液用新鲜的 MMBL 液体培养基适当稀释后测定， 使其 OD 值在 0.10. 0.65 以内， 经稀释后测得的 OD 值要乘以稀释倍数， 是培养液实际的 OD 值。 0063 发酵过程参数监测结果见图2。（1） 温度 ： 设定为32， 发酵过程中有轻微波动 （2） 转速 ： 起始转速设定为 250rpm， 转速与溶解氧联动， 当溶氧降低至设定最低值时， 转速开始 增加， 以保证发酵罐中的溶解氧浓度维持在一定浓度。 （3） pH ： 发酵罐灭菌后 pH 为 7.15， 接 种前调整为 6.8， 发酵 5hr 时 IPTG 诱导， pH 开始回升， 控制 pH 在 7.2 7.3 。

38、之间直至发酵 结束。 （4） 溶解氧 ： 发酵设置溶解氧 10， 与转速和通风量联动， 当溶氧降至最低值时， 通风 量增大， 转速开始增加， 以维持溶解氧浓度。 0064 质粒的稳定性分析结果见图 3。将含有质粒的单细菌培养细胞稀释 106倍， 取 10 毫升培养， 直到细胞浓度为 108 CFU/ml, 然后再用新鲜的培养基稀释 104- 106倍， 重复 说 明 书 CN 102618552 B 10 9/12 页 11 以上操作直到细胞完成 200 代非饱和生长， 为了保证细胞一直处于对数期生长， 细胞的浓 度用 OD600 来监控生长， 并且用平板计数来确定。 在每个稀释点， 稀释的培。

39、养细胞铺板 在 LBH agar 板上 （含 5-bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactoside） ， 用带有蓝色 Lac+ (plasmid-containing) 和白色的 white Lac (plasmid-free) 来比较数量的差异， 同时细 胞传代的数量也可以用来鉴定质粒的稳定性。 0065 质粒的细胞内含量见图4。 为了从侧面的方面考证细胞中质粒的含量， 将各个时间 点的发酵液离心， 得到菌体， 利用小量质粒提取试剂盒进行质粒抽提， 抽提得到的质粒在 1% 的 Agar 胶上进行检测， 10 小时内细胞中含有足量的质粒来表达所需蛋白的 mRNA。。

40、 0066 活性细胞的检测结果见图 5。将各个时间点的发酵液离心， 得到菌体， 利用细胞计 数器在显微镜下检测， 然后铺板进行平板培养， 培养得到的结果和显微镜检测的结果差异 比较可以得到死细胞数。 0067 三、 目的蛋白的纯化 0068 将60L发酵后的发酵液利用连续流离心机进行离心沉淀(8000rpm)， 得到5000g菌 体沉淀， 弃上清。所得菌体用磷酸盐缓冲液 (pH=7.4) 清洗 3 次， 清洗后的菌体进行破碎。 0069 破碎工艺 1 ： 超声波破碎 ： 0070 功率 60%, 工作 3 秒， 间隔 3 秒， 300 个循环， 直到超声液变得澄清透明为止， 离心 10， 00。

41、0 rpm 10 分钟， 去除沉淀 （未破碎的细胞， 细胞壁等） ， 所得组分均由 SDS-PAGE 进行检 测分析。 0071 破碎工艺 2 ： 低温高压破碎 0072 采用 JN-3000 低温超高压连续流细胞破碎机， 将连续流离心机和 JN-3000 低温超 高压连续流细胞破碎以联用， 可以解决菌体收集， 细胞破碎 - 去除破碎后的细胞碎片， 收集 上清 （含可溶性蛋白质） 的操作流程的全自动化， 大大节省了人力， 和时间。主要技术指标 ： 压力 200MPa 连续流 35ml/ 分 (2.1 升 / 小时 ) 电源 220V 1.5KW 破碎全程在水浴槽中进行， 加冰块。 0073 图。

42、 6 是聚丙烯酰胺凝胶电泳图。从发酵罐中取样 20 微升， 分别加入 2X 上样缓冲 液， 室温孵育 30 分钟， 上样， 在伯乐 Mini-3 电泳中进行凝胶电泳， 结果显示在分子量 11.92 附近出现明显的条带， 和预期的目的蛋白分子量相符。 0074 核酸杂质的处理 ： 0075 添加 20mg/L 的 DNase， RNase 进行水解核酸， 水解温度为 37， 孵育时间为 30min。 0076 硫酸铵沉淀 ： 0077 然后将破碎机核酸酶处理后的上清用梯度硫酸铵进行分级沉淀 ： 在不断搅拌中缓 慢加入所需的硫酸铵的用量， 硫酸铵的浓度分别为 （20%， 40%， 60%， 80%。

43、） ， 将沉淀后的重组 Exendin-4（40-80%） 重新溶解磷酸盐缓冲液 (pH=7.4) 中。 0078 离子交换层析 ： 0079 取5千克GE Healthcare life science 的阳离子交换柱 QSHP （GE Healthcare） ， 装 柱 , 先用磷酸盐缓冲液 (pH=7.4) 洗脱 5 个柱体积， 然后采用含有不同浓度 （0.1M-0.5M） 的 氯化钠的磷酸缓冲液 （pH=7） ,进行梯度洗脱 （3个柱体积/缓冲液。 所得组分均由SDS-PAGE 进行检测分析。 说 明 书 CN 102618552 B 11 10/12 页 12 0080 柱层析 ： 。

44、0081 根据Exendin-4融合蛋白的分子量在12 KD的特点， 将洗脱得到的融合蛋白利用 切相流浓缩， 上柱, 采用5KG的GE Healthcare life science 分子筛 Sephadex G-50 medium 进一步分离， 采用 15L 的磷酸盐缓冲液 （50mM, pH=7） 进行缓冲液， 洗脱体积为 3 个柱体积。 0082 酰胺化 ： 采用的酶为重组甘氨酸酰胺化单氧酶， 采用反应体系， 100 mM TES (N-trishydroxymethylmethyl-2-aminoethane sulfonic acid)， 4.7M 铜离子， 5.5mM 维生素 C 。

45、缓冲液 , 1mU/ml 甘氨酸酰胺化酶， pH 7.0, 反应温度为 37 C. 反应时间 ： 3 小 时。 0083 亲 和 层 析 工 艺 一 ： 采 用 GE 公 司 的 IgG- sepharose-fast flow column (GE Healthcare), 首先用 3 个柱体积的 50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCI 的缓冲液平衡柱子， 然后用将用相同缓冲液透析过的蛋白质上柱， 用1倍体积上述缓冲液洗然后用5mM 乙酸钠， pH5.0 的缓冲液洗去未结合的杂质， 接着用 500mM 乙酸钠， pH5.0 的缓冲液将目的蛋白洗脱 下来， 收集、 浓缩。

46、， 用足量的 20mM Tris-HCl， 100mM NaCl， pH7.6 透析 12 小时。准备酶水解。 0084 肠激酶处理 ： 0085 1 l的重组牛肠激酶轻链亚基在20， 20mM Tris-HCl， 100mM NaCl， pH7.6的条件 下 8h 可以完全切割融合蛋白。 0086 亲和层析工艺二 ： 将上述处理过的重组 Exendin-4 结合在镍柱上， 先用起始缓冲 液冲洗脱磷酸盐缓冲液 （50mM, pH=7） ， 保留洗脱组分， 浓缩， 冷冻干燥， 得到重组的艾塞那 肽。上述处理完以后采用增加缓冲液中咪唑浓度 （0.1-0.5M） 的方法将结合在柱子上的组 蛋白 -G。

47、B1 融合蛋白洗脱出来， 清洗柱子并对其按照说明书再生。 0087 除盐和肠激酶杂质 ： 0088 除盐工艺 1 ： 0089 根据Exendin-4蛋白的分子量在4.2 KD的特点， 将洗脱得到的目标组分浓缩， 上 柱 , 采用 GE Healthcare life science 分子筛 Sephadex G-25 medium 进一步分离， 利用磷 酸盐缓冲液 （50mM, pH=7） 进行缓冲液， 除盐。 0090 除盐工艺 2 ： 0091 采取切相流超滤的方式进行除盐。Exendin-4 蛋白的分子量在 4.2 KD, 比较适 合用超滤除盐和浓缩， 与一般超滤过程相似。 主要考察操。

48、作压力、 操作时间及料液流速对超 滤过程的影响， 为生产过程提供技术工艺参数 0092 Exendin-4 含量的测定 ： 0093 采用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 (BCA Protein Assay Kit)（Thermo Scientifi c Pierce ， 美国） ， 按照说明书操作步骤进行蛋白含量的测定。结果显示， 产量 1. BCA 工作液 配制 : 根据样品数量， 按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1） 配制适量 BCA 0094 工作液， 充分混匀。 0095 2. 根据需要取适量 BSA 蛋白标准， 加入去离子水稀释成 1mg/ml。

49、 （原液 5mg/ml） ， 并 混匀。 0096 注意 ： 原则上蛋白样品在什么溶液中， 标准品也宜用什么溶液稀释。 但是为了简便 起见， 也可以用 0097 去离子水、 0.9%NaCl 或 PBS 稀释标准品。稀释后的蛋白标准品也可以 -20长期 说 明 书 CN 102618552 B 12 11/12 页 13 保存。以下步骤中均默认采用去离子水， 可以根据条件选择使用稀释液。 0098 3. 标准曲线绘制 ： 取 8 个比色皿分别编号为 A-H， 按以下表格数据加入试剂 ：（此 方案工作线性范围为 50-1000ug/ml。 ） 0099 0100 最终体积 1200ul 0101 4. 振荡混匀后， 37放置 30 分钟。 0102 5. 用分光光度计测定 562nm 处的吸光值， 以不含 BSA 的光吸收值为空白对照。 0103 6. 以蛋白含量 （ g） 为横坐标， 吸光值为纵坐标， 绘出标准曲线。 0104 7. 样品测定 ： 将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度， 取 100 l 样品， 加入 1000 l BCA 0105 工作液， 混匀后 37放置 30 分钟， 然后以 A 号比色皿为对照， 测定样品吸收值 A562。 0106 8. 根据测得的吸收值， 在标准曲线上即。