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本发明公开了一株法夫酵母(Phaffia rhodozyma)YZUXHONG686CCTCC NO.M 208262及其应用。本发明的法夫酵母CCTCC NO.M 208262用于虾青素的生产，其营养条件简单，培养基成分采用工业大生产所用，工艺简便，虾青素产量高，有利于工业化生产。

1.  法夫酵母(Phaffia rhodozyma)YZUXHONG686 CCTCC NO.M 208262。

2.  权利要求1所述的法夫酵母YZUXHONG686 CCTCC NO.M 208262在生产虾青素中的应用。

法夫酵母YZUXHONG686及其应用
技术领域
本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一株法夫酵母菌株及其应用。
背景技术
类胡萝卜素(Carotenoids)是由8个类异戊二烯单位组成的一类碳氢化合物及其氧化衍生物。类胡萝卜素是自然界分布最为广泛的一类色素，也是最重要的色素，它们存在于整个植物界、所有进行光合作用的细胞组织中；同时也存在于一些细菌、真菌、藻类及动物之中。
近几年人们对类胡萝卜素抗氧化性质的了解越来越多，其需求也越来越多。根据美国商业通讯公司(BCC)对全球市场的分析报告，类胡萝卜素市场的增长将以每年2.9％的速度增加，从2004年的8.87亿美元增加到2009年的10亿美元。从自然界中分离鉴定出的600多种类胡萝卜素，约有40多种可为人类食用。被多数国家批准使用于食品、饲料、化妆品和药品的有10多种。由微生物发酵生产的仅有β-胡萝卜素、番茄红素和虾青素。据测算，全球每年对天然虾青素的需求量为水产市场750吨左右(按纯虾青素计)，人用市场上亿美元。而截至2005年底，全球的天然虾青素总产量不到4吨，仅为需求量的0.5％，全球虾青素的产量还远远不能满足市场需求，故价格很高，天然虾青素超过3000美元/kg。
法夫酵母(Phaffia rhodozyma)是真菌界、真菌门、粘菌亚门、担子菌纲、隐球酵母科、法夫酵母属的唯一的一个种，其繁殖方式为无性芽殖，于20世纪70年代初在美国阿拉斯加的高山和日本北海道一带山区落叶树的渗出液中分离得到的。1976年被命名为Phaffia rhodozyma，1995年部分菌株被发现有性循环，被重新定位于担子菌门(Xanthophyllomyces dendrorhous)。法夫酵母在担子菌纲的酵母中显得比较特别，主要表现在它能够发酵葡萄糖和其他糖类，并且含有虾青素作为主要色素(40％～95％)，余下的色素为：β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、链孢类胡萝卜素、番茄红素、海胆酮、β-羟基海胆酮、海藻花黄素等。
虾青素(Astaxanthin)，又名虾黄质，龙虾壳色素。其化学名称为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝素，属于叶黄素类(Xanthophylls)，是一种非维生素A源的在自然界中广泛分布的氧化胡萝卜素，具有脂溶性。纯虾青素是暗紫色针状结晶，具有光泽，熔点224℃，不溶于水及大多数有机溶剂，易溶于二氯甲烷、丙酮、DMSO、氯仿、二硫化碳等有机溶剂。自然界中常见的有三种构型，即3S，3′S；3R，3′S；3R，3′R。来源不同的虾青素其异构体不尽相同，分析表明，野生大麻哈鱼和红球藻中的虾青素主要是3S，3′S异构体；化学方法合成的虾青素主要成分为3R，3′S；而Phaffia rhodozyma中的虾青素全部为3R，3′R异构体。
虾青素可用于抗生物过氧化剂、抗癌剂、预防动脉硬化和心肌梗死、不育症、传染病等有关疾病；作为抗衰老的医药和食品保健品；用于防治眼科疾病，近似维生素A的特性，尤其对糖尿病、眼病的发病率有明显降低效果，可作为治疗糖尿病的辅助药物；其还能防治神经科疾病，虾青素具有保护中枢神经系统的能力，尤其是大脑和脊柱，能有效治疗缺血性的重复灌注损伤、脊髓损伤、帕金森(Parkinson)氏综合症，Alzheimer氏综合症等中枢神经系统损伤等。
虾青素作为脂溶性色素，具有艳丽的红色和很强抗氧化性能。在食品工业中，不仅能有效地起到保鲜、保色、保味、保质等作用，而且能为多类食品着色，增加食品的着色美感。在化妆品中，用虾青素复配，不仅可作为抗衰老、防晒的化妆品，同时还可作为如唇膏、口红等长时间保持着色。
用虾青素作水产品饵料能提高水生动物的免疫力、提高成活率。对于长期困扰养殖业经营者的水产品经常病死的问题，喂以含有虾青素的饵料是解决方法之一。另外，水生动物进食含有虾青素的饵料后，会将虾青素富集在皮肤、肉等组织中，这使它们的皮肤和肉的色泽加深，有利于销售，而他们的营养价值也因虾青素的含量增加而得到了提高。虾青素用于禽畜饲料可提高禽畜的免疫力和消炎能力，增强生育能力，提高禽畜产蛋率，而且会将虾青素富集在卵中，这样不仅蛋黄的颜色变深，蛋的营养价值也大幅度提高。
虾青素的来源包括人工合成和生物体来源两种。虾青素的人工合成较困难，而且同天然虾青素相比，人工合成的虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面存在显著差异，美国食品药品管理局(FDA)已禁止化学合成的虾青素进入保健食品市场。天然虾青素的来源主要有三种：水产品加工工业的废弃物、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和法夫酵母(Phaffiarhodozyma)。法夫酵母作为虾青素的主要色素来源，究其原因：在法夫酵母所产生的类胡萝卜素物质中虾青素是其主要一种成分；在培养过程中不需要阳光；能利用多种糖类；繁殖速度快，生产周期短，发酵工艺较为成熟，易于掌握。而且酵母本身是一种良好的饲料原料，营养价值较高。
法夫酵母的工业化生产受到限制主要有以下几种原因：原始菌株虾青素含量低，仅产生类胡萝卜素大约300～500μg/gCDW(Cell dry weight)；法夫酵母长时间低温(20～22℃)发酵，在生产过程中需冷却降温，消耗较多的能源；遗传性状稳定高产菌株的难以筛选。目前只有少数国外大公司例如RedStar Co.和Igene Biotechnology Inc.能够生产，国内在类胡萝卜素产品的开发方面进展缓慢，迄今还没有形成规模生产。遗传性状稳定、高产虾青素的法夫酵母获得为我国虾青素的工业化生产带来新的契机。
发明内容
本发明的目的是提供一法夫酵母菌株YZUXHONG686，及该菌株在虾青素生产中的应用。
本发明所所公开的菌株是法夫酵母(Phaffia rhodozyma)YZUXHONG686CCTCC NO.M 208262。该菌株遗传性状稳定能高产虾青素。
本发明所涉及的法夫酵母YZUXHONG686的形态学特征为：
个体形态特征：法夫酵母以卵圆形单细胞为主，大小3～8μm×4～14μm。在普通光学显微镜下法夫酵母细胞在对数生长期细胞大小相近，轮廓清晰，内容物呈小颗粒状均匀分布，在平稳期部分细胞体积变大，内容物聚集成团(见图1)。在荧光显微镜下观察法夫酵母细胞能够自发荧光(图2)，相较于原始出发菌株的荧光显微照片(图3)，该菌株细胞壁薄，利于细胞破壁提取虾青素的实施。
平皿培养特征：法夫酵母在平板上菌落培养一周，菌落表面上凸，菌落边缘整齐，菌落直径约1～2mm，高约0.5～1mm，颜色橘红至深红，菌落红色色度越深越有光泽，表明其所含虾青素的量越高。平板置4℃冰箱，菌落继续增大加厚，至2个月菌落直径可达5～6mm，厚1～1.2mm。菌落表面仍为红色菌落，但内部的菌群为土白色，这说明细胞产生类胡萝卜素需要大量氧气。
斜面培养特征：法夫酵母细胞在斜面上25℃条件下培养5～7天，颜色橘红至深红，随着传代次数的增多斜面红颜色逐渐减弱，表明菌株的遗传稳定性及产色素能力随着传代次数增加而减弱。斜面置4℃冰箱后，斜面颜色逐渐加深为黑红色。
液体培养特征：液体静止培养时，细胞在培养液表面形成一层红色菌膜。随着表面菌体的增多，部分老的细胞下沉。摇瓶培养时，将法夫酵母接种到摇瓶中时，当细胞生长进入对数生长后期以及平衡期之后，发酵液中细胞分布比较均匀的，发酵液混浊。静置之后，细胞受到重力作用而沉降下来。
本发明所涉及的法夫酵母YZUXHONG686的生理生化特征为：好氧菌，需在有氧环境中生长。最适生长pH6.0，色素产生的pH5.0。以葡萄糖或蔗糖作为碳源，以玉米浆干粉和NH₄)₂SO₄作为氮源，再加适量的酵母提取物、磷酸盐、镁盐可满足细胞生长和色素生成需要。
本发明所述的法夫酵母YZUXHONG686的选育技术路径：在斜面上挑取一环法夫酵母原始菌株接种到30mL的液体培养基中活化培养36～40h后离心弃上清，用无菌生理盐水悬浮，在UV30W、20cm、照射3min左右，菌液培养过夜，稀释涂在含有0.3％LiCl的平板上避光倒置培养8～10d，选择深红色菌落，活化培养36～40h后离心弃上清，用pH5.6的柠檬酸缓冲液悬浮，加入亚硝基胍(NTG)使其终浓度为100μg/mL～200μg/mL，30℃处理30min，菌液培养过夜，适当稀释涂在含有二苯胺、β-紫罗酮、2-脱氧-D-葡萄糖等抑制色素生成或细胞生长筛选剂的固体培养基中，平板在25℃避光倒置培养8～10d。选择深红色的细胞继续培养进行微波和⁶⁰Co物理辐射诱变，活化的菌液用无菌生理盐水悬浮，2450kHZ、900w家用微波炉每6秒照射18℃的菌悬液一次，取出菌悬液再冷却到18℃，累积照射3min；⁶⁰Co辐射剂量为4～5kGy，菌液培养过夜，适当稀释涂在含有一定浓度的二苯胺、β-紫罗酮、2-脱氧-葡萄糖等抑制色素生成或细胞生长的筛选剂的固体培养基中，平板在25℃避光倒置培养8～10d。每一批经过诱变挑选1000～1200个菌落接到斜面上，每代培养5～7d，大约到9代后大部分斜面由于颜色衰退而被淘汰，保留的斜面继续传代，选择经十几代甚至二十几代传代颜色依然深红的斜面进行下一轮诱变。每诱变处理一次，菌株斜面的传代的代数逐渐增加而颜色保持深红，表明菌株随着诱变次数增加遗传稳定性增加。
筛选到的菌株接种于装有30mL的液体培养基(葡萄糖35g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，yeast extract 1.5g/L，corn steepliquor 10g/L，pH5.25)中，23℃、170rpm培养48h，按10％的接种量接种到含有30mL液体培养基的250mL的三角瓶中，23℃、170rpm培养192h，收集细胞，DMSO破壁提取色素，HPLC外标法测定虾青素含量后，选产量及遗传稳定性好的菌株进入下一轮诱变筛选，经过多次物理和化学诱变配以筛选剂的筛选策略，获得法夫酵母YZUXHONG686。
本发明还提供了该菌株在生产虾青素中的应用：该菌株高产虾青素是建立在用葡萄糖作为碳源，用Yeast extract(OXOID LTD)、corn steep liquor(SIGMA LTD)提供氮源和可溶性蛋白、生长素和一些前体物质的基础上。如果要使该菌株在工业化大生产上生产虾青素，需要考虑降低工业化生产的成本。本发明首先在无糖基础培养基中以碳摩尔数相等的原则分别加入以下碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-果糖、甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯糖、无水乙醇、甘油等碳源中进行法夫酵母YZUXHONG686的培养，结果蔗糖和葡萄糖都可作为该菌株合适的碳源；在无氮培养基中以氮含量相等的原则分别加入有机氮源：酵母抽提物、酵母浸出汁、蛋白胨、牛肉膏、corn steep liquor、黄豆粉、食用干酵母粉、玉米浆干粉，23℃、170rpm培养8d，测定类胡萝卜素含量，结果显示酵母抽提物和玉米浆干粉作为合适的有机氮源。在碳源(葡萄糖或蔗糖)和有机氮(玉米浆干粉)培养基中加入无机氮源分别为：尿素、KNO₃、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、Ca(NO₃)₂.4H₂O，23℃、170rpm培养8d，测定类胡萝卜素含量，结果表明无机氮对法夫酵母产虾青素产量的影响接近。
综合上述结果，该法夫酵母菌株所用培养基成分为：葡萄糖或蔗糖，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄·7H₂O，KH₂PO₄，酵母抽提物，玉米浆干粉。
本发明所提供的法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma)YZUXHONG686营养要求简单，用于虾青素的生产，蔗糖和葡萄糖都可作为合适的碳源，硫酸铵或氯化铵作为合适的无机氮源，国产玉米浆干粉和酵母抽提物可替代进口Sigma的corn steep liquor和OXIOD的Yeast extract，工业化大生产的成本降低。
该菌株遗传性能稳定，传18代产虾青素能力保持高水平，生物量达10～11g/L，类胡萝卜素产量达48mg/L，虾青素含量1.7～1.9mg/g(HPLC)。该菌株虾青素产量高、遗传形状稳定，适于工业化生产。
附图说明
图1是法夫酵母YZUXHONG686光学显微镜照片
图2是法夫酵母YZUXHONG686荧光显微镜照片(144h)
图3是出发菌株的荧光显微照片(144h)
本发明中法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma)YZUXHONG686，该菌株于2008年12月25日被保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址在中国武汉大学，保藏编号CCTCC M 208262。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，不用来限制本发明的范围。
实施例1  遗传性状稳定高产虾青素的菌株的筛选
一、物理诱变
(1)取活化36～40h的新鲜菌体(出发菌株为Phaffia rhodozyma 2.1557，购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)置于装有玻璃珠的灭菌三角瓶中振荡3min，离心弃上清，生理盐水离心洗涤悬浮，取6mL的生理盐水菌悬液(10⁷个/mL)于无菌的培养皿中，置于磁力搅拌器上，30W紫外灯下20cm处，紫外灯预热30min后，打开皿盖和磁力搅拌器，照射3min后，离心弃生理盐水，培养液培养过夜，取菌液离心，生理盐水悬浮，适当稀释，涂布于含有0.3％LiCl平板上，25℃避光倒置培养8～10d。
(2)取活化36～40h的新鲜菌体置于装有玻璃珠的灭菌三角瓶中振荡3min，离心弃上清，生理盐水离心洗涤悬浮，以脉冲频率为2450MHz的900W的家用微波炉对18℃菌悬液进行辐射处理，每次照射菌液6s后使菌液冷却至18℃再进行照射，将照射时间累计到3min，离心弃生理盐水，培养液培养过夜，取菌液离心，生理盐水悬浮，适当稀释，涂布于平板上，25℃避光倒置培养8～10d。
(3)取活化36～40h的新鲜菌体置于装有玻璃珠的灭菌三角瓶中振荡3min，离心弃上清，生理盐水离心洗涤悬浮，⁶⁰Co辐射剂量为4～5kGy，取菌液离心，生理盐水悬浮，适当稀释，涂布于含有600mg/L β-紫罗酮、1.0g/L2-脱氧-D-葡萄糖、14～16mg/L二苯胺平板上，25℃避光倒置培养8～10d。
二、化学诱变
(1)用少量的甲酰胺溶解NTG，以0.1M pH5.6柠檬酸缓冲液配制NTG母液。
(2)取活化36～40h的新鲜菌体置于装有玻璃珠的灭菌三角瓶中振荡3min，离心弃上清，0.1M pH5.6柠檬酸缓冲液离心洗涤两次后，用柠檬酸缓冲液悬浮后装于无菌试管中，向试管中加入一定量的NTG母液使成终浓度为100～200μg/mL，均匀混合后，30℃保温振荡30min。
(3)柠檬酸缓冲液离心洗涤菌体两次脱毒后，培养液23℃、170rpm培养过夜，取菌液离心，柠檬酸缓冲液洗涤悬浮，适当稀释，菌液每经NTG处理一次后，依次涂布于含有0.3％LiCl、500～600mg/L β-紫罗酮、0.8g/L2-脱氧-D-葡萄糖、12mg/L二苯胺平板上，25℃避光倒置培养8～10d。
(4)诱变后的细胞经平板倒置培养后，挑选肉眼观察明显红的单菌落接在斜面固体培养基上(培养基组成：葡萄糖35g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，yeast extract 1.5g/L，corn steep liquor10g/L，琼脂粉2％，灭菌前pH5.25)，25℃5～7d传代培养，直至传9代后，大部分斜面由于遗传稳定性差而被淘汰，色素含量高遗传稳定性好的菌株在随后的传代培养中凸显出来。
(5)每次筛选平板大约660套，经过诱变挑选1000～1200个菌落接到斜面上传代培养，每代培养5～7d，选择经十几代甚至二十几代传代颜色依然深红的少数斜面，接种于装有30mL液体培养基23℃、170rpm活化培养，按10％接种量接于30mL液体培养基中，培养7～8d后，收集细胞，DMSO破壁提取色素，HPLC测定虾青素含量，选取含量最高的菌株进行下一轮诱变。
经多次筛选，传12代后得到高产虾青素的菌株YZUXHONG686。
实施例2  法夫酵母中类胡萝卜素和虾青素含量的测定
1.法夫酵母的培养
(1)取法夫酵母YZUXHONG686斜面一环接种至装有30mL培养液的250mL三角瓶中，23℃、170rpm培养48小时。
(2)按照10％接种量移种到装有30mL培养液的三角瓶中，23℃、170rpm培养192小时。
2.类胡萝卜素含量测定
细胞干重测定：吸取4mL的发酵液，5000rpm离心5min，等量蒸馏水洗涤一次，80℃烘干至恒重。
取4mL上述发酵液加入56℃二甲亚砜(DMSO)4mL，振荡10min，加入4mL丙酮振荡2min，加入4mL 20％NaCl溶液和8mL石油醚振荡1min后，5000rpm离心5min。上清以DMSO∶丙酮∶20％NaCl∶石油醚＝1∶1∶1∶2溶液的上清稀释6～7倍再以此作为空白测定OD₄₇₅。
计算公式如下：
发酵液总类胡萝卜素质量产量(mg/L)＝(A*V)/(E*V₀)
式中：A-吸光度读数；V-萃取液体积数，mL；E-消光系数，0.16；Vo-吸取的酵母定容液的体积，mL。
3.虾青素含量的测定
准确称取经冷冻干燥的25mg法夫酵母细胞，加入56℃二甲亚砜(DMSO)6mL振荡10min，加6mL丙酮振荡2min，加入6mL 20％NaCl溶液，然后加入18mL混合萃取溶剂正己烷/乙醚(1∶1)振荡1min后，5000rpm离心5min，旋转蒸发浓缩上层红色液体至溶剂消失后，先用少量氯仿溶解颗粒物，移至25mL的容量瓶中并用流动相定容。
精密称取5mg虾青素(Sigma公司)标准品，少量氯仿溶解后用流动相制成0.02mg/mL的标准溶液进行进样。按外标法计算。色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18：5μm，4.6×250mm；流动相：甲醇∶乙腈＝9∶1；流速0.8mL/min；检测波长475nm；柱温为室温，进样量为20μL。HPLC测得法夫酵母YZUXHONG686虾青素的产量为1.7～1.9mg/g。
实施例3  不同碳源对法夫酵母YZUXHONG686虾青素产量的影响
在无糖基础培养基((NH₄)₂SO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄1.5g/L，yeast extract 1.5g/L，corn steep liquor 10g/L)中以碳摩尔数相等的原则分别加入以下碳源(g/L)：葡萄糖35，蔗糖33.3，麦芽糖35，D-果糖35，甘露醇35.4，山梨醇35.4，D-阿拉伯糖35，无水乙醇26.9，甘油35.9，23℃、170rpm培养8d，测定类胡萝卜素含量，结果各培养基组成类胡萝卜素含量：蔗糖为48mg/L，葡萄糖和果糖都为45mg/L，从工业化生产成本的角度出发，选择蔗糖或葡萄糖为最佳碳源。
实施例4  不同氮源对法夫酵母YZUXHONG686虾青素产量的影响
1.有机氮的选择
在无氮培养基(葡萄糖35g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L)中以氮含量相等的原则分别加入有机氮源(g/L)：酵母抽提物4.5，酵母浸出汁6.25，蛋白胨3.5，牛肉膏5.6，corn steep liquor 21.4，豆粉7，食用干酵母粉6.4，玉米浆干粉6.5，23℃、170rpm培养8d，测定类胡萝卜素含量。结果各培养基组成类胡萝卜素含量：玉米浆干粉39mg/L，酵母抽提物35mg/L，corn steep liquor 30mg/L。选择玉米浆干粉和酵母抽提物作为合适的有机氮源。
2.无机氮的选择
在有机氮培养基(葡萄糖35g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，玉米浆干粉6.5g/L)中加入无机氮源分别为(g/L)：尿素1.34，KNO₃ 4.5，NH₄Cl 2.4，(NH₄)₂SO₄ 3，NH₄NO₃ 1.8，Ca(NO₃)₂.4H₂O 5.25，23℃、170rpm培养8d，测定类胡萝卜素含量。结果类胡萝卜素含量：NH₄Cl 42mg/L，NH₄NO₃41mg/L，(NH₄)₂SO₄ 40mg/L，从中可以看出无机氮对法夫酵母产虾青素的影响接近，选择哪一个作为培养基成分主要考虑它们的价格以降低工业化生产成本。
通过以上实验，确定了法夫酵母YZUXHONG686的工业生产用培养基成分为：葡萄糖或蔗糖，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄·7H₂O，KH₂PO₄，酵母抽提物，玉米浆干粉。