一种人外周血RORΓT转录本荧光定量PCR检测方法.pdf

本发明涉及一种人外周血RORγt转录本荧光定量PCR检测方法。其特征在于，首先设计特异性荧光定量引物，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的片断RORγt的质粒作为标准质粒绘制标准曲线，最后待测样品与标准质粒同时扩增，根据标准曲线确定样品目的基因的拷贝数。本发明由于利用了荧光定量PCR具有灵敏度高，特性强，无污染且实时、准确、快速的特点，从而填补了该基因在检测方法方面的空白，为研究TH17细胞分化提供了一个实用方法。

1、  一种人外周血RORγt转录本荧光定量PCR检测方法，其特征在于，首先设计特异性荧光定量引物，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的片断RORγt的质粒作为标准质粒绘制标准曲线，最后待测样品与标准质粒同时扩增，根据标准曲线确定样品目的基因的拷贝数。

2、  根据权利要求1所述的一种人外周血RORγt转录本荧光定量PCR检测方法，其特征在于，其中特异性荧光定量引物，其序列如下：
正向引物：5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3’
反向引物：5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3’
其中标准质粒所含目的基因序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3、  根据权利要求1所述的一种人外周血RORγt转录本荧光定量PCR检测方法，其特征在于，上述荧光定量PCR反应体系由下列组分构成：10μl 2×SYBR MIX，20μM正向引物、反向引物各0.2μl，0.12μl Taq酶，1μl标准质粒或样本cDNA，补充灭菌水至于20μl。

4、  根据权利要求1所述的一种人外周血RORγt转录本荧光定量PCR检测方法，其特征在于，PCR反应程序为94℃ 5min，94℃ 30sec，65℃ 30sec，72℃ 30sec，88℃ 10sec收集荧光，扩增40个循环，72℃ 7min。

一种人外周血RORγt转录本荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种人外周血单个核细胞RORγt转录本荧光定量PCR检测方法。属于生物技术领域。
背景技术
天然CD4⁺T细胞是包括许多亚群的异质性细胞。在体内微环境的作用下，能分化成不同类型具有不同免疫功能的细胞群。经典的观点认为它在体内分化为Th1和Th2两种细胞群体。Th1主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-β，主要介导细胞免疫。而Th2主要分泌TGF-β和IL-6，介导体免疫和抗寄生虫感染。后来又提出了一个新亚群---调节性T细胞(Treg细胞)，此细胞在体内调节Th细胞和Tc细胞使之处于动态平衡从而维护机体的免疫自身稳定。最近，Harrington等根据分泌的细胞因子不同又发现了一种新的CD4+T细胞亚群Th17细胞。此细胞分泌的效应因子主要是IL-17。尔后由此诱生出其它细胞因子如IL-6、TNF-α等、基质金属激酶(MMP)和趋化因子如MCP-1、MIP-2、CLCL-1、CXCL5等，从而引发炎症导致其他疾病如自身免疫性疾病、慢性炎症、肿瘤等。在研究Th17细胞的分化过程中，发现了其特异性转录因子孤独核受体(RORγt)，此转录因子在TGF-β和IL-6共同诱导下是IL-17基因表达的关键性调控因子。因此，检测此转录因子水平，可以间接地反映出IL-17基因的表达水平，从而为研究TH17细胞分化及其在自身免疫性疾病、慢性炎症、肿瘤等疾病中的作用有着重要的临床和科研意义。
转录因子的检测方法以目前技术手段主要有两种，其一是利用荧光标记的抗转录因子抗体，通过流式细胞仪从蛋白水平来检测。此方法尽管特异性强，但因操作过程中需要特异性抗体、流式细胞仪等试剂和仪器，代价较高且操作繁琐，故难于推广。其二是利用聚合酶链反应(PCR)技术从基因水平来检测。常规PCR只能定性且灵敏度低、污染强，而荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、无污染且实时、定量、快速等特点。但荧光定量PCR技术对特异性要求较高，目前，还没有实时、快速、准确地检测人外周血单个核细胞孤独核受体(RORγt)的检测方法。
发明内容
为了填补人外周血单个核细胞孤独核受体(RORγt)转录因子在检测方法方面的空白。本发明采用荧光定量PCR技术提供了一种能够实时、准确、快速检测人外周血单个核细胞孤独核受体(RORγt)转录因子的检测方法。
鉴于荧光定量PCR技术对检测过程中特异性要求较高，本发明是通过以下方法来提高检测特异性的：
(1)利用Oligo 6.0和Primer primer5.0软件设计多对引物，并进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，选取目的条带单一且产量最多的引物作为荧光定量PCR引物。
(2)优化PCR反应体系，如通过改变引物浓度、提高退火温度等方法减少非特异性扩增，提高特异性。
(3)根据引物二聚体和目的基因Tm值不同，按照张驰宇等推荐荧光定量PCR四步法收集荧光，排除引物二聚体对检测结果干扰，提高反应特异性。
本发明所采用的技术方案如下：
一种人外周血单个核细胞RORγt转录本荧光定量PCR检测方法，是：首先设计特异性荧光定量引物，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的片断的质粒作为标准质粒绘制标准曲线，之后将待测样品与标准质粒同时扩增，根据标准曲线确定样品中目的基因的拷贝数。
其中特异性荧光定量引物，其序列如下：
正向引物：5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3’
反向引物：5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3’
其中标准质粒所含目的基因序列如SEQ.ID.NO.1所示。
本发明检测方法中，所述荧光定量PCR反应体系由下列组分构成：10μl 2×SYBRMIX，20μM正向引物、反向引物各0.2μl，0.12μl Taq酶，1μl标准质粒或样本cDNA，补充灭菌水至于20μl。
本发明检测方法中，所述PCR反应程序为94℃ 5min，94℃ 30sec，65℃ 30sec，72℃30sec，88℃ 10sec收集荧光，扩增40个循环，72℃ 7min。
本发明利用荧光定量PCR技术提供了一种能够实时、快速、准确地检测人外周血孤独核受体(RORγt)的检测方法，从而填补了该转录因子在检测方法方面的空白。
附图说明
图1为荧光定量PCR标准品扩增的融解曲线
图中横坐标代表解链温度
图中纵坐标代表相对荧光强度
图中平行于纵坐标的直线所对应横坐标的温度为收集荧光信号的温度(88℃)
图中的曲线从上至下依次代表标准品拷贝数为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/μl及以灭菌水作为模板的空白对照的融解曲线
图2为荧光定量PCR标准品扩增的荧光信号图
图中横坐标代表循环数
图中纵坐标代表相对荧光强度
图中平行于横坐标的直线代表循环阈值
图中的曲线从左向右依次代表标准品拷贝数为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/μl及以灭菌水作为模板的空白对照的荧光信号
图3为荧光定量PCR扩增的标准曲线y＝-3.332log(conc)+34.521
图中横坐标代表标准质粒的拷贝数(copies/μl)
图中纵坐标代表循环数
注：conc为标准质粒或样本cDNA copies/μl
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步阐述本发明，但应当理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
材料：
Ficoll淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术有限公司)，Trizol(invitrogen公司)，逆转录试剂盒(ToYoBo公司)，SYBR GreenI Real Time PCR Kit(杭州BIOER公司)，rTaq酶、dNTP、10×Buffer、pMD18-T(TakaRa公司)，Rotor Gene RG6000荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett公司)，PMA、Inomycin(Sigma公司)
实施例1：
制备含RORγt目的基因的标准曲线
1.引物设计与合成
先从http://www.ncbi.nlm.nig.gov/GenBank中查找人RORC mRNA序列(NM001001523.1)，然后根据人RORC mRNA保守序列(CDS区域)为模板利用Oligo 6.0和Primer primer5.0软件设计引物，最后通过NCBI中BLAST从中挑选最佳引物送上海生物工程有限公司合成。引物、模板序列如下：
正向引物：5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3’(SEQ.ID.NO.2)
反向引物：5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3’(SEQ.ID.NO.3)
模板(SEQ.ID.NO.1)
5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACCTGCCTGAGGCTTCTGCCTGTCCCCCTGGCCTCC
TGAAAGCCTCAGGCTCTGGGCCCTCATATTCCAACAACTTGGCCAAGGCAGGGC
TCAATGGGGCCTCATGCCACCTTGAATACAGCCCTGAGCGGGGCAAGGCTGAGG
GCAGAGAGA-3’
2.刺激培养人外周血单个核细胞(PBMC)
取外周静脉血2ml经肝素抗凝后，用人的淋巴细胞分离液(Ficoll分离液)按照产品说明书操作分离单个核细胞。此单个核细胞用RPMI1640培养基(含终浓度为50ng/ml PMA和终浓度为1μg/ml离子霉素)调整细胞密度为1×10⁶/ml，放入24孔板，每孔1×10⁶细胞数，于5％CO₂ 37℃刺激培养，5h后收集细胞。
3.提取人外周血单个核细胞总RNA
收集上述经刺激培养后的外周血单个核细胞。加入细胞裂解液Trizol，裂解细胞，然后按照Trizol说明书提取总RNA。
4.逆转录单个核细胞总RNA
利用逆转录酶MMLV将上述人外周血单个核细胞总RNA逆转录成cDNA。逆转录反应体系为：4μl 5×RT Buffer、2μl dNTP mixture(各10mM)、1ul RNase Inhibitor(10U/μl)、1μl oligo(dT)₂₀随机引物、1μl逆转录酶(ReverTra Ace)、1μg cDNA模板，其余用Rnase Free H₂O补足至20μl，于PCR仪上42℃ 20min、99℃ 5min、4℃ 5min。
5.构建标准质粒
1)PCR条件优化：在20μl反应体系中以前述的cDNA为模板，加入dNTP、10×Buffer、前述特异性上、下游引物、rTaq酶和灭菌水以不同的退火温度扩增30个循环，PCR反应结束后取5μl产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳，最后EB染料染色，凝胶成像仪上观察。取目的条带最亮而又无非特异性条带的退火温度作为最佳退火温度。
2)T-A克隆：按上述的PCR反应条件扩增RORγt基因，PCR产物经纯化后，同pMD18-T载体(2692bp)按一定的比例混合，于16℃连接30min，然后该连接产物转化感受态细胞DH5α菌。根据蓝白斑筛选挑取阳性克隆。然后用碱裂解法抽提质粒，通过PCR和酶切鉴定，如鉴定阳性，则送公司测序。
3)稀释标准质粒：测定上述测序正确的阳性质粒的核酸浓度，并计算出其拷贝数/μl，然后将阳性质粒先稀释成1×10¹⁰copies/μl，然后按10倍依次倍比稀释成1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³copies/μl。
6.制定标准曲线
以上述稀释的标准质粒作为模板，利用SYBR GrrenI能嵌合到双链DNA，结合荧光定量PCR仪能够实时检测荧光强度的特点来制定标准曲线。荧光定量PCR反应体系如下：在20μl反应体系中加入稀释的标准质粒各1μl、10μl 2×SYBR MIX、特异性上、下游到物(20μM)各0.2μl、Taq酶0.12μl，其余用灭菌水补足至20μl，在荧光定量PCR仪上94℃ 5min、94℃ 30sec、65℃ 30sec、72℃ 30sec、88℃ 10sec(收集荧光--此步骤为基于SYBR GrrenI的荧光定量PCR检测的四步法，即在通用的三步法延伸之后增加一个短暂的荧光收集步骤以消除引物二聚体对检测结果的干扰)，扩增40个循环，72℃7min，最后进行融解曲线分析以确定PCR反应的特异性。
标准品的融解曲线图参见图1，标准品的荧光信号图参见图2，标准品的标准曲线图参见图3。
样本外周血单个核细胞RORγt转录本的检测：
外周血单个核细胞按前述的方法制备成cDNA，然后与标准质粒同时进行PCR反应，最后根据标准曲线来确定样本中RORγt转录本的拷贝数。
正常人(ND)和胃癌患者(GC)外周血单个核细胞RORγt转录本的检测
10例正常人和10例经胃镜或手术病理证实的胃癌患者外周血单个核细胞RORγt转录
本相对表达(以β-actin作为内参照基因)的检测结果如下：

SEQUENCE LISTING
<110>江苏大学
<120>一种人外周血RORγt转录本荧光定量PCR检测方法
<160>3
<210>1
<211>170
<212>DNA
<213>人(Homo)
<400>1
cctgggctcc tcgcctgacc tgcctgaggc ttctgcctgt ccccctggcc tcctgaaagc     60
ctcaggctct gggccctcat attccaacaa cttggccaag gcagggctca atggggcctc    120
atgccacctt gaatacagcc ctgagcgggg caaggctgag ggcagagaga               170
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cctgggctcc tcgcctgacc                                                 20
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tctctctgcc ctcagccttg cc                                              22