技术领域
本发明属于生物活性肽领域，具体涉及一种狭鳕鱼皮活性寡肽及其合成方法和应用。
背景技术
生物体的遗传基因被存储在多聚核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，般超过10个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称做寡肽。目前发现最小的功能小肽只有2个氨基酸，通常较为常见的是4个以上的功能小肽。
随着我国海洋渔业的发展，水产品加工过程会产生大量的鱼皮、鱼骨、内脏等废弃物，狭鳕鱼是生活在北太平洋海域的一种低温型鱼类，我国狭鳕鱼年加工量约50万吨，因此会产生大量狭鳕鱼皮等废弃物，干鱼皮含70％胶原蛋白，胶原多肽是以胶原组织为原料。近年来，水产品胶原蛋白的研究成为国内外热点，但对狭鳕鱼胶原多肽的研究鲜有报道。樊洁等2013年在青岛大学医学院学报中公开了狭鳕鱼皮胶原多肽理化性质研究，其主要研究5种制备工艺获得的狭鳕鱼皮胶原多肽的理化性质。但是，对于狭鳕鱼皮多肽在预防治疗疾病等发明的研究未见报道，并且缺乏报道该类多肽的人工合成方法。
发明内容
为解决现有狭鳕鱼皮胶原多肽具体应用研究缺乏的问题，本发明提出一种狭鳕鱼皮活性寡肽，该活性寡肽不仅序列清楚，而且具有良好的医学功效。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种狭鳕鱼皮活性寡肽，所述寡肽的氨基酸序列为Pro-Hyp或者Gly-Pro-Hyp。
本发明的另一个目的是提供一种狭鳕鱼皮活性寡肽在制备预防与治疗骨质疏松药物方面的应用。
进一步，所述药物为注射液或者口服液。
本发明的另一个目的是提供一种狭鳕鱼皮活性寡肽在制备预防与治疗关节炎药物方面的应用。
进一步，所述药物为注射液或者口服液。
狭鳕鱼皮活性寡肽的合成方法，所述Pro-Hyp的合成采用固相合成法，包括以下步骤：
1)树脂预处理：将Fmoc-Hyp(tBu)-Wang树脂在DCM中搅拌，使其充分溶胀；
2)脱除Fmoc保护基：在溶胀的树脂中加入哌啶以及DMF混合溶液；
3)连接子缩合：将等摩尔比的Fmoc-Pro-COOH、HBTU、HOBT、DIEA完全溶解于DMF中，混匀后加入步骤2)脱除Fmoc基团保护的树脂中进行反应；
4)茚检：将步骤3)缩合反应结束后的溶剂抽干，用DMF洗涤，用茚三酮检验无色，按照步骤2)方法脱除Fmoc保护基，得到脱除保护的肽树脂；
5)肽链从树脂上切割：用95wt％TFA水溶液酸化树脂，反应2-3小时，过滤得到滤液，向滤液中加入乙醚析出，得到多肽粗品。
进一步，所述步骤5)之后还包括对多肽粗品进行高效液相色谱进行纯化。
狭鳕鱼皮活性寡肽的合成方法，所述Gly-Pro-Hyp的合成采用固相合成法，包括以下步骤：
1)树脂预处理：将Fmoc-Hyp(tBu)-Wang树脂在DCM中搅拌，使其充分溶胀；
2)脱除Fmoc保护基：在溶胀的树脂中加入哌啶以及DMF混合溶液；
3)连接子Pro缩合：将等摩尔比的Fmoc-Pro-COOH、HBTU、HOBT、DIEA完全溶解于DMF中，混匀后加入步骤2)脱除Fmoc基团保护的树脂中进行反应；
4)第一次茚检：将步骤3)缩合反应结束后的溶剂抽干，用DMF洗涤，用茚三酮检验无色，按照步骤2)方法脱除Fmoc保护基，得到脱除保护的Pro-Hyp肽树脂；
5)连接子Gly缩合：将等摩尔比的Fmoc-Gly-COOH、HBTU、HOBT、DIEA完全溶解于DMF中，混匀后加入步骤4)脱除保护的Pro-Hyp肽树脂中进行反应；
6)第二次茚检：将步骤5)缩合反应结束后的溶剂抽干，用DMF洗涤，用茚三酮检验无色，按照步骤2)方法脱除Fmoc保护基，得到脱除保护的Gly-Pro-Hyp肽树脂；
7)肽链从树脂上切割：用95wt％TFA水溶液酸化步骤6)的肽树脂，反应2-3小时，过滤得到滤液，向滤液中加入乙醚析出，得到多肽粗品。
进一步，所述步骤7)之后还包括对多肽粗品进行高效液相色谱进行纯化。
本发明的再一个目的是提供一种狭鳕鱼皮活性寡肽的分离方法，所述Pro-Hyp与Gly-Pro-Hyp采用高效液相色谱梯度洗脱方法进行分离，具体条件如下：色谱柱：venusic ASB-C18(250mm×4.6mm，5um)，柱温：40℃，流动相A为0.1wt％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为0.1wt％三氟乙酸的水溶液，流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；梯度洗脱第一阶段的时间为0-20min，流动相A的比例为2％-22％，流动相B的比例为78％-98％；梯度洗脱第二阶段的时间为20.1-25min，流动相A的比例为100％；梯度洗脱第三阶段的时间为25.1-35min，流动相A的比例为2％，流动相B的比例为98％。
本发明中的HBTU的中文名称为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，HOBT的中文名称为1-羟基苯并三唑，DIEA的中文名称为N,N-二异丙基乙胺，DMF中文名称为二甲基甲酰胺。
本发明有益效果：
1、在对地塞米松损伤骨细胞OCN蛋白表达量研究，狭鳕鱼皮活性寡肽蛋白表达量较模型组明显升高，并呈剂量依赖性，提示活性寡肽能有效拮抗地塞米松致成骨细胞的损伤，促进其成熟和分化。
2、经统计分析模型组血液上清中Pro-Hyp的含量较正常组显著降低(p<0.05)，预防给药组中Pro-Hyp的含量较模型组显著升高(p<0.01)，提示Pro-Hyp可能对抗地塞米松导致的损伤具有一定的自我修复作用。
3、Pro-Hyp与Gly-Pro-Hyp采用高效液相色谱梯度洗脱方法进行分离，分离效果好，回收率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Western Blot检测组成骨细胞中OCN蛋白表达结果图；
图2为Gly-Pro-Hyp粗产品第一次高效液相色谱图谱；
图3为Gly-Pro-Hyp粗产品第二次高效液相色谱图谱；
图4为Pro-Hyp粗产品第一次高效液相色谱图谱；
图5为Pro-Hyp粗产品第二次高效液相色谱图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
狭鳕鱼皮活性寡肽对地塞米松损伤成骨细胞修复的研究
经10-5mol/L地塞米松损伤成骨细胞48h后，其细胞存活率较正常组显著降低，仅为正常组的50.67％，(P<0.05)；将10μmol/L地塞米松拮抗剂(RU-486)提前2h预孵育成骨细胞，该组细胞存活率较模型组显著性升高，为86.82％(P<0.01)；狭鳕鱼皮胶原蛋白肽在实验剂量下均能提高细胞存活率(P<0.01)，但组间差异无显著性(P>0.05)；小分子肽组提高成骨细胞存活率高达139.47％，远高于胶原蛋白肽三个剂量组(P<0.01)，分析认为胶原蛋白肽的活性分子为三肽Gly-Pro-Hyp，结果见表1。
表1 胶原蛋白肽对成骨细胞存活率作用
和正常组比，*P<0.05；分别和模型组比，**P<0.01；分别和三肽组相比，##P<0.01。
利用Western Blot检测OCN蛋白表达，地塞米松模型组成骨细胞OCN蛋白表达量较正常组显著降低(P<0.05)，经胶原蛋白肽(三个剂量)保护48h后，该蛋白表达量较模型组明显升高(P<0.05)，并呈剂量依赖性，提示胶原蛋白肽能有效拮抗地塞米松致成骨细胞的损伤，促进其成熟和分化；Gly-Pro-Hyp预保护48h组，OCN蛋白表达量较胶原蛋白肽组显著升高(P<0.01)，见图1。图1中和正常组比，*P<0.05；分别和地塞米松模型组比，#P<0.05，##P<0.01；分别和三肽组相比，**P<0.01。折算临床用量：以狭鳕鱼皮胶原蛋白肽分子量 3000Da计，Gly-Pro-Hyp分子量为289。临床服用胶原蛋白肽5-10g，根据高效液相色谱法检测结果，折算为小分子活性肽量为2-4g。这里面OCN的全称为Osteocalcin，中文名称为骨钙素。
实施例2
血清Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp含量的测定结果
经统计分析模型组血液上清中Pro-Hyp的含量较正常组显著降低(p<0.05)，预防给药组中Pro-Hyp的含量较模型组显著升高(p<0.01)，提示Pro-Hyp可能对抗地塞米松导致的损伤具有一定的自我修复作用；另外预防给药组中Gly-Pro-Hyp的含量也较模型组显著性升高(p<0.01)，而模型组较正常组显著降低(p<0.05)，提示狭鳕鱼皮胶原蛋白肽可能通过转化为Gly-Pro-Hyp的形式被吸收，详见表2。
表2 大鼠各组血清中Pro-Hyp含量
和正常组比，#P<0.05，和模型组比，**P<0.01。
实施例3
Gly-Pro-Hyp合成工艺：
1)、将购买好的Fmoc-Hyp(tBu)-wang resin 0.7mmol/g 2g用DCM溶胀待用
2)、用20％哌啶/DMF溶液脱去Fmoc-Hyp(tBu)-wang resin的Fmoc基团,用DMF洗涤六次。
3)、称取4.8mmol Fmoc-Pro-COOH、4.8mmol HBTU、4.8mmol HOBT、 4.8mmolDIEA用20ml DMF溶解完全加到树脂反应30min。
4)、反应30min后抽去反应液，用DMF洗涤6次，用茚三酮检测无色,重复第3步与第4步。
5)、用20％哌啶/DMF溶液脱去Fmoc-pro-Hyp(tBu)-wang resin的Fmoc基团，用DMF洗涤6次。
6)、称取4.8mmol Fmoc-Gly-COOH、4.8mmol HBTU、4.8mmol HOBT、4.8mmol DIEA用20ml DMF溶解完全加到树脂反应30min。
7)、反应30min后抽去反应液，用DMF洗涤6次，用茚三酮检测无色，重复第6步与第7步。
8)、用20％哌啶/DMF溶液脱去Fmoc-Gly-Pro-Hyp(tBu)-wang resin的Fmoc基团，用DMF洗涤6次，甲醇洗涤3次，抽干树脂
9)、用TFA(三氟乙酸)和水混合溶液(95％TFA)，酸化树脂2小时，过滤去除树脂，加10倍体积低温乙醚将多肽在TFA中析出。将析出多肽过滤抽干，进行分离纯化。
纯化工艺：
取1mg粗产品用1ml纯水超声溶解，用高效液相色谱进行粗产品分析，条件为：A(乙腈+0.1％TFA)B(纯水+0.1％TFA)，A相0-25min(10-100％)，检测波长：220nm，流速1ml\min，进样量20微升，分析图谱见图2。
取400mg粗产品用水溶解，用得出的保留时间换算出制备色谱条件：条件为：A(乙腈)B(纯水+0.1％TFA)，A相0-30min(2-12％)，检测波长：220nm，流速30ml\min，进样量400mg，分析图谱见图3。
把收集的馏分送质谱鉴定分子量，把质谱正确的液体用分析液相检测纯度。检测条件如下：A(乙腈+0.1％TFA)B(纯水+0.1％TFA)，A相0-25min(2-27％)，检测波长：220nm，流速1ml\min，进样量20微升。
实施例4
Pro-Hyp合成工艺：
1)、将购买好的Fmoc-Hyp(tBu)-wang resin 0.7mmol/g 2g用DCM溶胀待用；
2)、用20％哌啶/DMF溶液脱去Fmoc-Hyp(tBu)-wang resin的Fmoc基团,用DMF洗涤六次；
3)、称取4.8mmol Fmoc-Pro-COOH、4.8mmol HBTU、4.8mmol HOBT、4.8mmol DIEA用20mlDMF溶解完全加到树脂反应30min。
4)、反应30min后抽去反应液，用DMF洗涤6次，用茚三酮检测无色，重复第3步与第4步。
5)、用20％哌啶/DMF溶液脱去Fmoc-Pro-Hyp(tBu)-wang resin的Fmoc基团，用DMF洗涤6次，甲醇洗涤3次，抽干树脂，再次重复一次。
6)、用TFA和水混合溶液(95％TFA)，酸化树脂2小时，过滤去除树脂，加10倍体积乙醚将多肽在TFA中析出。将析出多肽过滤抽干，进行分离纯化。
纯化工艺：
取1mg粗产品用1ml纯水超声溶解。用高效液相色谱进行粗产品分析，条件为：A(乙腈+0.1％TFA)B(纯水+0.1％TFA)，A相0-25min(10-100％)，检测波长：220nm，流速1\min，进样量20微升，分析图谱见图4。
取400mg粗产品用水溶解，用得出的保留时间换算出制备色谱条件：条件为：A(乙腈)B(纯水+0.1％TFA)，A相0-30min(2-7％)，检测波长：220nm，流速30ml\min，进样量400mg，分析图谱见图5。
把收集的馏分送质谱鉴定分子量，把质谱正确的液体用分析液相检测纯度。检测条件如下：A(乙腈+0.1％TFA)，B(纯水+0.1％TFA)，A相0-25min(2-27％)，检测波长：220nm，流速1ml\min，进样量20微升。
把检测合格的样品用旋转蒸发器浓缩，浓缩液经低温冰箱预冻后上冻干机真空冷冻干燥。称量，质检。
实施例5
Pro-Hyp与Gly-Pro-Hyp分离
1、色谱条件
色谱柱：venusic ASB-C18(250mm×4.6mm，5um)；柱温：40℃；流动相：梯度洗脱(0-20min:乙腈(0.1％三氟乙酸)A：2％-22％，纯水(0.1％三氟乙酸)B：98％-78％；20.1-25min:乙腈(0.1％三氟乙酸)A：100％，纯水(0.1％三氟乙酸)B：0％；25.1-35min：乙腈(0.1％三氟乙酸)A：2％，纯水(0.1％三氟乙酸)B：98％)；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm。
2、检测方法
取上述方法获得的超滤液按照上述色谱条件自动进样各50μl，根据峰面积积分值计算供试品的浓度。
3、线性关系验证结果
Pro-Hyp标准对照品溶液的制备：精密称取100mg Pro-Hyp(纯度＞99％)对照品溶于1ml双蒸水中，依次用双蒸水稀释成浓度分别为0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml梯度溶液。
Gly-Pro-Hyp标准对照品溶液的制备:精密称取100mg Pro-Hyp(纯度＞99％)对照品溶于1ml双蒸水中，依次用双蒸水稀释成浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.025mg/ml梯度溶液。
将上述Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp标准对照品梯度溶液按照该色谱条件自动进样各50μl，计算各峰面积积分值，以标准品浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)。得到Pro-Hyp回归方程：y＝7E+06x,R2＝0.9999，结果表明：Pro-Hyp的浓度在0.005mg/ml～0.5mg/ml内和其峰面积积分值有良好的线性关系；得到Gly-Pro-Hyp回归方程：y＝2E+07x,R2＝0.9998，结果表明：Gly-Pro-Hyp的浓度在0.01mg/ml～1mg/ml内和其峰面积积分值有良好的线性关系。
4、加样回收率验证结果
取血液上清供试品9份各100μl(Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp浓度分别为0.045mg/ml和0.075mg/ml)，低浓度组中各加入45μl Pro-Hyp和75μl Gly-Pro-Hyp；中浓度组中各加入90μl Pro-Hyp和150μl Gly-Pro-Hyp；高浓度组中各加入135μl Pro-Hyp和225μl Gly-Pro-Hyp。Pro-Hyp不同浓度的平均回收率 分别为99.26％、98.77和99.07，RSD分别为1.71，2.63和2.33；Gly-Pro-Hyp不同浓度的平均回收率分别为98.89％，98.22％和99.57％，RSD分别为1.70，1.20和0.84；结果见表3和表4。表明Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的加样回收率良好。
表3 Pro-Hyp加样回收率结果
表4 Gly-Pro-Hyp加样回收率结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。