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一种调控巴氏杆菌发育繁殖的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种调控细菌发育繁殖的方法，具体地讲是涉及一种调控巴氏杆菌发育繁殖的方法。
背景技术
巴氏杆菌(Pasteuria spp.)是一类寄生植物寄生线虫、能够产生菌丝和内生孢子的细菌，属于真细菌中的低GC含量格兰氏阳性菌分支。巴氏杆菌是线虫的专性寄生物，在线虫体内完成其生长和繁殖过程，并以芽孢形式释放回土壤中。内生孢子在土壤中具有极强的抗逆性，在寄主线虫经过时，其内生孢子附着在线虫体壁上，随线虫发育而萌发并侵入到线虫假体腔内，吸取它们的营养成分，破坏其组织细胞，最终导致线虫幼虫行动迟缓和侵染力减弱，或使雌虫生育力下降，从而有效地降低线虫的虫口密度，起到防治线虫病害的作用。
穿刺巴氏杆菌作为线虫天敌中的优势种群，既能有效地控制线虫的群体数量，又对其它生物无毒、无害，不破坏生态平衡；不污染环境；是生防前景广阔的线虫寄生菌。多年来，研究人员在温室和大田做了大量试验，发现巴氏杆菌能有效控制多种植物的线虫病害(Stirling，1984；Brown et al.，1985；Bird & Brisbane，1988；Chen et.al.，1996；Chen and Dickson，1997，1998，2004；Kumari & Sivakumar，2005；Pembroke & Gowen，2006；Zareen et al.，2002；Walia et al.，2005；Gogoi & Neog，2005；Darban et al.，2005)，并且具有显著的防治效果，能与化学杀线虫剂及其他线虫天敌(如淡紫拟青霉、厚壁孢轮枝菌等)混合使用以增强防效(Sngh and Dhawan，1994；Zakim，1991；Dele，et al.，1992)。此外，巴氏杆菌还能以芽孢形式长期保存。这些都是这类细菌可能发展成为一类新型生防制剂的优势所在。
但该菌一直未能广泛应用到生产中，其主要原因是体外培养技术尚不成熟，主要依靠活体寄主繁殖，很难大规模生产。要攻克穿刺巴氏杆菌体外培养这一世界性难题，必须首先解决不能随时获得发育阶段一致的接种体问题。
发明内容
本发明通过控制培养温度，从而抑制巴氏杆菌在寄主线虫体内的发育，进而达到调控巴氏杆菌(Pasteuria spp.)孢子萌发、菌丝体的发育繁殖，并保持菌丝体活性的方法。
本发明所提供的调控巴氏杆菌发育繁殖的方法，是将巴氏杆菌在大于等于8℃，小于20℃的温度范围内进行培养。
上述方法中，所述培养的温度范围为12℃-19℃。
上述方法中，所述巴氏杆菌是通过离心将巴氏杆菌的孢子附着在线虫上并侵染到线虫体内得到的。
所述离心的条件为3000g-9000g离心2-7min，具体可为9000g离心3min。
上述方法中，所述巴氏杆菌是侵染线虫7-21天后获得的。
本发明方法同样适用于巴氏杆菌属其它种菌体的发育调控，如穿刺巴氏杆菌(Pasteuria penetrans)(参考文献为SAYRE R M，STARR M P.Pasteuria penetrans(ex Thorne，1940)nom.rev.，combn，sp.n.，a mycelial andendospore-forming bacterium parasitic in plant-parasitic nematodes[J].Proceedings of the Helm in thological Society of Washington，1985，52：149-165)、巴氏杆菌Pasteuria thornei(参考文献为ST ARR M P，S AYRE RM.Pasteuria thornei sp.nov.and Pasteuria penetrans sensu strict o emend.，mycelial and endospore-forming bacteria parasitic，respectively，onplant-parasitic nematodes of the genera Pratylenchus and M eloidogyne[J].Ann Inst Pasteur Microbiol，1988，139：11-31)、巴氏杆菌Pasteurianishizawae(参考文献为SAYRE R M，WERGIN W P，SCHMIDT J M，et al.Pasteurianishizawae sp.nov.，a mycelial and endospore-forming bactrium parasiticon cyst nematodes of genera Heterodera and Globodera[J].Res Microbiol，1991，142(5)：551-564)、巴氏杆菌Pasteuria usage(参考文献为GIBLIN-DAVISRM，WILLIAMSD S，BEKAL S，et al.’Candidatus pasteuria usgae’sp.nov.，an obligate endoparasite of the phytoparasitic nematode Belonolaimuslongicaudatus[J].Int J Syst Evol Microbiol，2003，53(1)：197-200)或巴氏杆菌Pasteuria hartismeri(参考文献为BISHOP，A.H.，GOWEN，S.R.，PEMBROKE，B.，TROTTER，J.R.，Morphological and molecular characteristicaof a new species of Pasteuria parasitic on Meloidogyne ardenensis.Journalof Invertebrate Pathology，2007，96，28-33.)。
上述巴氏杆菌属的菌体均是从Pasteuria bioscience公司购得。
所述线虫为根结线虫(Meloidogyne spp.)(殷友琴，杨宝君，王秋丽.根结线虫病的病原鉴定[J].植物保护学报，1989，(03))或胞囊线虫(Heterodera spp.)(刘维志，刘晔，陈品三.东北地区部分市县大豆胞囊线虫生理小种的鉴定结果初报[J].沈阳农业大学学报，1984，(02))。
所述根结线虫(Meloidogyne spp.)和胞囊线虫(Heterodera spp.)可由中国林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)购得。
本发明的调控巴氏杆菌发育繁殖的方法可用于巴氏杆菌的体外培养及巴氏杆菌菌丝体的保存。
本发明提供了一种能够有效调控巴氏杆菌孢子萌发、菌丝体发育繁殖，并保持菌丝体活性的方法。本发明的方法可以应用于控制并保存巴氏杆菌菌丝体活性，为巴氏杆菌的体外培养提供了足够的、发育状况一致的接种材料，并且保证了每次接种材料的活性一致，使体外培养巴氏杆菌可以随时进行。由于本发明方法通过调节温度控制了巴氏杆菌的发育，克服了体外培养获得菌丝体困难、繁琐的问题，从材料方面保证了体外培养的顺利开展，既节省了每次准备接种材料的大工作量又有效地解决了活体扩繁接种材料所需空间大的问题。利用本发明的方法可保存巴氏杆菌约30天，经本发明方法保存的巴氏杆菌转移到正常条件下后，菌丝体的活力没有改变，当有效积温达到400℃后，菌丝体可以发育形成孢子，且不会影响孢子的产量和质量。本发明方法还适用于巴氏杆菌属其它种的发育调控及保存，也同样适用于人工培养基中巴氏杆菌菌丝体的发育调控及保存。
具体实施方式
实施例1、温度对穿刺巴氏杆菌发育的调控
一、温度对穿刺巴氏杆菌发育的调控
温度对穿刺巴氏杆菌发育的调控，按以下步骤进行：
1、供试线虫及其分离
供试线虫为根结线虫Meloidogyne spp.(中国林业微生物菌种保藏管理中心)。取已感染根结线虫的番茄植株，将番茄的根用清水洗净，放置于0.5％次氯酸钠溶液中30sec，快速搓洗，过筛，冲洗，收集根结线虫的卵粒于垫有3层滤纸的线虫分离器中，在室温下孵化3-4天，得到根结线虫二龄幼虫。
2、穿刺巴氏杆菌附着根结线虫
将上述步骤(1)培养的根结线虫与穿刺巴氏杆菌孢子溶液混合，制成孢子-线虫混合液，混合液中，根结线虫的浓度为2000J2/ml，穿刺巴氏杆菌孢子的浓度为1.0X10⁴个孢子/ml，将混合液吹打混匀后，平均分装到6个离心管中，溶液体积小于离心管体积的1/2，9000g离心3min，收集沉淀备用。随机取样在400倍显微镜下计数每条线虫体表附着的孢子数，结果表明，附着率为100％，且每条线虫体表都附着有至少一个穿刺巴氏杆菌的孢子。
3、根结线虫的培养
无菌土培育番茄苗，将苗龄为3-4周的番茄苗移入装有灭菌细沙的杯子中，每杯2株，添加植物营养液，接种上述步骤(2)获得的表皮已附着巴氏杆菌孢子的根结线虫二龄幼虫。25-35℃条件下培养2-5天，保证线虫已侵入到番茄的根内；取出番茄苗，移栽到装有无菌土的花盆中，相同条件下继续培养。
4、穿刺巴氏杆菌发育的调控
附着在根结线虫二龄幼虫体表的孢子萌发并侵入到根结线虫体内开始发育，侵染2-3周后，将上述步骤(3)的番茄植株转移到可严格控制温度的光照培养箱中，控制培养箱中的温度为19℃。培养箱中储藏物摆放整齐，注意通风、调节湿度和保证充足的光照。
5、调控过程中的管理
定期对番茄浇水，10天左右添加一次营养液，保证番茄的根系处于良好的生长状态。
二、评价步骤一调控方法的实施效果
以正常条件下培养的侵染了穿刺巴氏杆菌的根结线虫作为对照，既对照组线虫的培养条件与步骤一中的步骤1-3相同，然后继续在25-35℃条件下培养而不进行低温调控。
1、穿刺巴氏杆菌的发育控制
将采用上述步骤一的方法调控的穿刺巴氏杆菌于调控30天后检查菌丝体的发育状况，显微镜下测定各形态菌丝体所占的比例。同时以不进行低温调控的穿刺巴氏杆菌作为对照。实验设三次重复，结果表明，采用上述步骤一的方法调控的穿刺巴氏杆菌菌丝体在线虫体内未发育，各形态菌丝体所占比例与调控前无显著性差异，具体结果见表1。
表1不同温度条件下穿刺巴氏杆菌的发育状态

  处理  营养菌丝体％  分化菌丝体％  孢子幼体％  孢子％  调控前  实验组  对照组  27.62±1.67  25.17±1.57  0  38.05±1.28  37.83±1.19  1.12±0.14  10.26±0.92  12.83±1.02  4.5±0.56  24.02±1.13  25.17±1.26  94.38±6.32
2、穿刺巴氏杆菌的再发育能力实验
将采用上述步骤一的方法调控的穿刺巴氏杆菌再次转移至常规培养条件下(即培养温度为25-35℃)培养，当有效积温达到400℃时，穿刺巴氏杆菌产生孢子。测定孢子的活性、附着能力和再侵染能力等指标，测定穿刺巴氏杆菌各形态菌丝体所占的比例。同时以不进行低温调控的穿刺巴氏杆菌作为对照。实验设三次重复，结果表明，采用上述步骤一的调控方法获得的穿刺巴氏杆菌与正常条件下培养的穿刺巴氏杆菌的孢子的活性、附着能力和再侵染能力基本保持一致。穿刺巴氏杆菌各形态菌丝体所占的比例如表2所示。
表2温度调控后穿刺巴氏杆菌再发育能力的测定
  处理  营养菌丝体％  分化菌丝体％  孢子幼体％  孢子％  实验组  对照组  0  0  1.57±0.22  1.11±0.08  5.14±0.28  4.5±0.45  93.28±5.71  94.38±6.09
以上结果说明，采用上述步骤一的方法调控后的穿刺巴氏杆再恢复到常规培养温度下，巴氏杆菌的菌丝体仍然可完成其生活史，形成成熟的孢子。
3、穿刺巴氏杆菌的再繁殖能力实验
将采用上述步骤一的方法调控后的穿刺巴氏杆菌再次转移至常规培养条件下(即培养温度为25-35℃)培养30天，测定单头雌虫的产孢量。同时以不进行低温调控的穿刺巴氏杆菌作为对照。实验设三次重复，具体结果见表3。
表3温度调控后穿刺巴氏杆菌发育为成熟孢子的差异
  处理  雌虫长mm  雌虫宽mm  孢子量(个/头)  实验组  对照组  1.22±0.19mm  1.28±0.21mm  0.61±0.04mm  0.59±0.05mm  (1.39±0.09)×10⁶  (1.53±0.08)×10⁶
结果表明，采用上述步骤一的方法调控穿刺巴氏杆菌30天后，再将穿刺巴氏杆菌转移到正常条件下，该菌可继续发育形成孢子，其孢子量与对照组无明显差异。
4、穿刺巴氏杆菌的再侵染根结线虫能力实验
将采用上述步骤一的方法调控的穿刺巴氏杆菌再次转移至常规培养条件下(即培养温度为25-35℃)培养30天，收获线虫体内孢子，采用步骤一中穿刺巴氏杆菌附着根结线虫的方法，测定孢子对根结线虫的附着率、每条线虫体表孢子数及最终单头雌虫产孢量。同时以不进行低温调控的穿刺巴氏杆菌作为对照。实验设三次重复，具体结果见表4。
表4温度调控后穿刺巴氏杆菌孢子再侵染根结线虫能力的测定
  处理  附着率％  线虫体表孢子数  孢子量(个/头)  实验组  对照组  100  100  5.32±0.06  5.83±0.04  (1.46±0.08)×10⁶  (1.51±0.07)×10⁶
结果表明，采用上述步骤一的方法调控穿刺巴氏杆菌30天后，再将穿刺巴氏杆菌转移到正常条件下，该菌可继续发育形成孢子，其孢子量与对照组无明显差异，且产生的孢子对根结线虫的再附着侵染能力不受影响。
实施例2、温度对穿刺巴氏杆菌发育的调控
一、温度对穿刺巴氏杆菌发育的调控
温度对穿刺巴氏杆菌发育的调控，按以下步骤进行：
1、供试线虫及其分离
供试线虫为根结线虫Meloidogyne spp.(中国林业微生物菌种保藏管理中心)。取已感染根结线虫的番茄植株，将番茄的根用清水洗净，放置于0.5％次氯酸钠溶液中30sec，快速搓洗，过筛，冲洗，收集根结线虫的卵粒于垫有3层滤纸的线虫分离器中，在室温下孵化3-4天，得到根结线虫二龄幼虫。
2、穿刺巴氏杆菌附着根结线虫
将上述步骤(1)培养的根结线虫与穿刺巴氏杆菌孢子溶液混合，制成孢子一线虫混合液，混合液中，根结线虫的浓度为2000J2/ml，穿刺巴氏杆菌孢子的浓度为1.0X10⁴个孢子/ml，将混合液吹打混匀后，平均分装到6个离心管中，溶液体积小于离心管体积的1/2，9000g离心3min，收集沉淀备用。随机取样在400倍显微镜下计数每条线虫体表附着的孢子数，结果表明，附着率为100％，且每条线虫体表都附着有至少一个穿刺巴氏杆菌的孢子。
3、根结线虫的培养
无菌土培育番茄苗，将苗龄为3-4周的番茄苗移入装有灭菌细沙的杯子中，每杯2株，添加植物营养液，接种上述步骤(2)获得的表皮已附着巴氏杆菌孢子的根结线虫二龄幼虫。25-35℃条件下培养2-5天，保证线虫已侵入到番茄的根内；取出番茄苗，移栽到装有无菌土的花盆中，相同条件下继续培养。
4、穿刺巴氏杆菌发育繁殖的调控
附着在根结线虫二龄幼虫体表的孢子萌发并侵入到根结线虫体内开始发育，侵染2-3周后，将上述步骤(3)的番茄植株转移到可严格控制温度的光照培养箱中，控制培养箱中的温度为10℃。培养箱中储藏物摆放整齐，注意通风、调节湿度和保证充足的光照。
5、调控过程中的管理
定期对番茄浇水，10天左右添加一次营养液，保证番茄的根系处于良好的生长状态。
二、评价步骤一调控方法的实施效果
以正常条件下培养的侵染了穿刺巴氏杆菌的根结线虫作为对照，既对照组线虫的培养条件与步骤一中的步骤1-3相同，然后继续在25-35℃条件下培养而不进行低温调控。
1、穿刺巴氏杆菌的发育控制
将采用上述步骤一的方法调控的穿刺巴氏杆菌于调控30天后检查菌丝体的发育状况，显微镜下测定各形态菌丝体所占的比例。同时以不进行低温调控的穿刺巴氏杆菌作为对照。实验设三次重复，结果表明，采用上述步骤一的方法调控的穿刺巴氏杆菌的菌丝体在线虫体内未发育，各形态菌丝体所占比例与调控前无显著性差异，具体结果见表5。
表5不同温度条件下穿刺巴氏杆菌的发育状态
  处理  营养菌丝体％  分化菌丝体％  孢子幼体％  孢子％  调控前  实验组  对照组  27.62±1.67  25.17±1.56  0  38.05±1.28  38.83±1.18  1.12±0.14  10.26±0.92  11.83±1.07  4.5±0.56  24.02±1.13  24.17±1.27  94.38±6.32
2、穿刺巴氏杆菌的再发育能力实验
将采用上述步骤一的方法调控的穿刺巴氏杆菌再次转移至常规培养条件下(即培养温度为25-35℃)培养，当有效积温达到400℃时，穿刺巴氏杆菌产生孢子。测定孢子的活性、附着能力和再侵染能力等指标，测定穿刺巴氏杆菌各形态菌丝体所占的比例。同时以不进行低温调控的穿刺巴氏杆菌作为对照。实验设三次重复，结果表明，采用上述步骤一的调控方法获得的穿刺巴氏杆菌与正常条件下培养的穿刺巴氏杆菌的孢子的活性、附着能力和再侵染能力基本保持一致。穿刺巴氏杆菌各形态菌丝体所占的比例如表6所示。
表6温度调控后穿刺巴氏杆菌再发育能力的测定
  处理  营养菌丝体％  分化菌丝体％  孢子幼体％  孢子％  实验组  对照组  0  0  2.07±0.24  1.11±0.08  4.64±0.26  4.5±0.45  94.28±5.71  94.38±6.09
以上结果说明，采用上述步骤一的方法调控后的穿刺巴氏杆再恢复到常规培养温度下，巴氏杆菌的菌丝体仍然可完成其生活史，形成成熟的孢子。
3、穿刺巴氏杆菌的再繁殖能力实验
将采用上述步骤一的方法调控后的穿刺巴氏杆菌再次转移至常规培养条件下(即培养温度为25-35℃)培养30天，测定单头雌虫的产孢量。同时以不进行低温调控的穿刺巴氏杆菌作为对照。实验设三次重复，具体结果见表7。
表7温度调控后穿刺巴氏杆菌发育为成熟孢子的差异
  处理  雌虫长mm  雌虫宽mm  孢子量(个/头)  实验组  对照组  1.19±0.17mm  1.28±0.21mm  0.59±0.06mm  0.59±0.05mm  (1.49±0.07)×10⁶  (1.53±0.08)×10⁶
结果表明，采用上述步骤一的方法调控穿刺巴氏杆菌30天后，再将穿刺巴氏杆菌转移到正常条件下，该菌可继续发育形成孢子，其孢子量与对照组无明显差异。
4、穿刺巴氏杆菌的再侵染根结线虫能力实验
将采用上述步骤一的方法调控的穿刺巴氏杆菌再次转移至常规培养条件下(即培养温度为25-35℃)培养30天，收获线虫体内孢子，采用步骤一中穿刺巴氏杆菌附着根结线虫的方法，测定孢子对根结线虫的附着率、每条线虫体表孢子数及最终单头雌虫产孢量。同时以不进行低温调控的穿刺巴氏杆菌作为对照。实验设三次重复，具体结果见表8。
表8温度调控后穿刺巴氏杆菌孢子再侵染根结线虫能力的测定
  处理  附着率％  线虫体表孢子数  孢子量(个/头)  实验组  对照组  100  100  5.44±0.05  5.83±0.04  (1.47±0.09)×10⁶  (1.51±0.07)×10⁶
结果表明，采用上述步骤一的方法调控穿刺巴氏杆菌30天后，再将穿刺巴氏杆菌转移到正常条件下，该菌可继续发育形成孢子，其孢子量与对照组无明显差异，且产生的孢子对根结线虫的再附着侵染能力不受影响。
实施例3、温度对巴氏杆菌Pasteuria nishizawae发育的调控
一、温度对巴氏杆菌Pasteuria nishizawae发育的调控
温度对巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的调控，按以下步骤进行：
1、供试线虫及其分离
供试线虫为胞囊线虫(Heterodera spp.，)(中国林业微生物菌种保藏管理中心)。取已感染胞囊线虫的大豆植株，体视镜下挑取大豆根上的胞囊线虫的新鲜胞囊，选取新鲜、饱满、成熟的胞囊和卵囊在0.5％NaOCl溶液中消毒3min，无菌水冲洗3次，然后在25℃于无菌水中孵化，每天及时收集新孵化出的胞囊线虫。
2、巴氏杆菌Pasteuria nishizawae附着胞囊线虫
将上述步骤(1)培养的胞囊线虫与巴氏杆菌Pasteuria nishizawae(Sayre，R.M.Wergin，W.P.Schmidt，J.M.Starr，M.P.Pasteuria nishizawae sp.nov.，a mycelial and endospore-forming bacterium parasitic on cyst nematodes ofgenera Heterodera and Globodera[J].Research in Microbiology.1991.142：5，551-564.)的孢子溶液混合，制成孢子-线虫混合液，混合液中，胞囊线虫的浓度为2000J2/ml，巴氏杆菌Pasteuria nishizawae孢子的浓度为1.0X10⁴个孢子/ml，将混合液吹打混匀后，平均分装到6个离心管中，溶液体积小于离心管体积的1/2，9000g离心3min，收集沉淀备用。随机取样在400倍显微镜下计数每条线虫体表附着的孢子数，结果表明，附着率为100％，且每条线虫体表都附着有至少一个巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的孢子。
3、胞囊线虫的培养
在装有无菌土的花盆中培育大豆苗，每盆2株，3-4周后接种上述步骤2获得的表皮已附着巴氏杆菌Pasteuria nishizawae孢子的胞囊线虫二龄幼虫。25-35℃条件下培养2-5天，保证线虫已侵入到大豆的根内。
4、巴氏杆菌Pasteuria nishizawae发育的调控
附着在胞囊线虫二龄幼虫体表的孢子萌发并侵入到胞囊线虫体内开始发育，侵染2-3周后，将上述步骤(3)的大豆植株转移到可严格控制温度的光照培养箱中，控制培养箱中的温度为15℃。培养箱中储藏物摆放整齐，注意通风、调节湿度和保证充足的光照。
5、调控过程中的管理
定期对大豆浇水，10天左右添加一次营养液，保证大豆的根系处于良好的生长状态。
二、评价步骤一调控方法的实施效果
以正常条件下培养的侵染了巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的胞囊线虫作为对照，既对照组线虫的培养条件与步骤一中的步骤1-3相同，然后继续在25-35℃条件下培养而不进行低温调控。
1、巴氏杆菌Pasteuria nishizawae发育繁殖的控制
将采用上述步骤一的方法调控的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae于调控30天后检查菌丝体的发育状况，显微镜下测定各形态菌丝体所占的比例。同时以不进行低温调控的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae作为对照。实验设三次重复，结果表明，采用上述步骤一的方法调控的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的菌丝体在线虫体内未发育，各形态菌丝体所占比例与调控前无显著性差异，具体结果见表9。
表9不同温度条件下巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的发育状态
  处理  营养菌丝体％  分化菌丝体％  孢子幼体％  孢子％  调控前  实验组  对照组  37.62±1.67  35.17±1.57  0  43.05±1.28  42.83±1.19  2.12±0.14  5.26±0.92  7.83±1.02  4.5±0.56  14.02±1.13  15.17±1.26  93.38±6.32
2、巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的再发育能力实验
将采用上述步骤一的方法调控的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae再次转移至常规培养条件下(即培养温度为25-35℃)培养，当有效积温达到400℃时，巴氏杆菌Pasteuria nishizawae产生孢子。测定孢子的活性、附着能力和再侵染能力等指标，测定巴氏杆菌Pasteuria nishizawae各形态菌丝体所占的比例。同时以不进行低温调控的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae作为对照。实验设三次重复，结果表明，采用上述步骤一的调控方法获得的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae与正常条件下培养的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的孢子的活性、附着能力和再侵染能力基本保持一致。巴氏杆菌Pasteuria nishizawae各形态菌丝体所占的比例如表10所示。
表10温度调控后巴氏杆菌Pasteuria nishizawae再发育能力的测定
  处理  营养菌丝体％  分化菌丝体％  孢子幼体％  孢子％
  实验组  对照组  0  0  1.57±0.22  1.11±0.08  6.14±0.28  5.5±0.45  92.28±5.71  93.38±6.09
以上结果说明，采用上述步骤一的方法调控后的巴氏杆菌Pasteurianishizawae再恢复到常规培养温度下，巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的菌丝体仍然可完成其生活史，形成成熟的孢子。
3、巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的再繁殖能力实验
将采用上述步骤一的方法调控后的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae再次转移至常规培养条件下(即培养温度为25-35℃)培养30天，测定单头雌虫的产孢量。同时以不进行低温调控的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae作为对照。实验设三次重复，具体结果见表11。
表11温度调控后巴氏杆菌Pasteuria nishizawae发育为成熟孢子的差异
  处理  雌虫长mm  雌虫宽mm  孢子量(个/头)  实验组  对照组  0.52±0.09mm  0.54±0.03mm  0.41±0.04mm  0.46±0.05mm  (1.42±0.09)×10⁵  (1.49±0.08)×10⁵
结果表明，采用上述步骤一的方法调控巴氏杆菌Pasteuria nishizawae 30天后，再将巴氏杆菌Pasteuria nishizawae转移到正常条件下，该菌可继续发育形成孢子，其孢子量与对照组无明显差异。
4、巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的再侵染胞囊线虫能力实验
将采用上述步骤一的方法调控的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae再次转移至常规培养条件下(即培养温度为25-35℃)培养30天，收获线虫体内孢子，采用步骤一中巴氏杆菌Pasteuria nishizawae附着胞囊线虫的方法，测定孢子对胞囊线虫的附着率、每条线虫体表孢子数及最终单头雌虫产孢量。同时以不进行低温调控的巴氏杆菌Pasteuria nishizawae作为对照。实验设三次重复，具体结果见表12。表12温度调控后巴氏杆菌Pasteuria nishizawae孢子再侵染胞囊线虫能力的测定
  处理  附着率％  线虫体表孢子数  孢子量(个/头)  实验组  对照组  100  100  5.67±0.06  5.85±0.04  (1.49±0.08)×10⁵  (1.54±0.07)×10⁵
结果表明，采用上述步骤一的调控方法对巴氏杆菌Pasteuria nishizawae的发育进行温度调控30天后，再将巴氏杆菌Pasteuria nishizawae转移到正常条件下，该菌可继续发育形成孢子，其孢子量与对照组无明显差异，且产生的孢子对胞囊线虫的再附着侵染能力不受影响。
通过上述实施例1-3的实验，结果表明，本发明方法可有效的调控巴氏杆菌的发育状态，可以用于巴氏杆菌菌丝体活力的保存，为体外培养接种材料的获得提供便利，可以控制巴氏杆菌菌丝体发育，并保持巴氏杆菌菌丝体活力至少在30天或30天以上，将调控后的巴氏杆菌转移到正常温度条件下，该巴氏杆菌可继续发育形成孢子，其孢子的数量与活力与未经过上述方法处理的巴氏杆菌的孢子无明显差异。本发明方法也适用于巴氏杆菌属其它种的巴氏杆菌的发育调控及保存，同样适用于人工培养基中巴氏杆菌的发育调控及保存。