一种提取蛋清中溶菌酶的方法.pdf

本发明公开了一种提取蛋清中溶菌酶的方法，包括以下步骤：(1)取蛋清，均质后加水稀释，流过装填有Na型树脂的吸附柱，所述的Na型树脂由大孔弱酸性阳离子交换树脂转换而成；(2)用水反向冲洗吸附柱内的Na型树脂，除去残留的蛋清；(3)用NaCl溶液冲洗吸附柱内的Na型树脂，除去杂蛋白；(4)用NaCl溶液梯度洗脱Na型树脂，合并所有的洗脱液；(5)将洗脱液通过生物膜分离浓缩、喷雾干燥后制得溶菌酶成品。本发明方法通过离子交换树脂吸附蛋清，增大了树脂的交换容量，提高了提取效率，提取得到溶菌酶活性和纯度较高。

1、  一种提取蛋清中溶菌酶的方法，包括以下步骤：
(1)取蛋清，均质后加水稀释，流过装填有Na型树脂的吸附柱，所述的Na型树脂由大孔弱酸性阳离子交换树脂转换而成；
(2)用水反向冲洗吸附柱内的Na型树脂，除去残留的蛋清；
(3)用重量百分比为0.5～0.8％的NaCl溶液冲洗除去残留蛋清的Na型树脂，除去杂蛋白；
(4)用重量百分比为2～4％的NaCl溶液洗脱除去杂蛋白的Na型树脂，洗脱后将NaCl溶液的浓度以重量百分比为0.5～1％的梯度递增，继续洗脱Na型树脂2～8次，合并所有的洗脱液；
(5)将洗脱液通过生物膜分离浓缩至固形物含量达4～8％，喷雾干燥后制得溶菌酶成品。

2、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的大孔弱酸性阳离子交换树脂为D152型。

3、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的均质压力为3～6MPa，加入的水与蛋清的体积比为0.5∶1.5～10。

4、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的稀释后的蛋清流过吸附柱的流速为4～6L/min·m²。

5、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中NaCl溶液的洗脱速度为8～10L/min·m²，每次洗脱所用的NaCl溶液与蛋清的体积比为1～2。

6、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的生物膜孔径大小为1～2纳米。

7、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中喷雾干燥所使用的热空气温度为100～105℃，湿度低于15％。

一种提取蛋清中溶菌酶的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提取蛋清中溶菌酶的方法。
背景技术
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
现有提取鸡蛋蛋清中溶菌酶主要采用直接结晶、离子交换吸附、亲和色谱、反胶团萃取、亲和膜色谱和扩张床吸附等技术手段，上述技术手段中由于提取效率的限制，大多数还停留在实验室阶段，没有大规模生产应用；直接结晶和离子交换是提取鸡蛋蛋清中溶菌酶最常用的两种方法，已有应用于工业化生产的报道，但是提取的溶菌酶活力及其纯度不能满足医药等领域的使用要求，而且提取成本较高。
中国专利申请200410060632.3公开了一种鸡蛋提取溶菌酶的方法，该方法采用离子交换树脂分离溶菌酶，其吸附过程是将树脂置入直接蛋清中，该方法静态吸附蛋清中的溶菌酶，离子交换容量小，导致整个提取效率很低，而且提取的溶菌酶纯度也较低。
发明内容
本发明提供了一种提取蛋清中溶菌酶的方法，该方法解决了现有离子交换吸附法提取溶菌酶效率不高，提取得到的溶菌酶活性不高的问题。
一种提取蛋清中溶菌酶的方法，包括以下步骤：
(1)取蛋清，均质后加水稀释，流过装填有Na型树脂的吸附柱，所述的Na型树脂由大孔弱酸性阳离子交换树脂转换而成；
现有的蛋清吸附法均是静态吸附，其主要原因是蛋清粘度很大，给动态吸附带来了困难，但是静态吸附时树脂的交换容量较小，影响提取效率，为了进一步减小蛋清粘度，在流过吸附柱之间，可以将蛋清在均质机中进行均质，然后加水稀释，均质压力不宜过大，防止溶菌酶变性而失活，优选设置为3～6MPa；加水量越多，蛋清的粘度会越小，但同时增加了过柱时间，优选添加量为蛋清体积的5％～15％。
因为刚购买的树脂或者使用过的树脂含有杂菌和其余杂质，在转换之前需要进行清洗、灭菌和除杂等预处理，其预处理过程一般操作如下：
a.先用清水冲洗树脂至无色，除去没有吸附在树脂上易分离的杂质，然后浸入酒精2～4小时，取出后用水冲洗除去残留酒精。
b.为了便于操作，可以将树脂装如吸附柱，然后用重量百分比为6％的氢氧化钠流过吸附柱，再用清水流过吸附柱，直至pH为8～9，除去树脂中的有机杂质。
c.用重量百分比为3％的盐酸流过吸附柱，再用清水流过吸附柱，直至pH为6～7，除去树脂中的无机杂质，预处理完成。
上述预处理完成的树脂还是H型树脂，再用重量百分比为6％的氢氧化钠流过吸附柱，即可转化成Na型树脂。上述树脂应选用大孔弱酸性阳离子交换树脂，优选为D152型。蛋清流过树脂层的流速可以任意，优选4～6L/min·m²，表示每分钟流过每横截面的蛋清体积为4～6L。
(2)用水反向冲洗吸附柱内的Na型树脂，除去残留的蛋清；
(3)用重量百分比为0.5～0.8％的NaCl溶液冲洗吸附柱内的Na型树脂，除去杂蛋白；所述的杂蛋白主要是除溶菌酶之外的其余蛋白质。
(4)用重量百分比为2～4％的NaCl溶液洗脱Na型树脂，洗脱后将NaCl溶液的浓度以重量百分比为0.5～1％的梯度递增，继续洗脱Na型树脂2～8次，合并所有的洗脱液；
因为离子交换吸附存在动态吸附平衡，采用梯度洗脱可以收集尽量多的溶菌酶；洗脱液的流速和体积影响洗脱效率，流速小洗脱量多，但是操作时间长，流速大洗脱量小，洗脱次数会增加；本发明洗脱液流速优选8～10L/min·m²，每次洗脱所用的NaCl溶液体积优选蛋清体积的1～2倍。
(5)将洗脱液通过生物膜分离浓缩至固形物含量达4～8％，喷雾干燥后制得溶菌酶成品。
生物膜采用现有常规的人工膜，如聚醚砜膜、改性聚砜膜以及聚偏氟乙烯膜等，生物膜孔径优选1～2nm，通过生物膜分离可以除去NaCl和大部分的水，达到浓缩的目的；为了便于喷雾干燥，本发明将固形物含量控制在4～8％。
喷雾干燥的原理是将原料液物化后与热空气接触，从而将水分瞬间蒸发，得到固形物。因为溶菌酶是一种蛋白质，对温度比较敏感，现有的喷雾干燥其热空气温度为180℃，湿度大于60％，制得的溶菌酶活性不高，本发明选择热空气温度为100～105℃，湿度低于15％，喷雾干燥效果差不多，但是溶菌酶活性较高。
本发明方法通过离子交换树脂动态吸附蛋清，增大了树脂的交换容量，提高了提取效率，提取得到溶菌酶活性和纯度较高。本发明方法通过梯度洗脱溶菌酶，洗脱效率高。
附图说明
图1为本发明方法工艺流程图。
具体实施方式
树脂预处理
(1)用100升纯净水冲洗D152型阳离子交换树脂至排水无色，放掉水后，再用酒精浸泡3小时，放掉酒精用水冲洗除去残留酒精，树脂为H型。
(2)将清洗好的树脂装入吸附柱(直径40cm，吸附柱总长2.5m，树脂装填高度1.5m)，用重量浓度6％的氢氧化钠溶液400升经离心泵以5L/min的流速动态流过吸附柱内的树脂层，除去树脂中的有机杂质，再用纯净水动态清洗至PH值为8.5，此时树脂为Na型。
(3)用重量百分比3％的盐酸500升经离心泵以5L/min的流速动态流过吸附柱内的树脂层，除去树脂虽的无机杂质，再用纯水动态清洗至流出液呈PH值为6.5，此时树脂为H型。
(4)在用重量百分比为6％的氢氧化钠溶液500升以5L/min的流速流过吸附柱内的树脂层，将H型树脂转化为Na型树脂。
实施例1
(1)取1000kg新鲜鸡蛋，清洗、杀菌、喷淋后用打蛋器将蛋清和蛋黄分离，可得600升蛋清。
(2)蛋清用均质机在3Mpa的压力下均质一遍，加入占蛋清总体积15％的水，对蛋清进行稀释。
(3)用离心泵将稀释后的蛋清经以3L/min的流速流过吸附柱内的Na树脂。
(4)吸附完毕为用清水反向冲洗吸附柱内的Na树脂，除去残留的蛋清。
(5)然后再用重量百分浓度为0.5％的NaCl溶液冲洗吸附柱内的Na树脂，除去杂质蛋白。
(6)最后用600L重量百分浓度为2％的NaCl溶液以流速4L/min对吸附柱内的Na树脂进行洗脱，收集洗脱液，接着将NaCl溶液的浓度以1％的梯度递增继续对Na树脂进行洗脱4次，最后一次NaCl溶液的重量百分比浓度为6％。
(7)合并所有的洗脱液，通过聚偏氟乙烯膜(孔径1nm)分离，将洗脱液浓缩至固形物含量为4％，最后送入喷雾干燥塔干燥，制得溶菌酶成品。其中喷雾干燥塔内热空气的温度105℃，湿度为10％。
上述溶菌酶成品经分光光度法检测，其活性为19500国际单位，含氮量为15.3％。
实施例2
(1)取1000kg新鲜鸡蛋，清洗、杀菌、喷淋后用打蛋器将蛋清和蛋黄分离，可得600升蛋清。
(2)蛋清用均质机在6Mpa的压力下均质一遍，加入占蛋清总体积5％的水，对蛋清进行稀释。
(3)用离心泵将稀释后的蛋清经以2L/min的流速流过吸附柱内的Na树脂。
(4)吸附完毕为用以清水反向冲洗吸附柱内的Na树脂，除去残留的蛋清。
(5)然后再用重量百分浓度为0.8％的NaCl溶液冲洗吸附柱内的Na树脂，除去杂质蛋白。
(6)最后用600L重量百分浓度为4％的NaCl溶液以流速5L/min对吸附柱内的Na树脂进行洗脱，收集洗脱液，接着将NaCl溶液的浓度以0.8％的梯度递增继续对Na树脂进行洗脱5次，最后一次NaCl溶液的重量百分比浓度为8％。
(7)合并所有的洗脱液，通过聚偏氟乙烯膜(孔径2nm)分离，将洗脱液浓缩至固形物含量为8％，最后送入喷雾干燥塔干燥，制得溶菌酶成品。其中喷雾干燥塔内热空气的温度100℃，湿度为8％。
上述溶菌酶成品经分光光度法检测，其活性为21000国际单位，含氮量为15.7％。