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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410138882.8 (22)申请日 2014.04.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103865966 A (43)申请公布日 2014.06.18 (73)专利权人 青岛博之源生物技术有限公司 地址 266001 山东省青岛市市南区华山路2 号4单元603户 (72)发明人 齐宏涛 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 史霞 (51)Int.Cl. C12P 19/04(2006.01) C12R。
2、 1/69(2006.01) C12R 1/865(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/225(2006.01) 审查员 马静 (54)发明名称 一种微生物分步固态发酵制备茶多糖的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种微生物分步固态发酵制 备茶多糖的方法, 包括以下步骤: 茶叶粉或茶粕 粉接入菌种分步固态发酵、 恒温水浸提、 离心; 超 滤膜分离、 浓缩、 乙醇沉淀、 离心、 冷冻干燥得到 茶多糖。 本发明的方法与现有的水提法区别在于 本发明利用微生物生长繁殖中产生的多种酶系 (蛋白酶、 脂肪酶、 淀粉酶、 纤维素酶、 植酸酶等) 将茶叶细胞中多种大分子物质。
3、水解, 有利于茶多 糖的浸出, 制备条件温和、 工艺简单、 绿色环保, 茶多糖的得率大、 纯度高、 活性强。 本发明以低档 茶、 粗老茶、 茶粕为原料, 实现了资源的高值化利 用。 本发明制得的茶多糖具有抗氧化、 抗辐射、 降 血糖的功能活性, 适合工业化生产。 权利要求书1页 说明书3页 CN 103865966 B 2017.01.04 CN 103865966 B 1.一种微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法, 包括以下步骤: (1)茶叶粉或茶粕粉加入营养盐溶液, 灭菌, 接入菌种分步固态发酵, 加入水恒温水浸 提, 离心; (2)二级超滤膜分离, 真空浓缩, 乙醇沉淀, 离心, 冷冻干燥。
4、得到茶多糖; 步骤(1)中茶叶粉或茶粕粉为低档茶、 粗老茶、 提取茶油后的茶粕粉碎过200目筛下物, 营养盐溶液1L体积所含的成分包括0.52的(NH4)2SO4、 0.48的KH2PO4、 0.8的尿素、 1.2的葡萄糖, 茶叶粉或茶粕粉与营养盐溶液的质量与体积比为: 1g:1.0ml-1g:2.0ml, 灭 菌的条件为121灭菌15min, 接入的第一种菌种为菌龄为60-84h的米曲霉或菌龄为30-40h 的啤酒酵母, 茶叶粉或茶粕粉与菌种的接入体积比为: 1g:0.2ml-1g:0.4ml, 108个菌种/ml, 第一步发酵条件为30下静置发酵36h, 接入的第二种菌种为菌龄为16-24。
5、h的枯草芽孢杆 菌或菌龄为9-15h的乳酸菌, 茶叶粉或茶粕粉与菌种的接入体积比为: 1g:0.1ml-1g:0.2ml, 108个菌种/ml, 第二步发酵条件为40下静置发酵42h, 加入水的质量是茶叶粉或茶粕粉的 质量的4.5倍, 恒温水浸提条件为45-55恒温水浴中浸提3-6h, 离心条件为6000r/min转速 下离心25min; 步骤(2)中一级超滤膜分离条件为截留分子量为100kDa的聚砜中空纤维超滤 膜, 以0.2-0.3MPa压力, 25下超滤, 二级超滤膜分离条件为截留分子量为40kDa的聚砜中 空纤维超滤膜, 以0.5-0.6MPa压力, 25下超滤, 真空浓缩条件为真空度。
6、0.1MPa, 60恒温 水浴中浓缩, 加入4倍于浓缩液体积的无水乙醇, 离心条件为6500r/min离心25min, 冷冻干 燥条件为-55、 真空度0.1MPa, 干燥24h。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103865966 B 2 一种微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物分步固态发酵制备茶多糖的方法, 属于食品营养活性物质加工 领域。 背景技术 0002 茶叶为山茶科茶属植物, 具有丰富的营养价值和药用价值, 其活性物质茶氨酸、 多 酚类和黄酮类等的提取及保健功能已进行了深入研究, 但对于茶多糖的研究却缺乏应有的 重视。 茶多糖具有降血糖、 降血。
7、脂、 抗凝血、 预防心脑血管疾病、 增强机体免疫、 抗辐射等功 能。 我国民间一直流传泡饮粗老茶治疗糖尿病的说法。 茶多糖存在于茶叶细胞内, 由于茶叶 细胞的表面被脂质包围, 通常使用脱脂溶剂如甲醇、 乙醇或乙醇与乙醚混合液等先将茶叶 的脂质除去, 再用提取溶剂稀酸、 稀碱或水提取茶多糖。 但是, 大量研究表明酸性或碱性条 件下提取的茶多糖活性较低, 所以提取茶多糖最好的溶剂是水。 0003 茶多糖是一种白色、 略带绿茶香气的粉末状固体。 该产品是由单糖和蛋白组成的 蛋白复合多糖, 不同的提取方法其单糖组成不同, 通常由阿拉伯糖、 木糖、 核糖、 葡萄糖、 半 乳糖、 甘露糖、 岩藻糖、 果糖。
8、、 鼠李糖和半乳糖醛酸中的几种组成。 茶多糖的降血糖效果非常 显著, 其降血糖机理为调节糖代谢酶的活性和清除自由基作用, 对糖代谢的影响与胰岛素 类似。 高纯度的茶多糖可以制成饮片或胶囊剂直接供糖尿病患者长期服用; 也可加到燕麦 粥等糖尿病人专用食品中, 用于康复治疗产品及日常营养补充品。 0004 目前, 茶多糖的提取工艺多采用水提法, 在提取之前要用有机溶剂脱脂, 不仅增加 了生产成本, 还易污染环境。 此外, 水提法的提取率低, 虽然有的工艺增加了超声波或微波 辅助浸提, 但提取效果还是不理想。 因此, 需要一种操作简单、 成本低、 提取率高、 环境友好、 茶多糖产品活性高, 且工业化生。
9、产前景和市场前景广阔的提取茶多糖的方法。 发明内容 0005 本发明的目的在于为解决上述技术中存在的技术难题, 提供一种微生物分步固态 发酵制备茶多糖的方法。 本发明利用微生物生长繁殖中产生的多种酶系(蛋白酶、 脂肪酶、 淀粉酶、 纤维素酶、 植酸酶等)将茶叶细胞中多种大分子物质水解, 有利于茶多糖的浸出, 制 备条件温和、 工艺简单、 绿色环保, 茶多糖的提取率大、 纯度高、 活性强。 0006 为达到上述目的, 本发明所采用的技术方案是: 一种微生物分步固态发酵制备茶 多糖的方法, 其步骤包括: 0007 一、 发酵和提取: 茶叶粉或茶粕粉加入营养盐溶液, 灭菌, 接入菌种分步固态发酵, 。
10、加入水恒温水浸提, 离心, 保留上清液; 0008 二、 分离纯化: 上清液经二级超滤膜分离, 真空浓缩, 乙醇沉淀, 离心, 沉淀经冷冻 干燥得到茶多糖。 0009 优选地, 步骤一所述的茶叶粉或茶粕粉为低档茶、 粗老茶、 提取茶油后的茶粕粉碎 过200目筛下物, 营养盐溶液(1L体积)所含的成分包括0.52的(NH4)2SO4、 0.48的KH2PO4、 说明书 1/3 页 3 CN 103865966 B 3 0.8的尿素、 1.2的葡萄糖, 茶叶粉或茶粕粉与营养盐溶液的质量与体积比为1g:1.0ml- 1g:2.0ml, 灭菌的条件为121灭菌15min, 接入的第一种菌种为菌龄为60。
11、-84h的米曲霉或 菌龄为30-40h的啤酒酵母, 茶叶粉或茶粕粉与菌种的接入体积比为1g:0.2ml-1g:0.4ml, (108个菌种/ml), 第一步发酵条件为30下静置发酵36h, 接入的第二种菌种为菌龄为16- 24h的枯草芽孢杆菌或菌龄为9-15h的乳酸菌, 茶叶粉或茶粕粉与菌种的接入体积比为1g: 0.1ml-1g:0.2ml(108个菌种/ml), 第二步发酵条件为40下静置发酵42h, 加入水的质量是 茶叶粉或茶粕粉的质量的4.5倍, 恒温水浸提条件为45-55恒温水浴中浸提3-6h, 离心条 件为6000r/min转速下离心25min。 0010 优选地, 步骤二所述的微生。
12、物分步固态发酵制备茶多糖的方法, 其特征在于: 步骤 (2)所述的一级超滤膜分离条件为截留分子量为100kDa的聚砜中空纤维超滤膜, 以0.2- 0.3MPa压力, 25下超滤, 二级超滤膜分离条件为截留分子量为40kDa的聚砜中空纤维超滤 膜, 以0.5-0.6MPa压力, 25下超滤, 真空浓缩条件为真空度0.1MPa, 60恒温水浴中浓缩, 加入4倍于浓缩液体积的无水乙醇, 离心条件为6500r/min离心25min, 冷冻干燥条件为-55 、 真空度0.1MPa, 干燥24h。 0011 本发明的有益效果是: 根据本发明, 能够提供提取率大, 纯度高, 具有清除自由基、 降血糖功能活性。
13、的茶多糖。 具体实施方式 0012 采用蒽酮-硫酸法测定茶多糖中多糖含量; 采用微量凯氏定氮法测定茶多糖的蛋 白含量。 0013 实施例1 0014 低档绿茶粉碎过200目筛, 取筛下物作为原料, 以1:1.25(g/ml)的比例向低档绿茶 粉中加入营养盐溶液(1L体积含有0.52的(NH4)2SO4、 0.48的KH2PO4、 0.8的尿素、 1.2 的葡萄糖), 121灭菌15min, 以低档绿茶粉: 米曲霉(108个米曲霉/ml)1:0.3(g/ml)的比 例接入菌龄为72h的米曲霉, 在30下进行第一步静置发酵36h, 发酵结束后, 以低档绿茶 粉: 乳酸菌(108个乳酸菌/ml)1:。
14、0.2(g/ml)的比例接入菌龄为12h的乳酸菌, 在40下进 行第二步静置发酵42h, 发酵结束后, 加入4.5倍于低档绿茶粉的水, 在48恒温水浴中浸提 4.5h, 6000r/min转速下离心25min, 保留上清液; 上清液经截留分子量为100kDa的聚砜中空 纤维超滤膜, 在0.2MPa压力, 25下进行一级超滤处理, 保留透过液, 透过液经截留分子量 为40kDa的聚砜中空纤维超滤膜, 在0.5MPa压力, 25下进行二级超滤处理, 保留浓缩液1, 浓缩液1在真空度0.1MPa, 60恒温水浴中真空旋转蒸发浓缩得到浓缩液2, 加入4倍于浓缩 液2体积的无水乙醇, 冰箱中静置12h,。
15、 6500r/min离心25min, 沉淀在真空度0.1MPa, -55下 干燥24h, 得到茶多糖。 茶多糖的提取率为4.51, 纯度为72.54, 蛋白含量为2.15; 茶多 糖的中性单糖约占87.6, 由阿拉伯糖、 果糖、 葡萄糖、 半乳糖、 甘露糖组成, 己糖醛酸约占 4.3, 戊糖约占14.6, 氨基糖约占0.8; 10mg/ml的茶多糖对DPPH自由基清除率为 35.48, 对羟自由基的清除率为27.92, 对超氧阴离子自由基的清除率为67.88; 10mg/ ml的茶多糖对葡萄糖激酶和己糖激酶的相对活性分别提高了189.34和194.23; 四氧嘧 啶高血糖模型小鼠腹腔注射400。
16、mg/kg体重茶多糖21d后, 血糖下降78, 肝糖原大量增加。 0015 实施例2 说明书 2/3 页 4 CN 103865966 B 4 0016 粗老绿茶粉碎过200目筛, 取筛下物作为原料, 以1:1.50(g/ml)的比例向粗老绿茶 粉中加入营养盐溶液(1L体积含有0.52的(NH4)2SO4、 0.48的KH2PO4、 0.8的尿素、 1.2 的葡萄糖), 121灭菌15min, 以粗老绿茶粉: 啤酒酵母(108个啤酒酵母/ml)1:0.4(g/ml) 的比例接入菌龄为36h的啤酒酵母, 在30下进行第一步静置发酵36h, 发酵结束后, 以粗老 绿茶粉: 枯草芽孢杆菌(108个枯。
17、草芽孢杆菌/ml)1:0.1(g/ml)的比例接入菌龄为24h的枯 草芽孢杆菌, 在40下进行第二步静置发酵42h, 发酵结束后, 加入4.5倍于粗老绿茶粉的 水, 在55恒温水浴中浸提6h, 6000r/min转速下离心25min, 保留上清液; 上清液经截留分 子量为100kDa的聚砜中空纤维超滤膜, 在0.3MPa压力, 25下进行一级超滤处理, 保留透过 液, 透过液经截留分子量为40kDa的聚砜中空纤维超滤膜, 在0.6MPa压力, 25下进行二级 超滤处理, 保留浓缩液1, 浓缩液1在真空度0.1MPa, 60恒温水浴中真空旋转蒸发浓缩得到 浓缩液2, 加入4倍于浓缩液2体积的无水。
18、乙醇, 冰箱中静置12h, 6500r/min离心25min, 沉淀 在真空度0 .1MPa, -55下干燥24h, 得到茶多糖。 茶多糖的提取率为5 .25, 纯度为 78.66, 蛋白含量为2.37; 茶多糖的中性单糖约占89.3, 由阿拉伯糖、 葡萄糖、 鼠李糖、 岩藻糖、 半乳糖、 甘露糖组成, 己糖醛酸约占5.2, 戊糖约占12.5, 氨基糖约占0.9; 10mg/ml的茶多糖对DPPH自由基清除率为37.94, 对羟自由基的清除率为29.26, 对超氧 阴离子自由基的清除率为79.01; 10mg/ml的茶多糖对葡萄糖激酶和己糖激酶的相对活性 分别提高了192.03和205.64;。
19、 四氧嘧啶高血糖模型小鼠腹腔注射400mg/kg体重茶多糖 21d后, 血糖下降83, 肝糖原大量增加。 0017 实施例3 0018 茶粕粉碎过200目筛, 取筛下物作为原料, 以1:1.80(g/ml)的比例向茶粕粉中加入 营养盐溶液(1L体积含有0.52的(NH4)2SO4、 0.48的KH2PO4、 0.8的尿素、 1.2的葡萄 糖), 121灭菌15min, 以茶粕粉: 米曲霉(108个米曲霉/ml)1:0.2(g/ml)的比例接入菌龄 为84h的米曲霉, 在30下进行第一步静置发酵36h, 发酵结束后, 以茶粕粉: 乳酸菌(108个 乳酸菌/ml)1:0.1(g/ml)的比例接入菌。
20、龄为15h的乳酸菌, 在40下进行第二步静置发酵 42h, 发酵结束后, 加入4.5倍于茶粕粉的水, 在45恒温水浴中浸提3h, 6000r/min转速下离 心25min, 保留上清液; 上清液经截留分子量为100kDa的聚砜中空纤维超滤膜, 在0.3MPa压 力, 25下进行一级超滤处理, 保留透过液, 透过液经截留分子量为40kDa的聚砜中空纤维 超滤膜, 在0.6MPa压力, 25下进行二级超滤处理, 保留浓缩液1, 浓缩液1在真空度0.1MPa, 60恒温水浴中真空旋转蒸发浓缩得到浓缩液2, 加入4倍于浓缩液2体积的无水乙醇, 冰箱 中静置12h, 6500r/min离心25min, 。
21、沉淀在真空度0.1MPa, -55下干燥24h, 得到茶多糖。 茶 多糖的提取率为5.06, 纯度为71.13, 蛋白含量为2.42; 茶多糖的中性单糖约占 84.5, 由阿拉伯糖、 葡萄糖、 甘露糖、 岩藻糖、 鼠李糖组成, 己糖醛酸约占4.6, 戊糖约占 13.4, 氨基糖约占0.7; 10mg/ml的茶多糖对DPPH自由基清除率为36.03, 对羟自由基 的清除率为24.15, 对超氧阴离子自由基的清除率为70.23; 10mg/ml的茶多糖对葡萄糖 激酶和己糖激酶的相对活性分别提高了190.95和200.37; 四氧嘧啶高血糖模型小鼠腹 腔注射400mg/kg体重茶多糖21d后, 血糖下降80, 肝糖原大量增加。 0019 以上所述, 仅为本发明的具体实施方式, 并不局限于此, 任何熟悉本技术领域的技 术人员在本发明揭露的技术范围内, 可轻易想到变化或替换, 都应涵盖在本发明的保护范 围之内。 说明书 3/3 页 5 CN 103865966 B 5 。