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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210538977.X (22)申请日 2012.12.13 C12P 7/06(2006.01) C12P 7/08(2006.01) C12N 11/14(2006.01) C12N 11/08(2006.01) (73)专利权人 南京工业大学 地址 210009 江苏省南京市鼓楼区新模范马 路 5 号 (72)发明人 应汉杰 陈勇 柳东 牛欢青 何颖 刘庆国 (74)专利代理机构 北京瑞恒信达知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11382 代理人 曹津燕 李渤 CN 102093948 A,2011.06.15, CN 1。
2、073207 A,1993.06.16, CN 101120095 A,2008.02.06, Peter M.kilonzo 等 .Repeated-batch production of glucoamylase using recombinant saccaromyces cerevisiae immobilized in a fibrous bed bioreactor. J ind microbiol biotechnol .2010, 第 37 卷 773-783. R.D.TYAGI 等 .Studies on immobilized saccharomyces cerevisi。
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5、称 一种采用固定化酵母细胞连续发酵生产乙醇 的方法 (57) 摘要 本发明提供一种采用固定化酵母细胞连续发 酵生产乙醇的方法， 该方法包括以下步骤 ：（1） 将 纤维材料附着于支撑骨架， 填充到生物反应器中 ； （2） 将酵母细胞固定于生物反应器中的纤维材料 ； （3） 将发酵培养基加入生物反应器， 开始乙醇发 酵 ；（4） 待发酵培养基中的葡萄糖消耗完， 发酵液 流出生物反应器收集乙醇并补入发酵培养基， 重 复进行步骤 （4） 。该方法利用纤维材料对酵母细 胞进行固定化连续发酵生产乙醇， 纤维材料作为 固定化材料性质稳定， 无毒性， 吸附、 传质效果好， 可以反复利用， 更易于实现乙醇的连续。
6、生产， 而且 在连续发酵过程中还能大幅提高乙醇产量。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高雅 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 103865958 B 2016.06.29 CN 103865958 B 1.一种采用固定化酵母细胞连续发酵生产乙醇的方法， 该方法包括以下步骤： (1)将纤维材料附着于支撑骨架， 填充到生物反应器中； (2)将酵母细胞固定于生物反应器中的纤维材料； (3)将发酵培养基加入生物反应器， 开始乙醇发酵； (4)待发酵培养基中的葡萄糖消耗完， 发酵液流出生物反应器收集乙醇并补入发酵培 养基。
7、， 重复进行步骤(4)； 其中， 所述步骤(1)中所述纤维材料的填充量为1-150g/L； 所述步骤(2)包括先将酵母细胞在种子生长培养基中培养至对数生长期获得种子液， 再使种子液循环接触生物反应器中的纤维材料， 使得酵母细胞固定于纤维材料； 所述步骤(3)包括当生物反应器中的溶液的OD值缓慢下降或小于1时， 排出溶液， 加入 发酵培养基在30-40下开始乙醇发酵； 所述发酵培养基包含葡萄糖100-400g/L， 蛋白胨1- 50g/L， 酵母膏1-50g/L， 硫酸铵0.1-5g/L， 磷酸盐1-10g/L， 七水合硫酸亚铁0.05-0.5g/L， 七 水合硫酸锌0.05-0.5g/L， p。
8、H为4-6.5； 或者所述发酵培养基为包含尿素0.1-10g/L， 硫酸镁 0.1-10g/L的木薯水解液或植物秸秆水解液。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)包括将纤维材料平铺在支撑 骨架上， 使其附着于支撑骨架， 再卷成筒状。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中所述支撑骨架为钢丝 网。 4.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述纤维材料选自棉纤维织物； 活性炭 纤维； 聚酯纤维； 丝绸； 竹纤维； 聚乙烯醇纤维； 无纺布； 聚氨酯泡沫； 甘蔗渣和玉米秸秆中的 一种或多种。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所。
9、述聚乙烯醇纤维为维纶。 6.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述无纺布选自涤纶、 丙纶、 锦纶、 氨纶或 腈纶。 7.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)包括先将酵母细胞在种子 生长培养基中培养至对数生长期获得种子液， 再在30-40下使种子液循环接触生物反应 器中的纤维材料， 使得酵母细胞固定于纤维材料； 其中， 所述种子液的流速为0.2-20L/小 时。 8.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述种子生长培养基包含葡萄糖10- 100g/L， 蛋白胨10-50g/L， 酵母膏10-500g/L， 无水硫酸镁0.1-5g/L， 硫酸铵0.1-5g。
10、/L， 磷酸 盐1-10g/L， pH为4-6。 9.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)中发酵液的流速为0.05- 5L/小时。 10.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述生物反应器为多个串联的生物反 应器。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103865958 B 2 一种采用固定化酵母细胞连续发酵生产乙醇的方法 技术领域 0001 本发明属于工业生物技术领域， 涉及一种连续发酵生产乙醇的方法， 具体涉及一 种采用固定化酵母细胞连续发酵生产乙醇的方法。 背景技术 0002 乙醇作为一种可再生的洁净能源， 已成为工业生物技术领域的研究热点。 传统的 乙醇。
11、发酵工艺采用游离细胞发酵， 酵母随发酵醪不断流走， 造成发酵罐中酵母细胞浓度不 够大， 使酒精发酵速度慢， 发酵时间较长。 0003 另外， 在分批发酵过程中， 微生物处于连续变化的环境中， 由于基质的不断消耗， 有害代谢产物的不断积累， 使微生物不能长久的处于旺盛的发酵期， 发酵设备的利用率较 低， 单位体积、 单位时间内所产生的产物量也较少。 0004 近年来， 固定化酵母在燃料乙醇发酵生产上得到了越来越广泛的关注和应用。 固 定化细胞技术本质就是用物理或化学手段将游离细胞定位于限定的空间区域内， 使其保持 催化活性， 并可反复使用， 减少细胞流失。 固定化细胞具有生产时间短， 产量稳定，。
12、 耐受高糖 及高乙醇浓度等优点， 能够有效提高乙醇生产效率。 0005 传统的固定化方法主要采用凝胶包埋技术， 即用角叉莱胶、 卡拉胶、 海藻酸钙、 海 藻酸钠等对细胞进行固定发酵。 虽然此类包埋载体具有成型方便及固定化密度高等优点， 但机械强度低， 传质弱， 抗微生物分解能力较差； 同时因传质限制， 难以实现细胞自我更新。 发明内容 0006 针对现有技术的不足之处， 本发明的目的在于提供一种新型的连续发酵生产乙醇 的方法， 该方法利用纤维材料对酵母细胞进行固定化并连续发酵生产乙醇， 纤维材料作为 固定化材料性质稳定， 无毒性， 吸附、 传质效果好， 可以反复利用， 更易于实现乙醇的连续生 。
13、产， 而且在连续发酵过程中还能大幅提高乙醇产量。 0007 用于实现上述目的的技术方案如下： 0008 一种采用固定化酵母细胞连续发酵生产乙醇的方法， 该方法包括以下步骤： 0009 （1） 将纤维材料附着于支撑骨架， 并填充到生物反应器中； 0010 （2） 将酵母细胞固定于生物反应器中的纤维材料； 0011 （3） 将发酵培养基加入生物反应器， 开始乙醇发酵； 0012 （4） 待发酵培养基中的葡萄糖消耗完， 发酵液流出生物反应器收集乙醇， 并补入发 酵培养基， 再重复进行步骤 （4） 。 0013 在上述方法中， 优选地， 所述步骤 （1） 包括将纤维材料平铺在支撑骨架上， 使其附 着于。
14、支撑骨架， 再卷成筒状， 并填充到生物反应器中； 更优选地， 所述支撑骨架为钢丝网； 进 一步优选地， 所述纤维材料的填充量为1-150g/L。 0014 在上述方法中， 优选地， 所述纤维材料选自棉纤维织物； 活性炭纤维； 聚酯纤维； 丝 绸； 竹纤维； 聚乙烯醇纤维， 例如维纶； 无纺布， 例如涤纶、 丙纶、 锦纶、 氨纶或腈纶； 聚氨酯泡 说明书 1/4 页 3 CN 103865958 B 3 沫； 甘蔗渣和玉米秸秆中的一种或多种。 0015 在上述方法中， 优选地， 所述步骤 （2） 包括先将酵母细胞在种子生长培养基中培养 至对数生长期获得种子液， 再使种子液循环接触生物反应器中的纤。
15、维材料， 使得酵母细胞 固定于纤维材料。 0016 在上述方法中， 更优选地， 所述步骤 （2） 包括先将酵母细胞在种子生长培养基中培 养至对数生长期获得种子液， 再在30-40下使种子液循环接触生物反应器中的纤维材料， 使得酵母细胞固定于纤维材料； 其中， 所述种子液的流速为0.2-20L/小时。 0017 在上述方法中， 所述种子生长培养基包含葡萄糖10-100g/L， 蛋白胨10-50g/L， 酵 母膏10-500g/L， 无水硫酸镁0.1-5g/L， 硫酸铵0.1-5g/L， 磷酸盐1-10g/L， pH为4-6。 0018 在上述方法中， 优选地， 所述步骤 （3） 包括当生物反应器。
16、中的溶液的OD值缓慢下降 或小于1时， 排出溶液， 加入发酵培养基在30-40下开始乙醇发酵。 0019 在上述方法中， 所述发酵培养基包含葡萄糖100-400g/L， 蛋白胨1-50g/L， 酵母膏 1-50g/L， 硫酸铵0.1-5g/L， 磷酸盐1-10g/L， 七水合硫酸亚铁0.05-0.5g/L， 七水合硫酸锌 0.05-0.5g/L， pH为4-6.5； 或者所述发酵培养基为包含尿素0.1-10g/L， 硫酸镁0.1-10g/L的 木薯水解液或植物秸秆水解液。 0020 在上述方法中， 优选地， 所述步骤 （4） 中的发酵液的流速为0.05-5L/小时。 0021 在上述方法中， 。
17、优选地， 所述生物反应器为多个串联的生物反应器。 0022 相对于现有技术， 本发明的方法取得了以下有益效果： 0023 本发明的方法采用的固定化材料成本低， 无毒性， 机械强度高， 而且为化学惰性， 对细胞不具有毒害作用， 也不会被细胞降解， 不影响微生物的生长代谢， 死细胞自行脱落， 而活细胞能够实现自增殖过程， 始终维持很高的催化效率， 特别适用于酵母细胞的连续发 酵。 而且， 在发酵中由于固定化材料对酵母细胞吸附效果好， 致使溶液中菌体量非常少， 避 免了菌种在连续发酵过程中流失的现象。 0024 本发明所采用的固定化材料能够促进酵母细胞形成生物膜 （见图4） ， 从而形成一 种保护层。
18、， 大幅提高酵母的耐受性， 避免了酵母细胞在连续发酵过程中由于长期浸泡在高 浓度乙醇下出现死亡或衰退的现象。 0025 该固定化技术采用表面吸附技术， 提高了连续发酵过程中酵母细胞的传质性能， 使发酵产率大幅提高， 其中以葡萄糖为底物的乙醇发酵产率由2-3gL-1h-1上升至8-10gL-1h -1， 以木薯、 玉米、 糖蜜等淀粉类粮食作物为底物的乙醇发酵产率 （糖化、 液化、 发酵一体化） 也由0.5-1gL-1h-1上升至6-7gL-1h-1， 以玉米秸秆、 小麦秸秆、 玉米芯等水解液为底物的乙醇 发酵产率也由0.2-1gL-1h-1上升至2-3gL-1h-1。 0026 固定化连续发酵不。
19、仅可以减少批次发酵菌体的浪费， 而且该发酵方式属于开放系 统， 能够保持反应器内营养物质的恒定， 使酵母保持较高活性。 此外， 本发明的方法涉及的 设备体积减少， 提高了设备利用率， 同时操作简单， 便于自动化生产， 节省了人力、 物力， 降 低了生产费用。 0027 与现有技术相比， 本发明选择的固定化介质不同于传统的包埋和吸附载体， 具有 成本低、 性质稳定、 孔隙率高、 吸附效果好等优点。 更重要的是， 本发明将这种固定化介质和 连续发酵技术进行组合取得了预料不到的技术效果， 即该固定化介质由于高效吸附所形成 的高密度菌体易于生成膜结构 （见图4） ， 这种膜结构作为保护层提高了菌体耐受。
20、性， 更适用 说明书 2/4 页 4 CN 103865958 B 4 于连续发酵过程中达到高乙醇浓度； 同时， 由于溶液中菌体量少， 减少了连续发酵的分离成 本。 附图说明 0028 以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中： 0029 图1为将纤维材料附着于钢丝网的操作示意图； 0030 图2为本发明单级连续发酵装置的示意图； 0031 图3为本发明多级连续发酵装置的示意图； 0032 在图13中， 1表示钢丝网； 2表示纤维材料； 3表示进料罐； 4表示泵； 5表示固定化酵 母生物反应器； 6表示产品收集罐； 7表示阀门。 0033 图4为连续发酵中固定化酵母的电镜照片。 具体。
21、实施方式 0034 以下参照具体的实施例来说明本发明。 本领域技术人员能够理解， 这些实施例仅 用于说明本发明， 其不以任何方式限制本发明的范围。 0035 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的原 料、 试剂等， 如无特殊说明， 均为市售购买产品。 0036 实施例1以葡萄糖为原料进行固定化酵母细胞单级连续发酵 0037 发酵培养基成分： 葡萄糖200g/L， 蛋白胨7g/L， 酵母膏4g/L， 硫酸铵4g/L， 磷酸盐 4g/L， 七水合硫酸亚铁0.1g/L， 七水合硫酸锌0.1g/L。 0038 首先， 将活性炭纤维棉1和钢丝网2剪成大小相同的形状，。
22、 并将其平铺在钢丝网上， 卷成筒状 （参见图1） ， 纤维材料层与层之间需保持疏松均匀， 并装入高与直径比为4的反应 器5中 （参见图2） 。 将培养好的菌种 （对数期） 加到进料罐3， 种子液通过左侧泵4从反应器5底 部以10L/h的流速流进， 待种子液充满反应器， 关闭左侧泵4， 打开右侧泵和中间阀门， 循环 固定若干时间， 直至进料罐3中的菌体浓度很小， 降低不明显。 然后， 排出废液， 加入新鲜发 酵培养基， 依旧从反应器5底部流进， 上端泵出至产品收集罐6 （此时关闭中间阀门， 打开右 侧阀门） 。 其中， 发酵温度为34， 发酵液pH为4.5， 液流速为0.1L/h。 实验结果发现。
23、， 反应进 行到15h， 乙醇浓度可达92g/L， 反应35天后， 乙醇浓度维持在93.5g/L左右， 平均产率为13L- 1h-1左右。 0039 实施例2以木薯原料进行固定化酵母细胞单级连续发酵 0040 木薯水解液发酵培养基成分： 木薯糖化液 （葡萄糖浓度245g/L） ， 尿素0.2g/L， 硫酸 镁0.2g/L。 0041 首先， 将植物纤维 （棉布） 1和钢丝网按实施例1的操作方法， 将其固定在高与直径 比为5的反应器5内 （参见图2） ； 然后将培养好的菌种 （对数期） 加到进料罐3中， 种子液通过 左侧泵4从反应器5底部以15L/h的流速流进， 待种子液充满反应器， 关闭左侧泵。
24、4， 打开右侧 泵和中间阀门， 循环固定若干时间， 直至进料罐3液体中的菌体浓度几乎不再下降。 排出废 液， 加入木薯水解液发酵培养基， 依旧通过进料罐3从反应器5底部流进， 上端泵出至产品收 集罐6 （此时关闭中间阀门， 打开右侧阀门） 。 其中， 发酵温度为36， 发酵液pH为5， 液流速为 0.05L/h。 实验结果发现， 反应到18h后， 乙醇浓度可达112g/L， 反应25天， 乙醇平均浓度 说明书 3/4 页 5 CN 103865958 B 5 115g/L， 平均产率为10gL-1h-1。 0042 实施例3以葡萄糖为原料进行固定化酵母细胞5级连续发酵 0043 发酵培养基成分。
25、： 葡萄糖250g/L， 蛋白胨5g/L， 酵母膏3g/L， 硫酸铵4g/L， 磷酸盐 3g/L， 七水合硫酸亚铁0.05g/L， 七水合硫酸锌0.05g/L。 0044 首先， 将竹纤维置于乙二醛溶液中浸泡4h， 清洗烘干后， 与钢丝网卷成桶状， 并装 入高与直径比为4的5个首尾串连的反应器5中 （参见图3） 。 其次， 将培养好的菌种 （对数期） 加到进料罐中3， 通过泵4从第一个反应器5底部以15L/h的流速流进， 再从最后一个反应器5 上端流出至进料罐3， 循环固定若干时间， 直至进料罐3中的菌体OD值小于1。 排出废液， 加入 新鲜发酵培养基， 依旧从第一个反应器5底部流进， 最后一。
26、个反应器5上端流出至产品收集 罐6。 其中， 发酵温度为35， 发酵液pH为6， 液流速为0.3L/h。 因最后一个反应器菌种长时间 浸泡在高浓度乙醇下代谢受抑制乃至死亡， 可定期切换反应器连接方式 （即将最后一个反 应器作为第一个反应器， 其他连接方式不变） 。 实验结果发现， 反应进行10h， 乙醇浓度高达 114g/L； 发酵进行40天， 由于纤维床吸附着高密度酵母， 未发现染菌现象， 并且乙醇平均浓 度为120g/L左右， 平均产率为14.5gL-1h-1， 平均得率为0.48左右。 另外发现流出的发酵液中 菌体量极少， 减少了分离成本。 0045 实施例4以植物秸秆为原料进行固定化酵。
27、母细胞4级连续发酵 0046 发酵培养基成分： 纤维水解液 （葡萄糖浓度110g/L） ， 硫酸镁0.5g/L， 尿素0.3g/L。 0047 将合成纤维 （涤纶） 置于琥珀醛溶液中浸泡2h， 清洗烘干后， 按实施例3进行安装操 作； 然后将培养好的菌种 （对数期） 加到进料罐3中， 通过泵4从第一个反应器5底部以20L/h 的流速流进， 再从最后一个反应器5上端流出至进料罐3， 循环固定若干时间， 直至进料罐3 中的菌体OD值小于1。 排出废液， 加入纤维水解液发酵培养基， 再通过进料罐3从第一个反应 器5底部泵进， 最后一个反应器5上端流出至产品收集罐6。 其中， 发酵温度为38， 发酵液pH 为4.5， 发酵液流速为0.8L/h。 实验结果发现， 反应进行8h， 乙醇浓度高达48g/L； 发酵进行30 天， 乙醇平均浓度为52g/L， 平均产率为5gL-1h-1， 平均得率0.47。 说明书 4/4 页 6 CN 103865958 B 6 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 7 CN 103865958 B 7 图4 说明书附图 2/2 页 8 CN 103865958 B 8 。