一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法.pdf

上传人:三** 文档编号:8581980 上传时间:2020-09-04 格式:PDF 页数:11 大小:539.55KB
返回 下载 相关 举报
摘要
申请专利号:

CN201410129217.2

申请日:

20140331

公开号:

CN103898175A

公开日:

20140702

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:

IPC分类号:

C12P7/66,C12N1/20,C12R1/125

主分类号:

C12P7/66,C12N1/20,C12R1/125

申请人:

广东双骏生物科技有限公司

发明人:

陈杰鹏,段丽丽,陈煜藩,陈鸿锐,邱雪莲,蔡桂珠,洪琳,胡留松,黄晓莹,张岳霖,许志锴

地址:

515071 广东省汕头市汕头保税区C03地块双骏生物科技园

优先权:

CN201410129217A

专利代理机构:

北京安信方达知识产权代理有限公司

代理人:

苏蕾;郑霞

PDF下载: PDF下载
内容摘要

本发明提供了一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188,CGMCC No.8400以及一种用该菌株提纯高纯度的维生素甲萘醌-7的高收率方法。该方法包括以下步骤:1)将所述纳豆菌发酵液喷雾干燥,用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉,获得浸溶液;2)将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏;3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析,并进行梯度或等度洗脱,收集液浓缩,得到甲萘醌-7粗品;4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯,即得所述维生素甲萘醌-7纯品。

权利要求书

1.一种提纯维生素甲萘醌-7的方法,该方法包括以下步骤:1)将纳豆菌发酵液喷雾干燥,用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉,获得浸溶液,所述纳豆菌为纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188,保藏号为:CGMCC No.8400;2)将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏;3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析,并进行梯度或等度洗脱,将收集液浓缩,得到甲萘醌-7粗品;4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯,即得所述维生素甲萘醌-7纯品。 2.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤1)中,将纳豆菌发酵液喷雾干燥前,向所述纳豆菌发酵液中添加0.1-1重量%的大豆油。 3.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤3)中,所述柱层析的方法包括:首先将步骤2)获得的所述浸膏以湿法上柱脱色,并以第一淋洗剂洗脱;然后将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化,即先以湿法装柱,再将脱色后的产物以干法装柱的方式装填于湿法装柱的上层,并以第二淋洗剂洗脱,其中湿法干法混合上柱的柱中,所述湿法装柱与所述干法装柱的体积比为1∶0.2-2。 4.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤1)中,所述提取或浸溶条件包括:将纳豆菌发酵液喷干粉与溶剂按1∶3-8的质量比混合,在15-40℃的温度下,以20-60rpm搅拌速率搅拌20-40min,固液分离,所得清液即为浸溶液。 5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法,其中,在步骤1)中,所述溶剂选自甲醇、石油醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯和75-100体积%乙醇中的一种或多种。 6.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法,其中,在步骤2)以及步骤3)中,所述浓缩为减压浓缩,所述减压浓缩的条件包括:温度为40-95℃,真空度小于3000Pa。 7.根据权利要求3所述的方法,其中,将步骤2)获得的所述浸膏以湿法上柱脱色包括:将硅胶和石油醚按1∶1.5-2质量比混匀后装柱,再将步骤2)获得的浸膏和石油醚按1∶0.5-1质量比混匀后上柱。 8.根据权利要求3或7所述的方法,其中,所述第一淋洗剂为非极性溶剂,优选为石油醚、正己烷和环己烷中的一种或多种;所述第一淋洗剂的用量为层析柱体积的2-3倍。 9.根据权利要求3所述的方法,其中,将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化包括:先将硅胶和石油醚以1∶1.5-2的质量比混匀后装柱;再将所述脱色后的产物与硅胶和石油醚以1∶3-4:4-5的质量比混合、阴干后装填在先以湿法装填的柱中。 10.根据权利要求3或9所述的方法,其中,所述第二淋洗剂选自石油醚、体积比为1∶9的二氯甲烷和石油醚的混合物或者体积比为1∶9的三氯甲烷和石油醚的混合物,其中,所述石油醚的用量为层析柱体积的10-15倍,所述体积比为1∶9的二氯甲烷和石油醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍,所述体积比为1∶9的三氯甲烷和石油醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍。 11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述纳豆菌发酵液为将所述纳豆枯草芽孢杆菌ST188接种在含有10-50g/1000mL黄豆粉和5-45g/1000mL蔗糖的培养基中,在30-40℃,经过20-48小时发酵获得纳豆菌发酵液,其中所述纳豆枯草芽孢杆菌ST188的接种浓度为5-20%。 12.一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188,保藏号为:CGMCC No.8400。

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188, CGMCC No.8400,以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法。

背景技术

由于维生素K具有促进凝血的作用,又被称为凝血维生素。近半个世纪以 来,人们对维生素K的认识仅限于其对凝血系统的影响,直到1960年 Bouckaert发现维生素K可以促进兔子的骨折愈合。1975年,Pettifor等首次 提出维生素K参与人体骨代谢的假说之后,人们对维生素K在骨骼新陈代谢 的作用才有了深入的认识。

维生素K族包括数个脂溶性的2-甲基-1,4-萘醌衍生物。天然的维生素K 包括维生素K1(即叶绿醌)和维生素K2(即甲萘醌类),其以在2-甲基-1,4- 萘醌环状结构的3号位置上的亲脂性侧链为特征。叶绿醌的侧链是确定长度 的不饱和烃链,甲萘醌的侧链则是不确定长度的不饱和烃链。(维生素K1 即叶绿醌为一种化合物,维生素K2为一系列化合物)

维生素K2不单有促进凝血、改善动脉硬化的作用,国外也有作者在研 究其对肝癌和白血病的作用。现在我国已进入老龄化社会,骨质疏松患者发 病率较高。大量资料研究表明,维生素K2缺乏可导致老年人髋骨骨折和骨密 度降低。维生素K2缺乏,血清未羧化骨钙蛋白水平降低,血清羧化骨钙蛋白 水平也可能降低,从而可能导致老年人骨密度降低发生髋骨骨折危险。

维生素K2作为一种营养物质,并可以作为骨代谢调整物质,覆盖全身 的作用;副作用较少,呈脂溶性,可以饭后服用,不论什么年龄都适宜使用。 (邹志强,维生素K2的研究进展,中国骨质疏松杂志,2005,11(3):389-392)

1995年日本开始将维生素K2制剂作为改善骨量减少、疼痛的骨质疏松 症的药物销售。(王理明,维生素K2与骨质疏松,2007,26(4):293-295)

维生素K2(2-甲基-3-全反式-聚戊烯-1,4-萘醌)或甲萘醌类是一族异戊烯 基衍生物。由5个碳原子组成的异戊二烯残基的数量可用于区分甲萘醌系化 合物。其命名规则是基于异戊二烯基的数量,例如“甲萘醌”或“MK”之后 加上基团的数量。尽管甲萘醌侧链上已经被发现最多达到15个异戊二烯基, 但在人类和动物组织中出现的只有含有2到13个异戊二烯基的甲萘醌。脱甲 基化的甲萘醌,即在2号碳原子位点上未结合的甲萘醌也已经被发现。

维生素K2的一般性名称或常用名为甲萘醌,其基本成分为甲萘醌-4 (MK-4)和甲萘醌-7(MK-7)。已知MK-7是活性最强的维生素K2中的一 种。

叶绿醌及2种常见的甲萘醌结构图如下所示。

维生素K1

                                                  分子量:450

甲萘醌-4

   分子量:444

甲萘醌-7

                                                  分子量:649

然而目前,还没有一种能够简单、高效的提纯维生素K2的方法,尤其 是提纯维生素K2的MK-7的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto) ST188,CGMCC No.8400以及一种用该菌株提纯维生素甲萘醌-7(MK-7)的 方法。该方法简单高效,并且能够获得维生素MK-7较高的纯度和收率。

本发明所提供的纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188,保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北 辰西路1号院3号,保藏日期:2013年10月31日,保藏号为:CGMCC No. 8400。

本发明提供的提纯维生素甲萘醌-7的方法包括以下步骤:

1)将纳豆菌发酵液喷雾干燥,用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉, 获得浸溶液,所述纳豆菌为纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188, 保藏号为:CGMCC No.8400;

2)将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏;

3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析,并进行梯度或等度洗脱,将收集 液浓缩,得到甲萘醌-7粗品;

4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯,即得所述维生素甲萘醌-7 纯品。

美国大豆出口理事会(USSEC)定义纳豆为发酵大豆制品。亚洲部分国 家的日常食物均为发酵大豆制品,包括酱油、味噌、腐乳、纳豆、天贝、豆 豉、霉豆渣、酱糗子等。发酵大豆制品的不同之处在于,大豆作为酶解基质 有时与谷物结合使用,参与发酵过程的微生物亦有所不同。而纳豆是完全以 大豆经过芽孢杆菌或纳豆枯草杆菌发酵而来的。本申请所述的纳豆菌发酵液 是以黄豆粉经过纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)发酵而获得的发 酵液。所述纳豆枯草芽孢杆菌可以从市购的日本传统食品纳豆中分离获得。

根据本发明的一个实施方式,所述纳豆菌发酵液可以为将所述纳豆枯草 芽孢杆菌ST188接种在含有10-50g/1000mL黄豆粉和5-45g/1000mL蔗糖的 培养基中,在30-40℃,经过20-48小时发酵获得纳豆菌发酵液,其中所述 纳豆枯草芽孢杆菌ST188的接种浓度为5-20%。

根据本发明的一个实施方式,在喷雾干燥(本发明中简称:喷干)所述 纳豆菌发酵液之前,通过向所述纳豆菌发酵液中添加大豆油,可以有效保护 所述纳豆菌发酵液中维生素MK-7不被喷干过程的高温破坏,因此,有助于 提高MK-7的收率。

根据本发明的一个实施方式,只要向所述纳豆菌发酵液中添加的大豆油 即可有利于提高维生素MK-7的收率。优选情况下,向纳豆菌发酵液中添加 0.1-1重量%的大豆油,更有利于提高维生素MK-7的收率。

根据本发明的一个实施方式,在步骤1)中,将喷干水分控制在3%以下, 从而有利于MK-7的提取。同时,采用喷干粉来提取,比发酵液直接用有机 溶剂萃取,可以减少80%的有机溶剂的用量,同时因为含水少而有利于减压 浓缩。

根据本发明的一个实施方法,在步骤1)中,用溶剂提取或浸溶纳豆菌 发酵液喷干粉的条件包括:将纳豆菌发酵液喷干粉与溶剂按1∶3-8的质量比 混合,更优选以1∶3-6的质量比混合,在15-40℃的温度下,以20-60rpm 搅拌速率搅拌20-40min,固液分离,所得清液即为浸溶液。其中,固液分离 可以采用本领域技术人员已知的任意一种固液分离方式,例如静置沉淀、过 滤、离心分离等方法中的任意一种或多种结合的方式。此外,对于所得固体 可以进行多次提取或浸溶(多次提取或浸溶可以尽可能提高收率)。

根据本发明的一个实施方式,在步骤1)中,所述溶剂选自甲醇、石油 醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯和75-100体 积%乙醇中的一种或多种。更优选情况下,所述溶剂选自石油醚、丙酮、二 氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯和75-100体积%乙醇中的一种或多种。

根据本发明的一个实施方式,在步骤2)和步骤3)中,所述浓缩可以为 减压浓缩或蒸发浓缩。本发明优选减压浓缩。所述减压浓缩的条件包括:温 度为40-95℃,真空度小于3000Pa。

根据本发明的一个实施方案,将步骤2)获得的浸膏以湿法上柱脱色包 括:将硅胶和石油醚按1∶1.5-2质量比混匀后装柱,再将步骤2)获得的浸膏 和石油醚按1∶0.5-1质量比混匀后上柱。

根据本发明的一个实施方案,在步骤3)中,所述柱层析的方法包括: 首先将步骤2)获得的浸膏以湿法上柱脱色,并以第一淋洗剂洗脱;然后将 脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化,即先以湿法装柱,再将脱 色后的产物以干法装柱的方式装填于湿法装柱的上层,并以第二淋洗剂洗脱, 其中湿法干法混合上柱的柱中,湿法装柱与干法装柱的体积比为1∶0.2-2。

根据本发明的一个实施方式,在步骤3)中,所述第一淋洗剂为非极性 溶剂,优选为石油醚、正己烷和环己烷中的一种或多种。所述第一淋洗剂的 用量为层析柱体积的2-3倍。

根据本发明的一个实施方式,将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式 进行纯化包括:先将硅胶和石油醚以1∶1.5-2的质量比混匀后装柱;再将脱 色后的产物与硅胶和石油醚以1∶3-4∶4-5的质量比混合、阴干后装填在先以 湿法装填的柱中。

根据本发明的一个实施方式,所述在湿法干法混合上柱的柱中,所述湿 法装柱与所述干法装柱的体积比为1∶0.2-2(即1-10∶2)时,即可有利于提 高维生素MK-7的收率,优选情况下,所述湿法装柱与所述干法装柱的体积 比为1∶0.5-1(即1-2∶1),更有利于提高维生素MK-7的收率。本发明通过 采用湿法干法混合上柱的柱层析,可以更有效的吸附杂质,分离效果更好, 并且适当的提高湿法装柱与干法装柱的体积比可以提高产品纯度;另外, MK-7纯度与收率较高的同时填料用量也较少。

根据本发明的一个实施方式,所述柱层析可以为硅胶柱层析、大孔树脂 柱层析、Sephadex LH20凝胶柱层析和聚酰胺柱层析中的任意一种或其组合。

根据本发明的一个实施方式,所述湿法装柱和所述干法装柱中使用的硅 胶可以为本领域技术人员已知的能够用于层析柱的硅胶。优选情况下,所述 硅胶为100-400目之间,小孔(例如,比表面积≥550m2/g,孔容≤0.7mL/g)、 中孔(例如,比表面积为大于300m2/g至小于550m2/g,孔容为大于0.7mL/g 至小于0.9mL/g)或粗孔(例如,比表面积为200m2/g至小于300m2/g,孔 容为≥0.85mL/g)的硅胶。

根据本发明的一个实施方式,在步骤3)中,柱层析分离的方法可以采 用本领域技术人员已知的方法,本发明没有特别要求。例如柱层析分离可以 在低压(小于0.5MPa)、中压(0.5-5MPa)或高压(大于5MPa至40MPa) 下进行分离。

根据本发明的一个实施方式,在步骤3)中,所述第二淋洗剂选自石油 醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、异丙醇、正丁醇、 丙酮、甲醇、乙醇、乙腈和水中的一种或多种。更优选情况下,所述第二淋 洗剂选自石油醚、体积比为1∶9的二氯甲烷和石油醚的混合物或者体积比为 1∶9的三氯甲烷和石油醚的混合物。所述第二淋洗剂的用量为:所述石油醚 的用量为层析柱体积的10-15倍,所述体积比为1∶9的二氯甲烷和石油醚的 混合物的用量为层析柱体积的4-5倍,所述体积比为1∶9的三氯甲烷和石油 醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍。

根据本发明的一个实施方式,在步骤4)中,将所述甲萘醌-7粗品结晶 提纯包括:将所述甲萘醌-7粗品用溶剂进行结晶以及重结晶。优选情况下, 所述溶剂可以选自石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙 酯、异丙醇、正丁醇、丙酮、甲醇、乙醇、乙腈和水中的一种或多种。

根据本发明的一个实施方式,在步骤4)中,可以采用蒸发结晶或冷却 结晶,结晶的温度可以为-10℃至95℃。优选地,在结晶析出过滤后,洗涤 结晶,并进行重结晶,以提高最终获得的甲萘醌-7的纯度。

根据本发明的方法,能够获得纯度和收率较高的维生素MK-7。优选情况 下,通过向纳豆菌发酵液中添加0.1-1重量%的大豆油,有效保护了所述纳豆 菌发酵液中维生素MK-7不被喷干过程的高温破坏,从而提高了纳豆菌发酵 液中维生素MK-7的量,提高了维生素MK-7的收率;同时,通过湿法上柱 脱色以及湿法干法混合上柱纯化的方式,简化了纯化步骤,提高了效率,并 且提高了维生素MK-7的纯度。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与 下面的具体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在 附图中:

图1是根据本发明实施例1的方法获得的产物的液相色谱图。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述,这些描述并不是对本发明 内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解,对本发明技术特征所作的 等同替换,或相应的改进,仍属于本发明的保护范围之内。

以下实施例中所用试剂均来自商购。

维生素MK-7的纯度通过美国waters公司高效液相色谱仪测量。

维生素MK-7的收率通过下式计算:

MK-7的收率=MK-7纯品纯度×MK-7纯品重量×100%/(发酵液中 MK-7浓度×发酵液体积)

实施例1

制备纳豆菌发酵液:

将纳豆(购自日本生物科技公司)用无菌水溶解、稀释后涂抹在琼脂糖- 纤维蛋白平板(制作方法参见:魏华、赵祥颖、刘建军,纳豆激酶的活性测 定[J].山东轻工业学院学报,2007,21(1)60-63.)上,在37℃培养18h后产生 透明圈,选择透明圈较大的菌落利用紫外线(15s)多代诱变,得到纳豆枯草 芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188(菌种保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏 日期:2013年10月31日,保藏号为:CGMCC No.8400)。

将500mL所得纳豆枯草芽孢杆菌ST188接种在含有185g黄豆粉和185g 蔗糖的10000mL培养基中,在37℃,经过24小时发酵获得纳豆菌发酵液。

(1)向1000g纳豆菌发酵液中添加5g的大豆油然后在90℃喷干,用 240g的甲醇浸溶40g纳豆菌发酵液喷干粉,所述浸溶在20℃以40rpm搅 拌速率搅拌30min的条件下进行,固液分离后获得浸溶液;将获得的固体采 用相同的浸溶条件进行第二次浸溶;

(2)将步骤(1)获得的浸溶液过滤后在55℃,2600Pa下减压浓缩, 得到浸膏;

(3)先将8g硅胶与石油醚按1∶2质量比混匀后装柱,再将步骤(2) 获得的8g浸膏与石油醚以1∶1的质量比湿法装柱,并用40g石油醚作为第 一淋洗剂进行洗脱(在0.1MPa)1次;

(4)先将硅胶和石油醚以1∶2的质量比混匀后湿法装柱,再将步骤(3) 用第一淋洗剂洗脱获得的脱色产物与硅胶和石油醚以1∶3∶4的质量比混合、 阴干后装填在先以湿法装填的柱中,湿法装柱与干法装柱的体积比为1∶1, 并用80g体积比为1∶9三氯甲烷和石油醚的混合物作为第二淋洗剂进行洗 脱(在1MPa下)1次,通过此操作可以一步纯化就得到纯度为40%的维生 素MK-7;

(5)将步骤(4)获得的混合物用其30倍质量的正丁醇溶解,然后蒸发 结晶,对获得的晶体进行重结晶,最终获得的产物经高效液相色谱仪获得的 色谱图如图1所示,由图1可以看出最终获得的产物中含有大量的维生素 MK-7。经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为95%,所得维生素MK-7 的收率为93%。

实施例2

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7,不同的是, 在步骤(4)中,湿法装柱与干法装柱的体积比为2∶1。

最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为99%,所 得维生素MK-7的收率为93%。

实施例3

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7,不同的是, 在步骤(4)中,湿法装柱与干法装柱的体积比为1∶2。

最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为93%,所 得维生素MK-7的收率为92%。

实施例4

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7,不同的是, 在步骤(4)中,先将硅胶和石油醚以1∶1.5的质量比混匀后湿法装填柱的 部分,再将步骤(3)获得的混合物脱色后与硅胶和石油醚以1∶4∶5的质量 比混合、阴干后装填在先以湿法装填的柱中。

最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为94%,所 得维生素MK-7的收率为93%。

实施例5

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7,不同的是, 在步骤(1)中,向1000g纳豆菌发酵液中添加10g的大豆油。

最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为96%,所 得维生素MK-7的收率为95%。

实施例6

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7,不同的是, 在步骤(1)中,向1000g纳豆菌发酵液中添加1g的大豆油。

最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为95%,所 得维生素MK-7的收率为90%。

实施例7

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7,不同的是, 在步骤(1)中,向纳豆菌发酵液中不添加大豆油。

最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为93%,所 得维生素MK-7的收率为80%。

实施例8

采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7,不同的是, 在步骤(4)中,层析柱直接采用干法装柱即步骤(3)所获得产物与硅胶和 石油醚按1∶4∶4质量比混匀后阴干,再装柱,用10倍柱床体积的石油醚淋 洗,一步纯化后的MK-7纯度为30%。为了获得较高的产物纯度,进行3次 重复。

最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为90%,所 得维生素MK-7的收率为90%。

通过以上实施例可以看出,采用本发明提供的提纯维生素MK-7的方法, 能够获得纯度较高,收率较高的维生素MK-7。

本申请包括但不限于以上实施例,凡是在本申请精神的原则下进行的任 何等同替代或局部改进,都将视为在本申请的保护范围之内。

一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法.pdf_第1页
第1页 / 共11页
一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法.pdf_第2页
第2页 / 共11页
一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法.pdf_第3页
第3页 / 共11页
点击查看更多>>
资源描述

《一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法.pdf(11页珍藏版)》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 103898175 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103898175 A (21)申请号 201410129217.2 (22)申请日 2014.03.31 CGMCC No.8400 2013.10.31 C12P 7/66(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 广东双骏生物科技有限公司 地址 515071 广东省汕头市汕头保税区 C03 地块双骏生物科技园 (72)发明人 陈杰鹏 段丽丽 陈煜藩 陈鸿锐 邱雪莲 蔡桂珠 洪琳 胡留松 黄晓莹 张岳霖 许志锴 (74)专利。

2、代理机构 北京安信方达知识产权代理 有限公司 11262 代理人 苏蕾 郑霞 (54) 发明名称 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维 生素甲萘醌 -7 的方法 (57) 摘要 本 发 明 提 供 了 一 种 纳 豆 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis natto)ST188,CGMCC No.8400 以及一种用该菌株提纯高纯度的维生素 甲萘醌 -7 的高收率方法。该方法包括以下步骤 : 1) 将所述纳豆菌发酵液喷雾干燥, 用溶剂提取或 浸溶纳豆菌发酵液喷干粉, 获得浸溶液 ; 2) 将步 骤 1) 获得的浸溶液浓缩得到浸膏 ; 3) 将步骤 2) 获得的浸膏通过。

3、柱层析, 并进行梯度或等度洗脱, 收集液浓缩, 得到甲萘醌 -7 粗品 ; 4) 将步骤 3) 得 到的甲萘醌 -7 粗品结晶提纯, 即得所述维生素甲 萘醌 -7 纯品。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103898175 A CN 103898175 A 1/2 页 2 1. 一种提纯维生素甲萘醌 -7 的方法, 该方法包括以下步骤 : 1) 将纳豆菌发酵液喷雾干燥, 用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉, 。

4、获得浸溶液, 所述纳豆菌为纳豆枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) ST188, 保藏号为 :CGMCC No.8400 ; 2) 将步骤 1) 获得的浸溶液浓缩得到浸膏 ; 3) 将步骤 2) 获得的浸膏通过柱层析, 并进行梯度或等度洗脱, 将收集液浓缩, 得到甲萘 醌 -7 粗品 ; 4) 将步骤 3) 得到的甲萘醌 -7 粗品结晶提纯, 即得所述维生素甲萘醌 -7 纯品。 2. 根据权利要求 1 所述的方法, 其中, 在步骤 1) 中, 将纳豆菌发酵液喷雾干燥前, 向所 述纳豆菌发酵液中添加 0.1-1 重量 % 的大豆油。 3. 根据权利要求 1 所述的方法。

5、, 其中, 在步骤 3) 中, 所述柱层析的方法包括 : 首先将步 骤 2) 获得的所述浸膏以湿法上柱脱色, 并以第一淋洗剂洗脱 ; 然后将脱色后的产物以湿法 干法混合上柱方式进行纯化, 即先以湿法装柱, 再将脱色后的产物以干法装柱的方式装填 于湿法装柱的上层, 并以第二淋洗剂洗脱, 其中湿法干法混合上柱的柱中, 所述湿法装柱与 所述干法装柱的体积比为 1 0.2-2。 4. 根据权利要求 1 所述的方法, 其中, 在步骤 1) 中, 所述提取或浸溶条件包括 : 将纳豆 菌发酵液喷干粉与溶剂按13-8的质量比混合, 在15-40的温度下, 以20-60rpm搅拌速 率搅拌 20-40min, 。

6、固液分离, 所得清液即为浸溶液。 5. 根据权利要求 1-4 中任意一项所述的方法, 其中, 在步骤 1) 中, 所述溶剂选自甲醇、 石油醚、 丙酮、 二氯甲烷、 三氯甲烷、 异丙醇、 乙酸乙酯、 乙酸丁酯和 75-100 体积 % 乙醇中的 一种或多种。 6. 根据权利要求 1-4 中任意一项所述的方法, 其中, 在步骤 2) 以及步骤 3) 中, 所述浓 缩为减压浓缩, 所述减压浓缩的条件包括 : 温度为 40-95, 真空度小于 3000Pa。 7. 根据权利要求 3 所述的方法, 其中, 将步骤 2) 获得的所述浸膏以湿法上柱脱色包 括 : 将硅胶和石油醚按 1 1.5-2 质量比混匀。

7、后装柱, 再将步骤 2) 获得的浸膏和石油醚按 1 0.5-1 质量比混匀后上柱。 8. 根据权利要求 3 或 7 所述的方法, 其中, 所述第一淋洗剂为非极性溶剂, 优选为石油 醚、 正己烷和环己烷中的一种或多种 ; 所述第一淋洗剂的用量为层析柱体积的 2-3 倍。 9. 根据权利要求 3 所述的方法, 其中, 将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行 纯化包括 : 先将硅胶和石油醚以 1 1.5-2 的质量比混匀后装柱 ; 再将所述脱色后的产物 与硅胶和石油醚以 1 3-4 : 4-5 的质量比混合、 阴干后装填在先以湿法装填的柱中。 10. 根据权利要求 3 或 9 所述的方法, 其中,。

8、 所述第二淋洗剂选自石油醚、 体积比为 19的二氯甲烷和石油醚的混合物或者体积比为19的三氯甲烷和石油醚的混合物, 其 中, 所述石油醚的用量为层析柱体积的 10-15 倍, 所述体积比为 1 9 的二氯甲烷和石油醚 的混合物的用量为层析柱体积的 4-5 倍, 所述体积比为 1 9 的三氯甲烷和石油醚的混合 物的用量为层析柱体积的 4-5 倍。 11. 根据权利要求 1-4 中任一项所述的方法, 其中所述纳豆菌发酵液为将所述纳豆枯 草芽孢杆菌 ST188 接种在含有 10-50g/1000mL 黄豆粉和 5-45g/1000mL 蔗糖的培养基中, 在 30-40, 经过 20-48 小时发酵获。

9、得纳豆菌发酵液, 其中所述纳豆枯草芽孢杆菌 ST188 的接 权 利 要 求 书 CN 103898175 A 2 2/2 页 3 种浓度为 5-20%。 12. 一种纳豆枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) ST188, 保藏号为 :CGMCC No.8400。 权 利 要 求 书 CN 103898175 A 3 1/7 页 4 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘 醌 -7 的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种纳豆枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) ST188, CGMCC No.8400, 以及由该菌株提纯维生素。

10、甲萘醌 -7 的方法。 背景技术 0002 由于维生素 K 具有促进凝血的作用 , 又被称为凝血维生素。近半个世纪以来, 人 们对维生素 K 的认识仅限于其对凝血系统的影响, 直到 1960 年 Bouckaert 发现维生素 K 可 以促进兔子的骨折愈合。1975 年, Pettifor 等首次提出维生素 K 参与人体骨代谢的假说之 后, 人们对维生素 K 在骨骼新陈代谢的作用才有了深入的认识。 0003 维生素 K 族包括数个脂溶性的 2- 甲基 -1,4- 萘醌衍生物。天然的维生素 K 包括 维生素 K1(即叶绿醌) 和维生素 K2(即甲萘醌类) , 其以在 2- 甲基 -1,4- 萘醌。

11、环状结构的 3 号位置上的亲脂性侧链为特征。叶绿醌的侧链是确定长度的不饱和烃链, 甲萘醌的侧链则 是不确定长度的不饱和烃链。 (维生素 K1 即叶绿醌为一种化合物, 维生素 K2 为一系列化合 物) 0004 维生素 K2 不单有促进凝血、 改善动脉硬化的作用, 国外也有作者在研究其对肝癌 和白血病的作用。现在我国已进入老龄化社会, 骨质疏松患者发病率较高。大量资料研究 表明, 维生素 K2 缺乏可导致老年人髋骨骨折和骨密度降低。维生素 K2 缺乏, 血清未羧化骨 钙蛋白水平降低, 血清羧化骨钙蛋白水平也可能降低, 从而可能导致老年人骨密度降低发 生髋骨骨折危险。 0005 维生素 K2 作为。

12、一种营养物质, 并可以作为骨代谢调整物质, 覆盖全身的作用 ; 副 作用较少, 呈脂溶性, 可以饭后服用, 不论什么年龄都适宜使用。 (邹志强, 维生素 K2 的研究 进展, 中国骨质疏松杂志, 2005, 11(3) : 389-392) 0006 1995 年日本开始将维生素 K2 制剂作为改善骨量减少、 疼痛的骨质疏松症的药物 销售。 (王理明, 维生素 K2 与骨质疏松, 2007, 26(4) : 293-295) 0007 维生素 K2(2- 甲基 -3- 全反式 - 聚戊烯 -1,4- 萘醌) 或甲萘醌类是一族异戊烯 基衍生物。由 5 个碳原子组成的异戊二烯残基的数量可用于区分甲。

13、萘醌系化合物。其命名 规则是基于异戊二烯基的数量, 例如 “甲萘醌” 或 “MK” 之后加上基团的数量。尽管甲萘醌 侧链上已经被发现最多达到15个异戊二烯基, 但在人类和动物组织中出现的只有含有2到 13 个异戊二烯基的甲萘醌。脱甲基化的甲萘醌, 即在 2 号碳原子位点上未结合的甲萘醌也 已经被发现。 0008 维生素 K2 的一般性名称或常用名为甲萘醌, 其基本成分为甲萘醌 -4(MK-4) 和甲 萘醌 -7(MK-7) 。已知 MK-7 是活性最强的维生素 K2 中的一种。 0009 叶绿醌及 2 种常见的甲萘醌结构图如下所示。 0010 维生素 K1 0011 分子量 : 450 说 明。

14、 书 CN 103898175 A 4 2/7 页 5 0012 0013 甲萘醌 -4 0014 分子量 : 444 0015 甲萘醌 -7 0016 分子量 : 649 0017 0018 然而目前, 还没有一种能够简单、 高效的提纯维生素 K2 的方法, 尤其是提纯维生 素 K2 的 MK-7 的方法。 发明内容 0019 本发明的目的是提供一种纳豆枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) ST188,CGMCC No.8400 以及一种用该菌株提纯维生素甲萘醌 -7(MK-7) 的方法。该方法简 单高效, 并且能够获得维生素 MK-7 较高的纯度和收率。 002。

15、0 本发明所提供的纳豆枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) ST188, 保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心, 地址 : 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号, 保藏日期 : 2013 年 10 月 31 日, 保藏号为 :CGMCC No.8400。 0021 本发明提供的提纯维生素甲萘醌 -7 的方法包括以下步骤 : 0022 1) 将纳豆菌发酵液喷雾干燥, 用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉, 获得浸溶 液, 所述纳豆菌为纳豆枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) ST188, 保藏号为 :CGMCC No.8400。

16、 ; 0023 2) 将步骤 1) 获得的浸溶液浓缩得到浸膏 ; 0024 3) 将步骤 2) 获得的浸膏通过柱层析, 并进行梯度或等度洗脱, 将收集液浓缩, 得到 甲萘醌 -7 粗品 ; 0025 4) 将步骤 3) 得到的甲萘醌 -7 粗品结晶提纯, 即得所述维生素甲萘醌 -7 纯品。 0026 美国大豆出口理事会 (USSEC) 定义纳豆为发酵大豆制品。亚洲部分国家的日常食 物均为发酵大豆制品, 包括酱油、 味噌、 腐乳、 纳豆、 天贝、 豆豉、 霉豆渣、 酱糗子等。 发酵大豆 说 明 书 CN 103898175 A 5 3/7 页 6 制品的不同之处在于, 大豆作为酶解基质有时与谷物。

17、结合使用, 参与发酵过程的微生物亦 有所不同。而纳豆是完全以大豆经过芽孢杆菌或纳豆枯草杆菌发酵而来的。本申请所述的 纳豆菌发酵液是以黄豆粉经过纳豆枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) 发酵而获得 的发酵液。所述纳豆枯草芽孢杆菌可以从市购的日本传统食品纳豆中分离获得。 0027 根据本发明的一个实施方式, 所述纳豆菌发酵液可以为将所述纳豆枯草芽孢杆菌 ST188 接种在含有 10-50g/1000mL 黄豆粉和 5-45g/1000mL 蔗糖的培养基中, 在 30-40, 经过 20-48 小时发酵获得纳豆菌发酵液, 其中所述纳豆枯草芽孢杆菌 ST188 的接种浓度为。

18、 5-20%。 0028 根据本发明的一个实施方式, 在喷雾干燥 (本发明中简称 : 喷干) 所述纳豆菌发酵 液之前, 通过向所述纳豆菌发酵液中添加大豆油, 可以有效保护所述纳豆菌发酵液中维生 素 MK-7 不被喷干过程的高温破坏, 因此, 有助于提高 MK-7 的收率。 0029 根据本发明的一个实施方式, 只要向所述纳豆菌发酵液中添加的大豆油即可有利 于提高维生素 MK-7 的收率。优选情况下, 向纳豆菌发酵液中添加 0.1-1 重量 % 的大豆油, 更有利于提高维生素 MK-7 的收率。 0030 根据本发明的一个实施方式, 在步骤 1) 中, 将喷干水分控制在 3% 以下, 从而有利 。

19、于 MK-7 的提取。同时, 采用喷干粉来提取, 比发酵液直接用有机溶剂萃取, 可以减少 80% 的 有机溶剂的用量, 同时因为含水少而有利于减压浓缩。 0031 根据本发明的一个实施方法, 在步骤 1) 中, 用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干 粉的条件包括 : 将纳豆菌发酵液喷干粉与溶剂按 1 3-8 的质量比混合, 更优选以 1 3-6 的质量比混合, 在 15-40的温度下, 以 20-60rpm 搅拌速率搅拌 20-40min, 固液分离, 所得 清液即为浸溶液。 其中, 固液分离可以采用本领域技术人员已知的任意一种固液分离方式, 例如静置沉淀、 过滤、 离心分离等方法中的任意一种或多。

20、种结合的方式。此外, 对于所得固 体可以进行多次提取或浸溶 (多次提取或浸溶可以尽可能提高收率) 。 0032 根据本发明的一个实施方式, 在步骤 1) 中, 所述溶剂选自甲醇、 石油醚、 丙酮、 二氯 甲烷、 三氯甲烷、 异丙醇、 乙酸乙酯、 乙酸丁酯和 75-100 体积 % 乙醇中的一种或多种。更优 选情况下, 所述溶剂选自石油醚、 丙酮、 二氯甲烷、 异丙醇、 乙酸乙酯和75-100体积%乙醇中 的一种或多种。 0033 根据本发明的一个实施方式, 在步骤 2) 和步骤 3) 中, 所述浓缩可以为减压浓缩或 蒸发浓缩。本发明优选减压浓缩。所述减压浓缩的条件包括 : 温度为 40-95,。

21、 真空度小于 3000Pa。 0034 根据本发明的一个实施方案, 将步骤 2) 获得的浸膏以湿法上柱脱色包括 : 将硅胶 和石油醚按 1 1.5-2 质量比混匀后装柱, 再将步骤 2) 获得的浸膏和石油醚按 1 0.5-1 质量比混匀后上柱。 0035 根据本发明的一个实施方案, 在步骤 3) 中, 所述柱层析的方法包括 : 首先将步骤 2) 获得的浸膏以湿法上柱脱色, 并以第一淋洗剂洗脱 ; 然后将脱色后的产物以湿法干法混 合上柱方式进行纯化, 即先以湿法装柱, 再将脱色后的产物以干法装柱的方式装填于湿法 装柱的上层, 并以第二淋洗剂洗脱, 其中湿法干法混合上柱的柱中, 湿法装柱与干法装柱。

22、的 体积比为 1 0.2-2。 0036 根据本发明的一个实施方式, 在步骤 3) 中, 所述第一淋洗剂为非极性溶剂, 优选为 说 明 书 CN 103898175 A 6 4/7 页 7 石油醚、 正己烷和环己烷中的一种或多种。所述第一淋洗剂的用量为层析柱体积的 2-3 倍。 0037 根据本发明的一个实施方式, 将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化 包括 : 先将硅胶和石油醚以 1 1.5-2 的质量比混匀后装柱 ; 再将脱色后的产物与硅胶和 石油醚以 1 3-4 4-5 的质量比混合、 阴干后装填在先以湿法装填的柱中。 0038 根据本发明的一个实施方式, 所述在湿法干法混合上柱。

23、的柱中, 所述湿法装柱与 所述干法装柱的体积比为 1 0.2-2(即 1-10 2) 时, 即可有利于提高维生素 MK-7 的收 率, 优选情况下, 所述湿法装柱与所述干法装柱的体积比为 1 0.5-1 (即 1-2 1) , 更有利 于提高维生素 MK-7 的收率。本发明通过采用湿法干法混合上柱的柱层析, 可以更有效的吸 附杂质, 分离效果更好, 并且适当的提高湿法装柱与干法装柱的体积比可以提高产品纯度 ; 另外, MK-7 纯度与收率较高的同时填料用量也较少。 0039 根据本发明的一个实施方式, 所述柱层析可以为硅胶柱层析、 大孔树脂柱层析、 Sephadex LH20 凝胶柱层析和聚酰。

24、胺柱层析中的任意一种或其组合。 0040 根据本发明的一个实施方式, 所述湿法装柱和所述干法装柱中使用的硅胶可以为 本领域技术人员已知的能够用于层析柱的硅胶。优选情况下, 所述硅胶为 100-400 目之间, 小孔 (例如, 比表面积 550m2/g, 孔容 0.7mL/g) 、 中孔 (例如, 比表面积为大于 300m2/g 至 小于 550m2/g, 孔容为大于 0.7mL/g 至小于 0.9mL/g) 或粗孔 (例如, 比表面积为 200m2/g 至 小于 300m2/g, 孔容为 0.85mL/g) 的硅胶。 0041 根据本发明的一个实施方式, 在步骤 3) 中, 柱层析分离的方法可。

25、以采用本领域技 术人员已知的方法, 本发明没有特别要求。 例如柱层析分离可以在低压 (小于0.5MPa) 、 中压 (0.5-5MPa) 或高压 (大于 5MPa 至 40MPa) 下进行分离。 0042 根据本发明的一个实施方式, 在步骤 3) 中, 所述第二淋洗剂选自石油醚、 正己烷、 环己烷、 二氯甲烷、 三氯甲烷、 乙酸乙酯、 异丙醇、 正丁醇、 丙酮、 甲醇、 乙醇、 乙腈和水中的一 种或多种。更优选情况下, 所述第二淋洗剂选自石油醚、 体积比为 1 9 的二氯甲烷和石油 醚的混合物或者体积比为19的三氯甲烷和石油醚的混合物。 所述第二淋洗剂的用量为 : 所述石油醚的用量为层析柱体积。

26、的 10-15 倍, 所述体积比为 1 9 的二氯甲烷和石油醚的 混合物的用量为层析柱体积的 4-5 倍, 所述体积比为 1 9 的三氯甲烷和石油醚的混合物 的用量为层析柱体积的 4-5 倍。 0043 根据本发明的一个实施方式, 在步骤 4) 中, 将所述甲萘醌 -7 粗品结晶提纯包括 : 将所述甲萘醌 -7 粗品用溶剂进行结晶以及重结晶。优选情况下, 所述溶剂可以选自石油 醚、 正己烷、 环己烷、 二氯甲烷、 三氯甲烷、 乙酸乙酯、 异丙醇、 正丁醇、 丙酮、 甲醇、 乙醇、 乙腈 和水中的一种或多种。 0044 根据本发明的一个实施方式, 在步骤 4) 中, 可以采用蒸发结晶或冷却结晶,。

27、 结晶的 温度可以为 -10至 95。优选地, 在结晶析出过滤后, 洗涤结晶, 并进行重结晶, 以提高最 终获得的甲萘醌 -7 的纯度。 0045 根据本发明的方法, 能够获得纯度和收率较高的维生素 MK-7。优选情况下, 通过 向纳豆菌发酵液中添加 0.1-1 重量 % 的大豆油, 有效保护了所述纳豆菌发酵液中维生素 MK-7 不被喷干过程的高温破坏, 从而提高了纳豆菌发酵液中维生素 MK-7 的量, 提高了维生 素 MK-7 的收率 ; 同时, 通过湿法上柱脱色以及湿法干法混合上柱纯化的方式, 简化了纯化 步骤, 提高了效率, 并且提高了维生素 MK-7 的纯度。 说 明 书 CN 103。

28、898175 A 7 5/7 页 8 附图说明 0046 附图是用来提供对本发明的进一步理解, 并且构成说明书的一部分, 与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明, 但并不构成对本发明的限制。在附图中 : 0047 图 1 是根据本发明实施例 1 的方法获得的产物的液相色谱图。 具体实施方式 0048 下面将通过实施例对本发明作进一步的描述, 这些描述并不是对本发明内容作进 一步的限定。本领域的技术人员应理解, 对本发明技术特征所作的等同替换, 或相应的改 进, 仍属于本发明的保护范围之内。 0049 以下实施例中所用试剂均来自商购。 0050 维生素 MK-7 的纯度通过美国 waters 。

29、公司高效液相色谱仪测量。 0051 维生素 MK-7 的收率通过下式计算 : 0052 MK-7 的收率 =MK-7 纯品纯度 MK-7 纯品重量 100% (发酵液中 MK-7 浓度 发酵液体积) 0053 实施例 1 0054 制备纳豆菌发酵液 : 0055 将纳豆 (购自日本生物科技公司) 用无菌水溶解、 稀释后涂抹在琼脂糖 - 纤维蛋白 平板 (制作方法参见 : 魏华、 赵祥颖、 刘建军, 纳豆激酶的活性测定 J. 山东轻工业学院学 报, 2007,21(1)60-63.) 上, 在 37培养 18h 后产生透明圈, 选择透明圈较大的菌落利用紫 外线 (15s) 多代诱变, 得到纳豆枯。

30、草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) ST188(菌种保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心, 地址 : 北京市朝阳区北辰西路 1 号 院 3 号, 保藏日期 : 2013 年 10 月 31 日, 保藏号为 :CGMCC No.8400) 。 0056 将 500mL 所得纳豆枯草芽孢杆菌 ST188 接种在含有 185g 黄豆粉和 185g 蔗糖的 10000mL 培养基中, 在 37, 经过 24 小时发酵获得纳豆菌发酵液。 0057 (1) 向 1000g 纳豆菌发酵液中添加 5g 的大豆油然后在 90喷干, 用 240g 的甲醇 浸溶 40g 纳。

31、豆菌发酵液喷干粉, 所述浸溶在 20以 40rpm 搅拌速率搅拌 30min 的条件下进 行, 固液分离后获得浸溶液 ; 将获得的固体采用相同的浸溶条件进行第二次浸溶 ; 0058 (2) 将步骤 (1) 获得的浸溶液过滤后在 55, 2600Pa 下减压浓缩, 得到浸膏 ; 0059 (3) 先将 8g 硅胶与石油醚按 1 2 质量比混匀后装柱, 再将步骤 (2) 获得的 8g 浸膏与石油醚以 1 1 的质量比湿法装柱, 并用 40g 石油醚作为第一淋洗剂进行洗脱 (在 0.1MPa) 1 次 ; 0060 (4) 先将硅胶和石油醚以 1 2 的质量比混匀后湿法装柱, 再将步骤 (3) 用第。

32、一淋 洗剂洗脱获得的脱色产物与硅胶和石油醚以 1 3 4 的质量比混合、 阴干后装填在先以 湿法装填的柱中, 湿法装柱与干法装柱的体积比为 1 1, 并用 80g 体积比为 1 9 三氯甲 烷和石油醚的混合物作为第二淋洗剂进行洗脱 (在 1MPa 下) 1 次, 通过此操作可以一步纯化 就得到纯度为 40% 的维生素 MK-7 ; 0061 (5) 将步骤 (4) 获得的混合物用其 30 倍质量的正丁醇溶解, 然后蒸发结晶, 对获得 的晶体进行重结晶, 最终获得的产物经高效液相色谱仪获得的色谱图如图1所示, 由图1可 说 明 书 CN 103898175 A 8 6/7 页 9 以看出最终获得。

33、的产物中含有大量的维生素 MK-7。经色谱分析确定产物中维生素 MK-7 的 纯度为 95%, 所得维生素 MK-7 的收率为 93%。 0062 实施例 2 0063 采用实施例 1 的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素 MK-7, 不同的是, 在步骤 (4) 中, 湿法装柱与干法装柱的体积比为 2 1。 0064 最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素 MK-7 的纯度为 99%, 所得维生素 MK-7 的收率为 93%。 0065 实施例 3 0066 采用实施例 1 的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素 MK-7, 不同的是, 在步骤 (4) 中, 湿法装柱与干法装柱的体积比为 1 2。。

34、 0067 最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素 MK-7 的纯度为 93%, 所得维生素 MK-7 的收率为 92%。 0068 实施例 4 0069 采用实施例 1 的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素 MK-7, 不同的是, 在步骤 (4) 中, 先将硅胶和石油醚以 1 1.5 的质量比混匀后湿法装填柱的部分, 再将步骤 (3) 获得的 混合物脱色后与硅胶和石油醚以 1 4 5 的质量比混合、 阴干后装填在先以湿法装填的 柱中。 0070 最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素 MK-7 的纯度为 94%, 所得维生素 MK-7 的收率为 93%。 0071 实施例 5 0072 采。

35、用实施例 1 的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素 MK-7, 不同的是, 在步骤 (1) 中, 向 1000g 纳豆菌发酵液中添加 10g 的大豆油。 0073 最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素 MK-7 的纯度为 96%, 所得维生素 MK-7 的收率为 95%。 0074 实施例 6 0075 采用实施例 1 的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素 MK-7, 不同的是, 在步骤 (1) 中, 向 1000g 纳豆菌发酵液中添加 1g 的大豆油。 0076 最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素 MK-7 的纯度为 95%, 所得维生素 MK-7 的收率为 90%。 0077 实施例。

36、 7 0078 采用实施例 1 的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素 MK-7, 不同的是, 在步骤 (1) 中, 向纳豆菌发酵液中不添加大豆油。 0079 最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素 MK-7 的纯度为 93%, 所得维生素 MK-7 的收率为 80%。 0080 实施例 8 0081 采用实施例 1 的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素 MK-7, 不同的是, 在步骤 (4) 中, 层析柱直接采用干法装柱即步骤 (3) 所获得产物与硅胶和石油醚按 1 4 4 质量比 混匀后阴干, 再装柱, 用10倍柱床体积的石油醚淋洗, 一步纯化后的MK-7纯度为30%。 为了 获得较高的产物纯。

37、度, 进行 3 次重复。 说 明 书 CN 103898175 A 9 7/7 页 10 0082 最终获得的产物经色谱分析确定产物中维生素 MK-7 的纯度为 90%, 所得维生素 MK-7 的收率为 90%。 0083 通过以上实施例可以看出, 采用本发明提供的提纯维生素 MK-7 的方法, 能够获得 纯度较高, 收率较高的维生素 MK-7。 0084 本申请包括但不限于以上实施例, 凡是在本申请精神的原则下进行的任何等同替 代或局部改进, 都将视为在本申请的保护范围之内。 说 明 书 CN 103898175 A 10 1/1 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 103898175 A 11 。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 >


copyright@ 2017-2020 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1