一种人源抗菌肽LL-37突变体及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610366249.3 (22)申请日 2016.05.30 (71)申请人 黄石市中心医院 地址 435000 湖北省黄石市天津路141号黄 石市中心医院检验科 (72)发明人 杨浩刘俊付靖瑜韩跃武 罗鹏程汪宏良 (74)专利代理机构 黄石市三益专利商标事务所 42109 代理人 吴运林 (51)Int.Cl. C07K 14/47(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 15/81(2006.01) A6。

2、1K 38/17(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称 一种人源抗菌肽LL-37突变体及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种人源抗菌肽LL-37突变体 及其应用， 通过对抗菌肽LL-37分子结构进行优 化设计， 将抗菌肽LL-37中的1号位亮氨酸、 3号位 甘氨酸、 16号位谷氨酸、 26号位天冬氨酸、 34号位 精氨酸、 35号位苏氨酸分别替换成： 甘氨酸、 亮氨 酸、 谷氨酰胺、 赖氨酸、 苏氨酸、 精氨酸， 实验结果 证明突变体具有。

3、优良的抗菌活性和稳定性； 本发 明主要用于 （a） 抑制细菌、 病毒的生长繁殖及肿 瘤细胞的增殖； 或 （b） 杀灭细菌、 病毒。 权利要求书1页 说明书8页 附图12页 CN 105859867 A 2016.08.17 CN 105859867 A 1.一种人源抗菌肽LL-37突变体， 其特征在于： 所述序列中第一个氨基酸为甘氨酸 （G） ， 第三个氨基酸为亮氨酸 （L） ， 第十六个氨基酸为谷氨酰胺 （Q） ， 第二十六个氨基酸为赖氨酸 （K） ， 第三十四个氨基酸为苏氨酸 （T） ， 第三十五个氨基酸为精氨酸 （R） ， 其它氨基酸残基序 列不变。 2.一种分离的多核苷酸， 其特征在于。

4、： 所述多核苷酸编码的多肽与人源抗菌肽LL-37相 比， 人源抗菌肽LL-37中的1号位亮氨酸、 3号位甘氨酸、 16号位谷氨酸、 26号位天冬氨酸、 34 号位精氨酸、 35号位苏氨酸被分别替换成： 甘氨酸、 亮氨酸、 谷氨酰胺、 赖氨酸、 苏氨酸、 精氨 酸。 3.一种载体， 其特征在于： 所述载体中含有如权利要求2所述的多核苷酸。 4.一种遗传工程化的宿主细胞， 其特征在于： 所述宿主细胞中含有如权利要求3所述的 载体。 5.一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法， 其特征在于： 包括以下步骤： （1） 利用蛋白质在线分析工具ExPasy、 序列对比软件MEGAsoftware、 。

5、蛋白质分析软件 Antheprot、 分子对接软件autodock和动力学模拟软件ADF2014(AmsterdamDensity Functional)对抗菌肽LL-37的序列进行分析， 为抗菌肽LL-37突变体设计提供理论基础； （2） 以分子对接和动力学模拟的结果为基础， 对抗菌肽LL-37部分氨基酸残基进行替换 或顺序调整， 得到其突变体， 在抗菌肽LL-37突变体基因的两端引入限制性酶切位点， 通过 酶切操作连接到酵母表达载体上； （3） 将表达载体转化导入GS115酵母菌中， 经提取后鉴定得到重组基因工程菌； （4） 重组基因工程菌经诱导表达后离心分离收集上清液， 经分离纯化获得重。

6、组抗菌肽 LL-37突变体蛋白。 6.根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法， 其特征在于： 所述抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签并引入限制性内切酶EcoR的酶切位点， 后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶XbaI的酶切位点。 7.根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法， 其特征在于： 所述载体为pPICZ A。 8.根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法， 其特征在于： 所述酵母菌为毕赤酵母。 9.根据权利要求5所述的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法， 其特征在于： 所述分离纯化方法为盐。

7、析、 沉淀、 液相层析技术和透析的结合。 10.一种人源抗菌肽LL-37突变体的应用， 其特征在于： 所述突变体用于 （a） 抑制细菌、 病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖； 或 （b） 杀灭细菌、 病毒。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105859867 A 2 一种人源抗菌肽LL-37突变体及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 具体是一种人源抗菌肽LL-37突变体及其应用。 背景技术 0002 抗菌肽是生物体天然免疫的重要组成成分， 自发现以来， 由于其分子量低、 抗菌谱 广， 抗菌机制独特而显示了其在医学和农业上潜在的研究价值和应用价值， 其研究及应用 已成为抗菌生。

8、物技术药物领域的研究热点。 0003 目前用于开发抗菌肽生物制剂主要是含有生物活性核心区域的内源性抗菌肽， 此 类多肽用于药品和食品领域， 主要存在以下问题： 要解决药效动力学、 毒理学、 以及潜在 的免疫毒性问题； 抗菌肽分子小， 容易被蛋白酶降解， 其稳定性有待提高； 小分子物质 的分离、 纯化困难； 抗菌肽的天然资源有限， 依靠化学合成抗菌肽成本较高， 而通过基因 工程在微生物体内直接表达基因， 要解决提高抗菌肽生产效率、 降低成本等问题； 与传统 的抗生素相比， 抗菌肽的抗菌活性还不够理想， 需要对抗菌肽做改良设计以提高其抗菌活 性。 0004 抗菌肽LL-37是来源于人的一种 -螺旋。

9、型阳离子抗菌肽， 它具有广谱抗菌活性， 可 以抗多种革兰氏阳性菌、 阴性菌和真菌， 而且还可通过免疫调节、 促进创伤修复、 诱导血管 生 成 等 ， 是 人 体 固 有 免 疫 防 御 系 统 的 重 要 组 成 部 分 。 文 献 T h e l i p i d A palmitoyltransferasePagP:molecularmechanismsandroleinbacterial pathogenesis 和 Biofilmsformedbygram-negativebacteriaundergoincreased lipidapalmitoylation,enhancinginv。

10、ivosurvival 中指出革兰氏阴性菌细胞外膜 的棕榈酰转移酶PagP被激活后通过对脂质A酰化， 修复细菌外膜通透性从而产生对抗菌肽 的抗性。 0005 目前， 抗生素滥用导致的药物残留和细菌耐药等问题越来越受到人们的重视， 细 菌对传统抗生素产生耐药性已成为亟待解决的全球性问题。 因此， 通过抑制脂质A酰化这一 途径， 研发新的抗菌药物， 是本发明课题研究的重要内容。 发明内容 0006 本发明的目的就是针对细菌耐药性的问题， 对抗菌肽LL-37进行优化设计， 提供一 种抗菌活性更好、 稳定性高的抗菌肽LL-37的突变体及其应用。 0007 本发明的一种人源抗菌肽LL-37突变体， 所述。

11、序列中第一个氨基酸为甘氨酸 （G） ， 第三个氨基酸为亮氨酸 （L） ， 第十六个氨基酸为谷氨酰胺 （Q） ， 第二十六个氨基酸为赖氨酸 （K） ， 第三十四个氨基酸为苏氨酸 （T） ， 第三十五个氨基酸为精氨酸 （R） ， 其它氨基酸残基序 列不变。 0008 本发明的一种分离的多核苷酸， 所述多核苷酸编码的多肽与人源抗菌肽LL-37相 比， 人源抗菌肽LL-37中的1号位亮氨酸、 3号位甘氨酸、 16号位谷氨酸、 26号位天冬氨酸、 34 号位精氨酸、 35号位苏氨酸被分别替换成： 甘氨酸、 亮氨酸、 谷氨酰胺、 赖氨酸、 苏氨酸、 精氨 说明书 1/8 页 3 CN 105859867 。

12、A 3 酸。 0009 本发明的一种载体， 所述载体中含有上述的多核苷酸。 0010 本发明的一种遗传工程化的宿主细胞， 所述宿主细胞中含有上述载体。 0011 本发明的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法， 包括以下步骤： （1） 利用蛋白质在线分析工具ExPasy、 序列对比软件MEGAsoftware、 蛋白质分析软件 Antheprot、 分子对接软件autodock和动力学模拟软件ADF2014(AmsterdamDensity Functional)对抗菌肽LL-37的核酸序列进行分析， 为抗菌肽LL-37突变体设计提供理论基 础； （2） 在抗菌肽LL-37突变体的两端引。

13、入限制性酶切位点， 通过酶切操作连接到酵母表达 载体上； （3） 将表达载体转化导入GS115酵母菌中， 经提取后鉴定得到重组基因工程菌； （4） 重组基因工程菌经诱导表达后离心分离收集上清液， 经分离纯化获得重组抗菌肽 LL-37突变体蛋白。 0012 本发明中所述抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签并引入限制性内切酶 EcoR的酶切位点， 后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶XbaI的酶切位点。 0013 本发明中所述载体为pPICZ A。 0014 本发明中所述酵母菌为毕赤酵母。 0015 本发明中所述分离纯化方法为现有技术盐析、 沉淀、 液相层析技术和透析的结合。 0016。

14、 本发明所述的突变体用于 （a） 抑制细菌、 病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖； 或 （b） 杀灭细菌、 病毒。 0017 本发明是基于抗菌肽LL-37不同长度的水解片段具有较好的生物学活性， 以革兰 阴性菌细胞膜棕榈酰转移酶PagP的耐药机制为基础， 阳离子抗菌肽通过细菌PhoP-PhoQ调 节系统调控调控细胞膜棕榈酰转移酶PagP表达与活性， 促进脂质A酰化， 进而影响阳离子抗 菌肽与细菌细胞膜的结合， 抑制抗菌肽活性。 以该途径为突破口， 结合 -螺旋型阳离子抗菌 肽两亲性、 -螺旋程度等因素对抗菌肽LL-37的氨基酸残基进行替换、 增减等方式， 重新设 计， 获得突变体的氨基酸序列和核苷。

15、酸序列。 0018 选取大肠埃希菌Escherichiacoli(strainK12)细胞细胞膜棕榈酰转移酶PagP 作为受体， 参见附图1， 以抗菌肽LL-37及其氨基酸残基为配体， 参见附图2， 进行分子对接和 动力学模拟。 0019 选取抗菌肽LL-375位苯丙氨酸到32位缬氨酸中间部位的氨基酸片段作为配体， 受体选取棕榈酰转移酶PagP外膜外侧。 使用AutoDock对抗菌肽LL-37片段与棕榈酰转移酶 PagP进行分子对接， 设定格点空间大小为60*60*603， 坐标为 （7.063， 32.452， 49.199） ， 采 用拉马克遗传算法对接。 0020 通过对接发现抗菌肽LL。

16、-37与棕榈酰转移酶PagP的结合位点， 参见附图3， 包括抗 菌肽LL-37中的GLU11， LEU28、 LYS12、 PHE27、 ILE13和PHE6， 棕榈酰转移酶PagP中的ARG94， TRP89， ASN65， SER3， GLU90、 GLU90， ASN100、 HIS102和THR92。 重复多次对接后确定最好的对 接构象， 对应的配体效率值见表1。 说明书 2/8 页 4 CN 105859867 A 4 0021 从上表1可以看出， 8种LL-37片段作为配体与受体对接时， 配体效率从-1.6100- 2.2389Kcal/mol， 为后续LL-37突变体的设计奠定了。

17、实验基础。 0022 利用ADF2014(AmsterdamDensityFunctional)软件， 采用ReaxFF方法， 首先对 抗菌肽LL-37和棕榈酰转移酶PagP进行优化， 获得最小能量结构下的原子位置和晶格参数。 然后， 设定ReaxFF模拟参数与条件， 在100*100*1003的周期性空间内， 采用随机均匀的方 式放入4个抗菌肽LL-37分子和1个棕榈酰转移酶PagP分子， 温度设定为室温298K， 采用 VelocityVerlet （NVT） 系综， 进行0皮秒内的内部压力弛豫分析， 使温度和压力在预定值附 近波动， 经过不同时间节点， 分析体系构象。 在对产物的识别分析。

18、中， 为研究分子的性质， 采 用密度泛函理论 （使用PBE-D3(BJ)泛函， TZ2P基组） 计算分子间键能。 0023 ReaxFF方法模拟表明： 在0皮秒时， 体系呈周期性地随机分布于单元为100*100*1003的空间内， 分子之间的 最短距离不小于2.5埃。 0024 体系经过8.75皮秒时， 由于LL-37与棕榈酰转移酶PagP的疏水基团互相融合发生 接触， 参见图4， 其中球形原子为LL-37与PagP发生接触的原子， 结构图中红色、 蓝色、 白色、 灰色小球分别表示O、 N、 H、 C原子， 左边区域来自抗菌肽LL-37， 右边区域来自棕榈酰转移酶 PagP。 0025 体系经。

19、历20皮秒， 没有观察到解离的趋势， 此时计算弱键-C-O-HNH2-CH2-的键 能为-14.97kcal/mol。 0026 上述研究结果表明， 抗菌肽LL-37与大肠埃希菌外膜上的棕榈酰转移酶PagP发生 接触的原子构象比较稳定， 其弱键-C-O-HNH2-CH2-的键能达到-14.97kcal/mol， 该键是连 接抗菌肽LL-37与棕榈酰转移酶PagP的重要桥梁， 其中-NH2来自抗菌肽LL-37分子的中部， 在抗菌肽LL-37弯折攀爬到棕榈酰转移酶PagP表面之后， -NH2基团被带到了接触区域， 进而 形成稳定的化学键。 0027 因此， 抗菌肽LL-37分子结构的柔性， 分子中。

20、的氨基在抗菌肽发挥抗菌活性的过程 说明书 3/8 页 5 CN 105859867 A 5 中扮演了重要角色， 同时为抗菌肽LL-37突变体设计提供了可靠的理论基础。 附图说明 0028 图1大肠埃希菌Escherichiacoli(strainK12)细胞细胞膜棕榈酰转移酶PagP 3D模式图； 图2抗菌肽hCAP-18/LL-373D模式图； 图3抗菌肽LL-37片段与棕榈酰转移酶PagP结合位点； 图4体系经过8.75皮秒后抗菌肽LL-37与棕榈酰转移酶PagP的 “纠缠” 结构； 图5抗菌肽LL-37及其突变体的亲疏水性氨基酸分布和螺旋图 （左边： 抗菌肽LL-37； 右 边： LL-。

21、37突变体） ； 图6抗菌肽LL-37突变体的色谱图； 图7抗菌肽LL-37突变体的质谱图； 图8抗菌肽LL-37及其突变体对临床1号菌株的抗菌活性图； 图9抗菌肽LL-37及其突变体对临床2号菌株的抗菌活性图； 图10抗菌肽LL-37及其突变体对临床3号菌株的抗菌活性图； 图11抗菌肽LL-37及其突变体对临床4号菌株的抗菌活性图； 图12抗菌肽LL-37及其突变体对临床5号菌株的抗菌活性图； 图13抗菌肽LL-37及其突变体对临床6号菌株的抗菌活性图； 图14抗菌肽LL-37及其突变体对临床7号菌株的抗菌活性图； 图15抗菌肽LL-37及其突变体对临床8号菌株的抗菌活性图； 图16抗菌肽L。

22、L-37及其突变体对临床9号菌株的抗菌活性图； 图17抗菌肽LL-37及其突变体对临床10号菌株的抗菌活性图； 图18抗菌肽LL-37及其突变体对临床11号菌株的抗菌活性图； 图19抗菌肽LL-37及其突变体对ATCC25922菌株的抗菌活性图； 图20抗菌肽LL-37及其突变体对ATCC35218菌株的抗菌活性图； 图21抗菌肽LL-37、 抗菌肽LL-37突变体及硫酸多粘菌素B对ATCC25922大肠埃希菌标准 菌株的抑菌率。 具体实施方式 0029 实施例1抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法 （1） 抗菌肽LL-37突变体基因的设计和合成 在抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签。

23、并引入限制性内切酶EcoR的酶切位 点， 后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶XbaI的酶切位点， 合成密码子优化基因， 连接到大肠杆菌克隆载体pUC57上， 得到重组载体pUC57-LL-37revised。 0030 （2） 重组抗菌肽LL-37突变体基因的表达载体构建 选择pPICZ A作为载体， 将上述重组载体pU57-LL-37revised经酶切、 纯化后与pPICZ A按照3:1的分子数进行连接， 进行转化与诱导表达。 0031 连接体系的配制： 2.5 L酵母表达载体pPICZ A， 9.0 L纯化的核酸片段， 4.0 L连接 酶缓冲液 （10倍） ， 0.5 LT4连接酶。

24、， 用二次蒸馏水补充至40 L混合均匀， 在16条件下放置 说明书 4/8 页 6 CN 105859867 A 6 12h， 形成混合物备用。 连接产物转化至感受态的大肠埃希菌感受态细胞DH5 中， 筛选重组 质粒。 0032 （3） 重组抗菌肽LL-37突变体基因的毕赤酵母工程菌构建 将筛选的重组质粒进行测序， 测序正确的质粒经SacI线性化处理后， 转入毕赤酵母 GS115。 接种入5mLYPD液体培养基中， 30， 250rpm振荡培养24h， 取1mL上述培养菌液接入 300mL/1000mL锥形瓶的YPD液体培养基中， 30， 250rpm培养至光密度 （OD） 达到1.3-1.5。

25、后， 在4， 1500g离心5min， 丢弃上清液， 加入300mL的预冷二次蒸馏水重悬菌体， 在4， 1500g 离心5min， 丢弃上清液， 加入150mL的预冷二次蒸馏水重悬菌体， 在4， 1500g离心5min， 丢 弃上清液， 加入20mL的预冷1mol/L无菌山梨醇溶液重悬菌体， 离心后， 丢弃上清液， 加入1mL 的预冷1mol/L无菌山梨醇溶液 （含10%-15%甘油） ， 轻轻混匀后， 10 L每管分装备用。 加入10 L线性质粒至100 L毕赤酵母菌GS115感受态细胞中， 轻轻摇匀后将混合物转移至电转杯中， 将电转杯至于冰块上5-10min， 电击10ms， 电压为10m。

26、s， 电阻为200， 电击完成后立即加入 1mL预冷山梨醇溶液， 婚后后转至1.5mL离心管中， 30静置或缓慢摇菌培养1h。 取200 L菌 液涂布在含100 g/mLZeocin的YPD平板上， 30培养3天后， 平板上即长出克隆， 随机挑选 10个克隆， 并在含Zeocin的YPD平板上划线纯化， 通过PCR鉴定阳性克隆菌pPICZ A-LL37 revised/GS115。 0033 （4） 重组抗菌肽LL-37突变体的诱导表达及纯化 挑取经PCR鉴定的阳性克隆， 接种至20mLBMGY培养基中， 30， 300rpm培养16-18h 至OD600=5； 3000g离心5min收集菌体。

27、， 加入少量BMGY培养基重悬菌体至OD600=1时转接至 200mLBMGY培养基中， 30， 300rpm摇菌培养并进行诱导表达； 每24h向培养基中补加100% 甲醇至其终浓度达0.5%， 连续诱导72h， 将培养后的菌液经超声处理， 裂解细胞， 离心后洗 涤、 溶解； 3000g离心5min收集培养上清定容后， 缓慢加入固体硫酸铵至其饱和度达到80%， 置于4沉降过夜； 10000g离心30min收集蛋白沉淀， 加入TBS(pH7.5） 溶解蛋白沉淀 后， 在TBS缓冲液中充分透析； 4， 8000g离心30min， 取上清， 使用0.45 m滤膜进行抽滤， 除 去大蛋白颗粒 ； 将T。

28、BS平衡的蛋白 样品上到TBS充分清洗的Ni-NTA亲和层析柱 (GEHealthcare)中， 再用TBS清洗柱子； 用含200mM咪挫的TBS缓冲液洗脱， 并收集洗脱峰， 将 收集的蛋白样品于PBS缓冲液中充分透析， 即得到了抗菌肽LL-37突变体蛋白。 0034 （5） 抗菌肽LL-37突变体检测 采用高效液相色谱分析上述抗菌肽LL-37突变体蛋白纯度， 参见图6； 采用质谱测定抗 菌肽LL-37突变体的分子大小， 参见图7。 0035 从图6可以看出， 从10min开始无杂峰出现， 抗菌肽LL-37突变体的出峰时间为 12.078min， 波峰单一、 波形呈正态分布， 抗菌肽LL-37。

29、突变体纯度达到96.85%， 可以用于抑 菌实验等活性的研究。 图7的质谱图显示， 突变体的分子量为4505.4Da， 与理论估计的分子 量一致， 说明该物质是目的多肽。 0036 实施例2抗菌肽LL-37突变体的应用 将本发明的抗菌肽LL-37突变体加入按照药剂学上常用辅料， 制成注射剂、 喷雾剂、 滴 剂、 贴剂、 软膏剂等。 0037 实施例3抗菌肽LL-37及其突变体的理化性能 利用蛋白质在线分析工具和蛋白质分析软件Antheprot， 分析抗菌肽LL-37及其突变体 说明书 5/8 页 7 CN 105859867 A 7 的系列及其理化性能， 得到抗菌肽LL-37及其突变体的核苷酸。

30、系列和理化性能表， 分别见下 表2和表3所示。 0038 从上表3可以看出， 抗菌肽LL-37突变体的理论等电点明显提高、 半衰期明显延长， 说明 在相同PH环境下， 抗菌肽LL-37突变体的净电荷量明显提高、 体外稳定性更好； 突变体的螺 旋程度和亲疏水性与抗菌肽LL-37相比， 未见明显差异， 参见附图5。 0039 实施例4抗菌肽LL-37突变体的抑菌活性 将合成所得的多肽， 采用抑菌实验研究其抗菌活性。 以临床收集分离得到的11种致病 大肠埃希菌和2种大肠埃希菌标准菌株为抑菌对象， 利用美国临床和实验室标准协会 （ClinicalandLaboratoryStandardsInstit。

31、ute， CLSI） 2012版检验标准及操作规范文 件M07-A9： MethodsforDilutionAntimicrobialsusceptibilityTestsfor BacterialThatGrowAerobically； ApprovedStandardNinthEdition做抑菌实验， 研 究多肽的抗菌活性。 0040 图8-图20表示经过浓度为0.625、 1.25、 2.5、 5、 10、 20、 40、 80、 160、 500 g/mL的抗菌 肽LL-37及其突变体处理过后的13株大肠埃希菌的光密度 （OD） 值的变化， 结果显示抗菌肽 LL-37及其突变体对13。

32、株大肠埃希菌均有不同程度抑制作用。 0041 图8表示LL-37及其突变体对临床1号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为2.5 g/ mL时， LL-37突变体对临床1号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p0.05） 。 0042 图9表示LL-37及其突变体对临床2号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为0.625 g/mL时， LL-37突变体对临床2号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p0.05） 。 0043 图10表示LL-37及其突变体对临床3号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为0.625 g/mL时， LL-37突变体对临床3号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增。

33、强 （p0.05） 。 说明书 6/8 页 8 CN 105859867 A 8 0044 图11表示LL-37及其突变体对临床4号菌株的抑菌作用， 结果显示LL-37与其突变 体对临床4号菌株的抑菌能力相当。 0045 图12表示LL-37及其突变体对临床5号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为2.5 g/mL时， LL-37突变体对临床5号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p0.05） 。 0046 图13表示LL-37及其突变体对临床6号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为0.625 g/mL时， LL-37突变体对临床6号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p0.05） 。

34、。 0047 图14表示LL-37及其突变体对临床7号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为1.25 g/mL时， LL-37突变体对临床7号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p0.05） 。 0048 图15表示LL-37及其突变体对临床8号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为1.25 g/mL时， LL-37突变体对临床8号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p0.05） 。 0049 图16表示LL-37及其突变体对临床9号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为5 g/mL 时， LL-37突变体对临床9号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p0.05） 。 0050 图。

35、17表示LL-37及其突变体对临床10号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为1.25 g/mL时， LL-37突变体对临床10号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p0.05） 。 0051 图18表示LL-37及其突变体对临床11号菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为1.25 g/mL时， LL-37突变体对临床11号菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p0.05） 。 0052 图19表示LL-37及其突变体对ATCC25922菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为 0.625 g/mL时， LL-37突变体对ATCC25922菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p 0.0。

36、5） 。 0053 图20表示LL-37及其突变体对ATCC35218菌株的抑菌作用， 结果显示在浓度为 0.625 g/mL时， LL-37突变体对ATCC35218菌株的抑菌效果与LL-37相比显著性增强 （p 0.05） 。 0054 从上述抑菌实验结果可以得出， LL-37及其突变体对13种不同大肠埃希菌株的最 小抑菌浓度 （MIC） ， 见下表4。 说明书 7/8 页 9 CN 105859867 A 9 0055 从表4可以看出， 抗菌肽LL-37及其突变体对13株不同大肠埃希菌株的最小抑菌浓 度均 20 g/mL， 除临床4号菌株最小抑菌浓度相同外， 抗菌肽LL-37突变体对其他。

37、12株大肠 埃希菌的最小抑菌浓度 （MIC） 均明显小于LL-37 （p0.01） 。 0056 实施例5抗菌肽LL-37突变体的稳定性 根据抑菌实验确定突变体的最低抑菌浓度， 选择浓度为1.25 g/mL的抗菌肽LL-37及其 突变体、 硫酸多粘菌素B分别作用于ATCC25922大肠埃希菌标准菌株， 分别经过6h、 12h、 24h、 48h处理后， 抗菌肽LL-37及其突变体、 硫酸多粘菌素B对ATCC25922大肠埃希菌标准菌株的 抑菌效果， 参见图21所示。 硫酸多粘菌素B是目前临床使用的多肽类抗生素， 它主要通过干 扰细菌膜通透性与核糖体功能而发挥抗菌作用， 对革兰阴性杆菌， 如大肠。

38、杆菌、 绿脓杆菌、 副大肠杆菌、 肺炎克雷白杆菌、 嗜酸杆菌、 百日咳杆菌及痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用。 0057 从图21可以看出， 抗菌肽LL-37突变体经过6h、 12h、 24h、 48h作用于ATCC25922大肠 埃希菌标准菌株均可明显抑制大肠埃希菌的增殖， 其抑菌效果明显好于硫酸多粘菌素B （P 0.05） 和抗菌肽LL-37 （p0.01） 。 浓度为1.25 g/mL的LL-37突变体经过48h作用后， 仍能较好 的抑制ATCC25922大肠埃希菌标准菌株， 由此可见， 抗菌肽LL-37突变体的稳定性好。 说明书 8/8 页 10 CN 105859867 A 10 图1 图。

39、2 说明书附图 1/12 页 11 CN 105859867 A 11 图3 说明书附图 2/12 页 12 CN 105859867 A 12 图4 说明书附图 3/12 页 13 CN 105859867 A 13 图5 图6 说明书附图 4/12 页 14 CN 105859867 A 14 图7 图8 说明书附图 5/12 页 15 CN 105859867 A 15 图9 图10 说明书附图 6/12 页 16 CN 105859867 A 16 图11 图12 说明书附图 7/12 页 17 CN 105859867 A 17 图13 图14 说明书附图 8/12 页 18 CN 105859867 A 18 图15 图16 说明书附图 9/12 页 19 CN 105859867 A 19 图17 图18 说明书附图 10/12 页 20 CN 105859867 A 20 图19 图20 说明书附图 11/12 页 21 CN 105859867 A 21 图21 说明书附图 12/12 页 22 CN 105859867 A 22 。