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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410146551.9 (22)申请日 2014.04.14 (73)专利权人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路800号 (72)发明人 杨志彪侯怡轩谢春赵玉婷 袁聪俐崔立华修国 (74)专利代理机构 上海交达专利事务所 31201 代理人 王毓理王锡麟 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 张丽华 (54)发明名称 猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检。
2、测方法及 其引物 (57)摘要 一种生物技术领域的猪流行性腹泻病毒荧 光定量PCR检测方法及其引物， 通过PCR扩增、 克 隆获得阳性重组质粒， 然后以已知浓度的目的基 因作为模板进行荧光定量PCR反应， 作出标准曲 线图以及标准曲线， 用于测算出待测样品中的病 毒含量； 通过样品检测结果与标准曲线对比， 确 定样品中试剂的目的基因拷贝数， 同时也可以作 为实验室检测PEDV增殖曲线的一种手段。 该方法 适用于病毒样品的临床检测， 检测只需在2小时 内即可完成， 大大缩短了检测时间， 能为我国 PEDV疫情的防控起到很好的应用作用。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 10。
3、3866050 B 2016.08.17 CN 103866050 B 1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒， 即PEDV的引物和探针， 其特征在于， 由如SeqID No.1所示的上游引物序列PEDV-P1、 如SeqIDNo.2所示的下游引物序列PEDV-P2及如Seq IDNo.3所示的探针PEDV-MGB组成。 2.根据权利要求1所述的引物和探针， 其特征是， 所述的检测猪流行性腹泻病毒是指： 通过PCR扩增、 克隆获得阳性重组质粒， 然后以已知浓度的目的基因作为模板进行荧光定量 PCR反应， 作出用于测算出待测样品中的病毒含量的标准曲线图以及标准曲线； 所述的PCR扩增、 克隆是指： 采。
4、用权利要求1中所述上、 下游引物进行PCR扩增目的片段， 鉴定为阳性的PCR产物， 克隆到pMD18-T载体并转化到DH5 感受态细胞， 蓝白斑筛选挑取阳 性克隆； 所述的标准曲线为： Y=-3.358LogX+37.49， 其中： Y表示Ct值， X表示病毒数量， 单位为 拷贝数/mL； 所述的模板是指： 已知病毒拷贝数的标准DNA模板， 经10倍系列稀释， 且同一稀释梯度 做重复孔对照； 每个模板浓度做3个重复， 取平均值计算变异系数； 所述的荧光定量PCR反应体系总体积为25 L， 包括： 10倍含Mg2+的EXTaqBuffer2.5 L、 dNTPMixture2.5 L、 250 。
5、M的权利要求1中所述上、 下游引物各1 L、 5U/ L的ExTaq0.2 L、 10pmol/ L的探针0.5 L、 质粒模板1 L、 DEPC水16.3 L； 所述的荧光定量PCR反应条件如下： 94预变性2min， 再以40个循环进行PCR扩增， 每循 环以94变性20s， 50延伸20s， 最后72延伸10min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103866050 B 2 猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法及其引物 技术领域 0001 本发明涉及的是一种生物基因检测技术领域的方法及检测引物， 具体是一种猪流 行性腹泻病毒N基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法及其引物。。
6、 背景技术 0002 猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)是一种对猪群具 有强感染性的病毒， 可引起猪群出现水样腹泻、 呕吐、 厌食消瘦的症状， 尤其对初生仔猪的 发病率和致死率可达90-100。 该病毒引起的猪流行性腹泻病(Porcineepidemic diarrhea,PED)1971年首次在比利时爆发， 之后在捷克、 中国、 韩国、 越南及美国等国家均有 爆发。 自2010年10月以后， 由新的流行株所引起的PED开始在我国和美国等地爆发， 给我国 和世界养猪业造成了重大经济损失。 因此建立快速、 灵敏、 成本低又操作方便的检测方法十 。
7、分必要。 0003 PEDV编码四种结构蛋白， 分别为纤突(S)蛋白、 小膜(E)蛋白、 膜内蛋白(M)和核衣 壳(N)蛋白， 其中N蛋白是长度为441个氨基酸， 可以广泛磷酸化， 是病毒核糖核蛋白的组成 部分， 含有3个相对保守的结构域， 有6-7个潜在的磷酸化位点。 N蛋白的主要功能是在病毒 RNA合成过程中发挥重要作用， 可以参与病毒基因组的转录， 它能与细胞膜和磷脂结合， 促 进病毒核心的形成以及病毒RNA的组装。 由于N蛋白高度保守， 且随着病毒复制过程表达量 较高， 在猪感染PEDV的早期， 即可以检测到针对N蛋白的抗体。 因此N蛋白所有这些特征使得 病毒得到准确和尽早诊断提供了可。
8、能， 可以利用N蛋白来建立针对PEDV分子生物学诊断技 术。 目前已经建立了许多PEDV的荧光定量PCR检测法， 但均与本方法有所不同。 0004 中国专利文献号CN103667531A公开(公告)日2014.03.26， 公开了一种猪流行性腹 泻病毒(PEDV)的ORF3保守基因序列为参考， 设计、 优化出一对特异的PCR引物， 建立一种快 速定量检测猪流行性腹泻病毒的SYBRGreenI实时荧光PCR方法。 该方法检测灵敏度比RT- PCR高100倍， 并且避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率。 因此， 该方法具有快速、 灵 敏、 特异、 重复性好和能定量检测等优点， 该方法可用于猪场。
9、PEDV快速检测。 但该技术假阳 性率较高， 敏感性较低， 精确性较差。 发明内容 0005 本发明针对现有技术存在的上述不足， 提出一种猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR 检测方法及其引物， 根据猪流行性腹泻病毒的N基因序列设计引物， 通过对荧光定量(RT- PCR)反应条件的优化， 具有较好的特异性和重复性， 比普通PCR检测方法敏感794倍的同时 可以广泛用于PEDV的快速检测。 0006 本发明可以相对定量地检测目的基因， 该方法适用于病毒样品的临床检测， 能为 我国PEDV疫情的防控起到很好的应用作用。 由于探针法荧光定量PCR方法的假阳性率低于 SYBRGreen染料法， 检测结果更加。
10、准确。 可以通过样品检测结果与标准曲线对比， 确定样品 中试剂的目的基因拷贝数， 同时也可以作为实验室检测PEDV增殖曲线的一种手段。 说明书 1/5 页 3 CN 103866050 B 3 0007 该方法能够同时适用与对PEDV流行株与经典毒株的检测。 该引物的扩增产物为 169bp的引物对， 并以此设计荧光探针寡核苷酸序列。 根据设计的引物及探针， 建立并优化 荧光定量PCR方法， 并通过构建阳性质粒， 设置标准品为109-103拷贝数加至反应体系中， 扩 增得到标准曲线， 标准曲线的线性良好， 并且所得的相关系数为0.999。 通过进一步验证， 发 现该方法特异性、 敏感性及重复性结。
11、果较好。 说明该方法在临床应用上能够有更高的准确 性。 同时， 与传统的TCID50法测定病毒增殖曲线相比， 本方法所测定的PEDV增殖曲线符合病 毒增殖规律， 可以作为一种快速的测定增殖曲线的方法。 0008 本发明是通过以下技术方案实现的： 0009 本发明涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒的引物， 包括如SeqIDNo.1所示的 上游引物序列PEDV-P1、 如SeqIDNo.2所示的下游引物序列PEDV-P2及如SeqIDNo.3所示 的探针PEDV-MGB。 0010 本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法， PCR扩增、 克隆获得阳 性重组质粒， 然后以已知浓度的目的基。
12、因作为模板进行荧光定量PCR反应， 作出标准曲线图 以及标准曲线， 用于测算出待测样品中的病毒含量。 0011 所述的PCR扩增、 克隆是指： 采用上述上、 下游引物进行PCR扩增目的片段， 鉴定为 阳性的PCR产物， 克隆到pMD18-T载体并转化到DH5 感受态细胞， 蓝白斑筛选挑取阳性克隆。 0012 所述的标准曲线是指质粒浓度与Ct值的比例曲线， 该标准曲线通过以下步骤获 得： 由质粒提取试剂盒提取重组质粒， 用紫外分光光度计测定OD260nm值， 并将质粒浓度换 算成拷贝数/ L， 对模板进行定量RT-PCR反应， 并在每一循环的延伸温度结束时采集荧光信 号进行实时检测； 最后进行熔。
13、解曲线分析PCR扩增产物的特异性。 0013 所述的模板是指： 已知病毒拷贝数的标准DNA模板， 经10倍系列稀释， 且同一稀释 梯度做重复孔对照， 优选为每个模板浓度做3个重复， 取平均值计算变异系数。 0014 所述的荧光定量PCR反应体系总体积为25 L， 包括： 10EXTaqBuffer(Mg2+plus) 2.5 L、 dNTPMixture(各2.5mM)2.5 L、 250 M的上、 下游引物各1 L、 5U/ L的ExTaq0.2 L、 10pmol/ L的探针0.5 L、 质粒模板1 L、 DEPC水16.3 L。 0015 所述的荧光定量PCR反应条件如下： 94预变性2。
14、min， 再以40个循环进行PCR扩增， 每循环以94变性20s， 50延伸20s， 最后72延伸10min。 0016 技术效果 0017 本发明检测样本病毒滴度在106-100.1TCID50之间， Ct值与质粒拷贝数的对数之间 呈现很好的线性关系， 相关系数R20.999。 以不同病毒(猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病 毒由本发明室采集保存， 猪瘟病毒疫苗株和猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗株均购自中国农 业科学院哈尔滨兽医研究所)的DNA作为模板， 同时设阴性和阳性对照， 进行荧光定量PCR检 测。 结果显示只有阳性对照出现扩增曲线， 其他均未出现扩增曲线， 表明该方法特异性强。 在同一反应体系。
15、进行批间重复， 每个样品3个重复， Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时所经历的循环数)变异系数分别为： 0.94、 0.72、 0.54， 均小于5。 表明 误差都非常小， 扩增效率稳定。 0018 与现有技术相比， 本发明的技术效果在于， 可以相对定量地检测目的基因， 由于探 针法荧光定量PCR方法的假阳性率低于SYBRGreen染料法， 检测结果更加准确。 可以通过样 品检测结果与标准曲线对比， 确定样品中试剂的目的基因拷贝数， 同时也可以作为实验室 说明书 2/5 页 4 CN 103866050 B 4 检测PEDV增殖曲线的一种手段。 该方法适用于病毒样品的临床检测，。
16、 能为我国PEDV疫情的 防控起到很好的应用作用。 本发明采用TaqMan荧光定量PCR， 相比普通PCR检测方法特异性 高， 假阳性低， 扩增与检测一步完成， 不易污染， 不需要对产物进行电泳等后期处理， 操作更 简便， 检测只需在2小时内即可完成， 大大缩短了检测时间。 附图说明 0019 图1为本发明荧光定量PCR扩增动力学曲线示意图。 0020 图2为本发明荧光定量PCR标准曲线示意图。 0021 图3为本发明普通PCR检测方法电泳图； 0022 图中M： 分子量标准DL2000； 1-7泳道从左到右依次加入模板病毒的毒价分别为 107、 106、 105、 104、 103、 102。
17、、 101TCID50。 0023 图4为本发明PEDVN基因荧光定量PCR方法特异性实验示意图。 具体实施方式 0024 下面对本发明的实施例作详细说明， 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 0025 实施例1 0026 1)设计、 合成引物和探针 0027 根据本发明室保存的PEDV毒株HLJ/2011的N基因序列， 比对GenBank中PEDV CV777、 Br1/87、 CH/S、 ZJCZ4、 CHGD1、 BJ-2012-1毒株的N基因设计特异性引物， 扩增目的片段 大小为169bp， 。
18、引物由上海生工生物工程有限公司合成。 0028 上游引物如SeqIDNo.1所示， 下游引物如SeqIDNo.2所示。 0029 2)N基因的克隆 0030 待VERO细胞长到单层约90密度时， 将培养基弃去并用PBS溶液漂洗2次， 按照 MOI:0.5的量将PEDV-HLJ/2011病毒液加入T25培养瓶中， 并补充含10 g/mL胰酶的无血清 DMEM培养基至1mL。 将培养瓶放入37培养箱中孵育2h， 在孵育过程中每隔15min轻轻晃动 培养瓶， 待孵育结束后加入4mL细胞维持液(含有10 g/mL胰酶、 2的DMEM)后继续培养约4- 5d， 每天观测细胞病变(CPE)情况， 待80的。
19、VERO细胞出现CPE后， 将培养瓶放入-80冰箱， 反复冻融3次后， 将病毒液取出， 以9000g离心5min， 取上清-80保存备用。 病毒RNA提取按 照QIAGEN试剂盒的说明书， 将250 L已离心好的病毒液上清进行总RNA提取。 0031 按照ThermoReverAidFirststrandcDNASynthesisKit试剂盒的说明书反转 录， 总cDNA样品保存至-80。 采用25 L的PCR反应体系， 反应条件为： 94预变性2min， 再以 40个循环进行PCR扩增， 每循环以94变性20s， 50延伸20s， 最后72延伸10min。 PCR扩增 完成后， 取10 L产。
20、物用1琼脂糖凝胶电泳鉴定。 鉴定为阳性的PCR产物用Omega琼脂糖核酸 凝胶回收试剂盒纯化回收， 克隆到pMD18-T载体并转化到DH5 平板， 蓝白斑筛选挑取阳性克 隆， 并进行测序鉴定。 0032 3)标准曲线的建立 0033 重组质粒由质粒提取试剂盒提取， 用紫外分光光度计定量， 标准品系列稀释为终 说明书 3/5 页 5 CN 103866050 B 5 浓度在1.53109-103拷贝数/ L。 定量RT-PCR反应体系为25 L， 包括： 10EXTaqBuffer (Mg2+plus)2.5 L、 dNTPMixture(各2.5mM)2.5 L、 250 M的上、 下游引物各。
21、1 L、 5U/ L的Ex Taq0.2 L、 10pmol/ L的探针0.5 L、 质粒模板1 L、 DEPC水16.3 L。 0034 在每一循环的延伸温度结束时采集荧光信号进行实时检测。 最后进行熔解曲线分 析PCR扩增产物的特异性。 每个模板浓度做3个重复， 取平均值计算变异系数， 实验均设阴性 对照。 0035 将计算好拷贝数的标准DNA模板以10倍系列稀释， 同一稀释梯度做重复孔对照， 进 行实时定量PCR扩增， 该方法可以检测到的最低浓度为100.1TCID50病毒滴度。 在稀释的线性 浓度范围内， 模板量与对应的Ct值相应之间线性相关， 相关系数为0.999。 Ct值分别为 2。
22、7.28， 24.32， 20.63， 17.16， 14.08， 10.76， 7.15， 标准曲线的斜率为-3.358， 截距为37.49， 直线方程为Y-3.358LogX+37.49。 0036 3)敏感性试验 0037 普通PCR最低能检测到103TCID50病毒滴度(图3)， 而荧光定量方法能检测的最低模 板量为100.1TCID50病毒滴度， 比普通PCR检测方法敏感794倍。 0038 4)特异性试验 0039 利用本发明建立的实时定量PCR检测方法， 分别检测了PEDV、 PRRSV疫苗株、 TGEV疫 苗株、 CFSV疫苗株， PoRV疫苗株。 结果显示只有猪流行性腹泻病毒。
23、(PEDV)毒株呈阳性反应， 其它病毒均呈阴性(图4)。 0040 5)稳定性试验 0041 取拷贝数为107,106,105的模板分别做3次重复试验， 无论是批内还是批间Ct值变 异系数均小于5， 说明该方法具有较好的重复性(见下表)。 0042 荧光定量PCR方法重复性实验结果 0043 0044 实施例2 0045 1)临床粪便样品的采集， 临床粪便样品加2倍体积的PBS， 冻融3次， 取上清作为提 取备用液-80保存备用。 病毒RNA提取按照QIAGEN试剂盒使用说明操作。 0046 2)PCR体系为： 10EXTaqBuffer(Mg2+plus)2.5 L、 dNTPMixture。
24、(各2.5mM)2.5 L、 250 M的上、 下游引物各1 L、 5U/ L的ExTaq0.2 L、 10pmol/ L的探针0.5 L、 DNA模板1 L、 DEPC水16.3 L。 0047 3)反应条件： 94预变性2min， 再以40个循环进行PCR扩增， 每循环以94变性 20s， 50延伸20s， 最后72延伸10min。 说明书 4/5 页 6 CN 103866050 B 6 0048 4)根据荧光定量PCR结果和标准曲线计算样品中病毒的含量。 0049 5)荧光定量PCR结果， 荧光定量PCR仪会自动显示样品的浓度。 说明书 5/5 页 7 CN 103866050 B 7 0001 序列表 1/2 页 8 CN 103866050 B 8 0002 序列表 2/2 页 9 CN 103866050 B 9 图1 图2 说明书附图 1/2 页 10 CN 103866050 B 10 图3 图4 说明书附图 2/2 页 11 CN 103866050 B 11 。