技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种有效促进仔猪生长发育、提高其生长速度促进仔猪生长的生物活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
仔猪的生长发育是关系到生猪生产的一个关键环节，由于仔猪独特的消化生理结构，其消化器官不健全，消化腺的生理机能不完善，缺乏先天性免疫力，体温调节机能不健全，对寒冷应激的抵抗力差，仔猪在一般饲养条件下，多种疾病的发病率高，存活率低。提高仔猪对饲料中营养物质的吸收利用率，促进仔猪的生长发育，降低发病率，提高仔猪存活率，是猪场普遍关注的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种具有安全、环保、无残留，能提高仔猪的生长速度，降低仔猪的死亡率的优点的促进仔猪生长的生物活性肽及其制备方法和应用。
本发明第一方面提供了一种促进仔猪生长的生物活性肽，所述生物活性肽包含SEQ ID No.1所示氨基酸序列。
本发明第二方面提供了上述促进仔猪生长的生物活性肽在促进仔猪生长、降低仔猪死亡率中的应用。
本发明第三方面提供了上述促进仔猪生长的生物活性肽的制备方法，包括如下步骤：
A、分别筛选乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母后培养；
B、将步骤A所得乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、 产朊假丝酵母混合培养发酵，提取发酵液上清液后浓缩、干燥，分离提纯后得生物活性肽。
本发明的有益效果是：本发明提供的促进仔猪生长发育的生物活性肽，应用于生长阶段的仔猪，通过促进机体合成代谢和脂肪分解，促使蛋白质合成，达到促进仔猪的生长，提高其生长速度的目的。生物活性肽，不是生物激素，而是一种能够模拟激素生物活性的多肽，通过调节内分泌系统的激素水平，发挥促进仔猪生长发育的作用，克服了激素残留的问题，达到健康绿色养殖的目的。实际应用的结果证明，本发明提供的促进仔猪生长发育的生物活性肽可使仔猪平均日增重提高6.38％(P＜0.05)，仔猪断奶之后，采食量增加4.16％(P＜0.05)，死亡率较未使用生物活性肽的死亡率降低50％(P＜0.05)，效果明显。
具体实施方式
本发明第一方面提供了一种促进仔猪生长的生物活性肽，所述生物活性肽包含SEQ ID No.1所示氨基酸序列。
该种生物活性肽是具有十三个氨基酸残基的多肽，其氨基酸序列为Arg-Pro-Cys-Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Leu-Ser-Thr-Ser-Val，含有精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等多种必需氨基酸和限制性氨基酸，形成一定的分子空间结构。仔猪消化道的生理机能发育不完全，分泌的蛋白酶的数量和种类少，难以降解该种生物活性肽。该种生物活性肽在仔猪胃肠道内，通过仔猪发育不完全的肠道细胞进入到仔猪的循环系统，发挥类似激素样作用，促进合成代谢能力，加快N沉积，增强蛋白质的合成，发挥促进仔猪生长发育的作用，达到健康绿色养殖的目的。
多肽类作为蛋白水解的产物，有着许多蛋白质不具备的生物活性和物理性质。豆粕、鱼粉等蛋白原料富含多种蛋白质，通过多种产蛋白酶的益生菌利用蛋白原料，进行同步复合培养，发酵降解产生能促进仔猪生长的生物活性肽。这种生物活性肽，安全、高效、环保、无残留，能提高仔猪的生长速度，降低仔猪的死亡率，可成为激素类促生长药物的安全有效替代物。
本发明第二方面提供了上述促进仔猪生长的生物活性肽在促进仔猪生长、降 低仔猪死亡率中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述应用为将生物活性肽冻干粉用人工胃液稀释后对仔猪进行灌服。该生物活性肽的应用方式包括但不限于这一种，还可以通过配制在仔猪饲料中等多种方式进行应用。
本发明第三方面提供了上述促进仔猪生长的生物活性肽的制备方法，包括如下步骤：
A、分别筛选乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母后培养；
B、将步骤A所得乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母混合培养发酵，提取发酵液上清液后浓缩、干燥，分离提纯后得生物活性肽。
所述的促进仔猪生长发育的生物活性肽是在多种产酶益生菌的协同作用下产生的。通过人工诱变提高益生菌产酶特性、产酶量及酶活，将乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母按照相应的不同配比进行同步复合培养，不同的益生菌菌种在同一培养条件下表达分泌酶类，降解培养基中的蛋白质类、多糖类等大分子物质，为芽孢杆菌类菌种的代谢活动提供氨基酸、维生素、寡糖、有机酸等多种营养物质，从而促进其代谢形成相应的生物活性肽。将该种生物活性肽应用于生长阶段的仔猪，可通过仔猪尚未发育成熟的胃肠道粘膜屏障直接进入到仔猪血液循环，发挥类似激素生物活性作用，增强动物机体合成代谢，加快氨基酸、维生素等多种营养物质的吸收，促使蛋白质合成，促进仔猪的生长发育，提高其生长速度，达到健康绿色养殖的目的。
根据本发明实施例提供的促进仔猪生长的生物活性肽的制备方法，该方法还可以具有如下附加的技术特征：
优选的，步骤A所述筛选包括如下步骤：
a、初筛：将乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊 假丝酵母分别加入至酪蛋白分离筛选培养基的无菌平板上，紫外诱变培养后选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种培养；
b、复筛：将经过步骤a得到的各优势菌株进行微波诱变后，采用酪蛋白分离筛选培养基，30-34℃下恒温培养2-3天，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种培养；
c、再复筛：将经过步骤b得到的各优势菌株分别与180-220μg/mL亚硝基胍溶液等体积混合后30-35℃下培养20-30min，终止反应后洗涤、配制为菌悬液，将菌悬液涂布于酪蛋白分离筛选培养基平板，35-39℃下培养34-38小时，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落。
更加优选的，上述步骤b所述的微波诱变步骤包括：850W最大功率、额定微波频率2450MHz的微波炉里，微波辐照45-55s，且每隔5-10s冰浴处理，微波辐照结束后避光冷藏10-14小时。
根据本发明的一个实施例，步骤A所述培养步骤包括：将筛选后的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母于牛肉膏蛋白胨培养基培养30-40小时，再转接至营养琼脂培养基中，于35-39℃下培养45-50小时。
优选的，步骤B所述混合培养发酵步骤包括：以质量百分比计，按乳酸肠球菌20-23％、地衣芽孢杆菌22-25％、凝结芽孢杆菌26-30％、短小芽孢杆菌10-14％、产朊假丝酵母14-17％的比例接种于同一装有液体培养基的发酵罐中发酵培养。
更加优选的，步骤B所述乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母分别按8％-12％的接种量接种于种子液培养基中，培养驯化10-14小时后进行混合培养发酵。
更加优选的，所述发酵培养的条件为pH7.2-7.4，搅拌转速180-220rpm，温度为35-39℃，通气量1:0.5-1:0.7，发酵时间22-24小时。
优选的，步骤B所述分离提纯步骤包括：将浓缩、干燥后的产品配置为溶液，依次经10KDa、5KDa、3KDa、1KDa的超滤膜逐级分离，收集得到生物活性肽超滤片段，再进行交联葡聚糖凝胶色谱纯化，洗脱流速0.8-1.2mL/h，检测波长为220nm，收集组分后冷冻干燥。
下面将结合具体实施例对本发明提供的促进仔猪生长的生物活性肽及其制备方法和应用予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1
本实施例所采用的所有菌种都是可在饲料中添加的微生物菌种，且乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母均是由农业微生物学国家重点实验室提供，市场上购得的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母也能达到非常近似的效果。
一、本实施例的促进仔猪生长的生物活性肽的制备方法包括如下步骤：
第一步：培育菌种，利用诱变育种技术对各菌种进行优选。
在功率为20W的紫外灯、30cm照射距离下，将保存的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母的菌悬液2mL分别酪蛋白分离筛选培养基的无菌平板上，照射2-3分钟培养计数，观察在酪蛋白分离筛选培养基上的透明圈，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种至试管斜面上培养。选取经紫外诱变后优势较好的菌株，制成106-108/mL的菌悬液，在850W最大功率、额定微波频率2450MHz的微波炉里，微波辐照55s，且每隔10s冰浴处理消除热效应，避光4℃冷藏14小时，涂布于酪蛋白分离筛选培养基，35℃恒温培养2天后，观察在酪蛋白分离筛选培养基上的透明圈，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种至试管斜面上培养。选取经微波诱变后优势较好的菌株，用无菌水制成106-108/mL的菌悬液，将其与200μg/mL亚硝基胍溶液等体积置于洁净的锥形瓶内混匀，35℃下处理20min后用冷生理盐水稀释到50倍终止反应，离心洗涤3次去除药物，再稀释成106-108 倍菌悬液，取0.2mL菌悬液均匀涂布于酪蛋白分离筛选培养基平板上，将平板倒置于39℃恒温培养箱中培养34小时，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种至试管斜面上作为生产制菌。
所述亚硝基胍溶液的配制：精确称取0.020g亚硝基胍，置于100mL的容量瓶中，加入适量的丙酮溶液助溶，加入pH7.2的磷酸盐缓冲液定容，制得200μg/mL亚硝基胍溶液，4℃保存备用。
所述酪蛋白分离筛选培养基：干酪素0.4-0.6％、牛肉膏0.2-0.4％g、蛋白胨0.5-1.5％、氯化钠0.5-1.5％、琼脂1.0-2.0％、pH7.0-7.2、蒸馏水1000mL，121℃灭菌18-22min。
第二步：生产制菌
将筛选出来的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养40小时，再转接至装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，于37℃下培养48小时，放入4℃冰箱保存。
所述牛肉膏蛋白胨培养基：葡萄糖5.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g，无菌水1000mL、pH7.0-7.2，121℃灭菌20-25min。
所述营养琼脂培养基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂20.0g，无菌水1000mL、pH7.0-7.2，121℃灭菌20-25min。
第三步：复合菌的同步培养
将保存的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母，按12％的接种量分别接种于种子液培养基中，驯化培养14小时。
按以下重量百分比称取各菌种：乳酸肠球菌20％、地衣芽孢杆菌25％、凝结芽孢杆菌30％、短小芽孢杆菌10％、产朊假丝酵母15％。
将培养的所有菌种按重量百分比接种于同一装有液体培养基的发酵罐中培养，pH7.2-7.4，搅拌转速180-220rpm，培养温度为35-39℃，通气量1:0.5-1:0.7，发酵时间为24小时。
所述种子液培养基：葡萄糖1-3％、酵母膏0.5-1.0％、蛋白胨0.5-1.5％、牛肉膏0.5-1.0％、硫酸镁0.05-0.1％、磷酸二氢钾0.05-0.15％、无菌水94-96％、pH7.0-7.2，121℃灭菌20-25min。
所述发酵液培养基：豆粕10-15％、鱼粉8-12％、麦麸4-10％、玉米浆6-10％、 葡萄糖1-3％、氯化钠0.5-1.5％、酵母膏0.5-1.0％、硫酸镁0.05-0.1％、磷酸二氢钾0.5-1.0％，硫酸铵0.5-1.5％、硫酸锰0.005-0.01％、硫酸亚铁0.01-0.03％，无菌水62-65％，pH7.2-7.4，121℃灭菌20-25min。
第四步：生物活性肽的分离
在复合菌的最佳发酵条件下完成对复合蛋白原料的发酵后，将发酵液在4500-5500rpm转速条件下离心25-35min，取上清液进行真空浓缩，冷冻干燥制得生物活性肽的粗品。
将生物活性肽的粗品溶解于去离子水中，配置成溶液，用截留分子量为10KDa的超滤膜对生物活性肽的粗品溶液进行分离，收集所得到透过液，再经截留分子量为5KDa的超滤膜进一步分离，随后按照同样的方法分别采用3KDa、1KDa的超滤膜逐级分离，将最后收集得到生物活性肽超滤片段，经真空浓缩后，冷冻干燥成冻干粉备用。再将生物活性肽超滤片段冻干粉溶解于去离子水中配置成质量体积浓度为50mg/mL的溶液，混合均匀后上样2mL进行交联葡聚糖凝胶色谱纯化，洗脱流速为0.8-1.2mL/h，检测波长为220nm，利用自动收集器进行分离组分的收集，重复多次上样，不断富集各组分并冷冻干燥得到生物活性肽的纯品，保存备用。对分离提纯的多肽进行氨基酸测序，其氨基酸序列为Arg-Pro-Cys-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Leu-Ser-Thr-Ser-Val，如序列表SEQ ID No.1所示。
二、将制备得到的生物活性肽应用于仔猪，评价生物活性肽促仔猪生长的效果，具体方法包括：
人工胃液的制备：量取234mL浓盐酸加入无菌水稀释至1000mL，制得10％稀盐酸。取该稀盐酸16.4mL，加入无菌水800mL和胃蛋白酶10g，搅拌均匀，加入无菌水稀释至1000mL即得。
供试品溶液的制备：精确称取生物活性肽冻干粉成品0.04g，用100.0g人工胃液溶解稀释制成供试品溶液，4℃保存备用。
选取10-15日龄的仔猪100头，随机分为A、B两组，每组50头。对每头仔猪用编号的耳部标号分别加以识别。A组作为对照组，每天灌服2mL的供试品溶液，连续灌喂20天；B组作为对照组，自由饮水、采食，与A组的区别仅在于未灌服供试品溶液。每天观察仔猪的生长状态，对仔猪进行称重，并作好记 录。为期20天的试验，试验组的仔猪平均日增重提高6.38％(P＜0.05)，仔猪断奶之后，采食量增加4.16％(P＜0.05)，死亡率较对照组降低50％(P＜0.05)。
实施例2
本实施例所采用的所有菌种都是可在饲料中添加的微生物菌种，且乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母均是于市场上购得，不同厂家的菌种均能达到近似的效果。
一、本实施例的促进仔猪生长的生物活性肽的制备方法包括如下步骤：
第一步：培育菌种，利用诱变育种技术对各菌种进行优选。
在功率为20W的紫外灯、30cm照射距离下，将保存的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母的菌悬液2mL分别酪蛋白分离筛选培养基的无菌平板上，照射2-3分钟培养计数，观察在酪蛋白分离筛选培养基上的透明圈，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种至试管斜面上培养。选取经紫外诱变后优势较好的菌株，制成106-108/mL的菌悬液，在850W最大功率、额定微波频率2450MHz的微波炉里，微波辐照45s，且每隔5s冰浴处理消除热效应，避光4℃冷藏10小时，涂布于酪蛋白分离筛选培养基，30℃恒温培养3天后，观察在酪蛋白分离筛选培养基上的透明圈，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种至试管斜面上培养。选取经微波诱变后优势较好的菌株，用无菌水制成106-108/mL的菌悬液，将其与220μg/mL亚硝基胍溶液等体积置于洁净的锥形瓶内混匀，30℃下处理30min后用冷生理盐水稀释到50倍终止反应，离心洗涤3次去除药物，再稀释成106-108倍菌悬液，取0.2mL菌悬液均匀涂布于酪蛋白分离筛选培养基平板上，将平板倒置于35℃恒温培养箱中培养38小时，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种至试管斜面上作为生产制菌。
所述亚硝基胍溶液的配制：精确称取0.020g亚硝基胍，置于100mL的容量瓶中，加入适量的丙酮溶液助溶，加入pH7.2的磷酸盐缓冲液定容，制得200μg/mL亚硝基胍溶液，4℃保存备用。
所述酪蛋白分离筛选培养基：干酪素0.4-0.6％、牛肉膏0.2-0.4％g、蛋白胨0.5-1.5％、氯化钠0.5-1.5％、琼脂1.0-2.0％、pH7.0-7.2、蒸馏水1000mL，121℃灭菌18-22min。
第二步：生产制菌
将筛选出来的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养30小时，再转接至装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，于35℃下培养50小时，放入4℃冰箱保存。
所述牛肉膏蛋白胨培养基：葡萄糖5.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g，无菌水1000mL、pH7.0-7.2，121℃灭菌20-25min。
所述营养琼脂培养基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂20.0g，无菌水1000mL、pH7.0-7.2，121℃灭菌20-25min。
第三步：复合菌的同步培养
将保存的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母，按8％的接种量分别接种于种子液培养基中，驯化培养10小时。
按以下重量百分比称取各菌种：乳酸肠球菌22％、地衣芽孢杆菌22％、凝结芽孢杆菌26％、短小芽孢杆菌13％、产朊假丝酵母17％。
将培养的所有菌种按重量百分比接种于同一装有液体培养基的发酵罐中培养，pH7.2-7.4，搅拌转速180-220rpm，培养温度为35-39℃，通气量1:0.5-1:0.7，发酵时间为22小时。
所述种子液培养基：葡萄糖1-3％、酵母膏0.5-1.0％、蛋白胨0.5-1.5％、牛肉膏0.5-1.0％、硫酸镁0.05-0.1％、磷酸二氢钾0.05-0.15％、无菌水94-96％、pH7.0-7.2，121℃灭菌20-25min。
所述发酵液培养基：豆粕10-15％、鱼粉8-12％、麦麸4-10％、玉米浆6-10％、葡萄糖1-3％、氯化钠0.5-1.5％、酵母膏0.5-1.0％、硫酸镁0.05-0.1％、磷酸二氢钾0.5-1.0％，硫酸铵0.5-1.5％、硫酸锰0.005-0.01％、硫酸亚铁0.01-0.03％，无菌水62-65％，pH7.2-7.4，121℃灭菌20-25min。
第四步：生物活性肽的分离
在复合菌的最佳发酵条件下完成对复合蛋白原料的发酵后，将发酵液在4500-5500rpm转速条件下离心25-35min，取上清液进行真空浓缩，冷冻干燥制得生物活性肽的粗品。
将生物活性肽的粗品溶解于去离子水中，配置成溶液，用截留分子量为10KDa的超滤膜对生物活性肽的粗品溶液进行分离，收集所得到透过液，再经 截留分子量为5KDa的超滤膜进一步分离，随后按照同样的方法分别采用3KDa、1KDa的超滤膜逐级分离，将最后收集得到生物活性肽超滤片段，经真空浓缩后，冷冻干燥成冻干粉备用。再将生物活性肽超滤片段冻干粉溶解于去离子水中配置成质量体积浓度为50mg/mL的溶液，混合均匀后上样2mL进行交联葡聚糖凝胶色谱纯化，洗脱流速为0.8-1.2mL/h，检测波长为220nm，利用自动收集器进行分离组分的收集，重复多次上样，不断富集各组分并冷冻干燥得到生物活性肽的纯品，保存备用。对分离提纯的多肽进行氨基酸测序，其氨基酸序列为Arg-Pro-Cys-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Leu-Ser-Thr-Ser-Val，如序列表SEQ ID No.1所示。
二、将制备得到的生物活性肽应用于仔猪，评价生物活性肽促仔猪生长的效果，具体方法包括：
人工胃液的制备：量取234mL浓盐酸加入无菌水稀释至1000mL，制得10％稀盐酸。取该稀盐酸16.4mL，加入无菌水800mL和胃蛋白酶10g，搅拌均匀，加入无菌水稀释至1000mL即得。
供试品溶液的制备：精确称取生物活性肽冻干粉成品0.05g，用100.0g人工胃液溶解稀释制成供试品溶液，4℃保存备用。
选取10-15日龄的仔猪100头，随机分为A、B两组，每组50头。对每头仔猪用编号的耳部标号分别加以识别。A组作为对照组，每天灌服2mL的供试品溶液，连续灌喂20天；B组作为对照组，自由饮水、采食，与A组的区别仅在于未灌服供试品溶液。每天观察仔猪的生长状态，对仔猪进行称重，并作好记录。为期20天的试验，试验组的仔猪平均日增重提高6.50％(P＜0.05)，仔猪断奶之后，采食量增加4.31％(P＜0.05)，死亡率较对照组降低50％(P＜0.05)。
实施例3
本实施例所采用的所有菌种都是可在饲料中添加的微生物菌种，且乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母均是于市场上购得，不同厂家的菌种均能达到近似的效果。
一、本实施例的促进仔猪生长的生物活性肽的制备方法包括如下步骤：
第一步：培育菌种，利用诱变育种技术对各菌种进行优选。
在功率为20W的紫外灯、30cm照射距离下，将保存的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母的菌悬液2mL分别酪蛋白分离筛选培养基的无菌平板上，照射2-3分钟培养计数，观察在酪蛋白分离筛选培养基上的透明圈，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种至试管斜面上培养。选取经紫外诱变后优势较好的菌株，制成106-108/mL的菌悬液，在850W最大功率、额定微波频率2450MHz的微波炉里，微波辐照45s，且每隔5s冰浴处理消除热效应，避光4℃冷藏10小时，涂布于酪蛋白分离筛选培养基，32℃恒温培养3天后，观察在酪蛋白分离筛选培养基上的透明圈，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种至试管斜面上培养。选取经微波诱变后优势较好的菌株，用无菌水制成106-108/mL的菌悬液，将其与200μg/mL亚硝基胍溶液等体积置于洁净的锥形瓶内混匀，33℃下处理25min后用冷生理盐水稀释到50倍终止反应，离心洗涤3次去除药物，再稀释成106-108倍菌悬液，取0.2mL菌悬液均匀涂布于酪蛋白分离筛选培养基平板上，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养36小时，选取透明圈直径和菌落直径比(HC)大于1.5的菌落移种至试管斜面上作为生产制菌。
所述亚硝基胍溶液的配制：精确称取0.020g亚硝基胍，置于100mL的容量瓶中，加入适量的丙酮溶液助溶，加入pH7.2的磷酸盐缓冲液定容，制得200μg/mL亚硝基胍溶液，4℃保存备用。
所述酪蛋白分离筛选培养基：干酪素0.4-0.6％、牛肉膏0.2-0.4％g、蛋白胨0.5-1.5％、氯化钠0.5-1.5％、琼脂1.0-2.0％、pH7.0-7.2、蒸馏水1000mL，121℃灭菌18-22min。
第二步：生产制菌
将筛选出来的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养35小时，再转接至装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，于37℃下培养47小时，放入4℃冰箱保存。
所述牛肉膏蛋白胨培养基：葡萄糖5.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g，无菌水1000mL、pH7.0-7.2，121℃灭菌20-25min。
所述营养琼脂培养基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂20.0g，无菌水1000mL、pH7.0-7.2，121℃灭菌20-25min。
第三步：复合菌的同步培养
将保存的乳酸肠球菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母，按10％的接种量分别接种于种子液培养基中，驯化培养12小时。
按以下重量百分比称取各菌种：乳酸肠球菌23％、地衣芽孢杆菌23％、凝结芽孢杆菌28％、短小芽孢杆菌11％、产朊假丝酵母15％。
将培养的所有菌种按重量百分比接种于同一装有液体培养基的发酵罐中培养，pH7.2-7.4，搅拌转速180-220rpm，培养温度为35-39℃，通气量1:0.5-1:0.7，发酵时间为23小时。
所述种子液培养基：葡萄糖1-3％、酵母膏0.5-1.0％、蛋白胨0.5-1.5％、牛肉膏0.5-1.0％、硫酸镁0.05-0.1％、磷酸二氢钾0.05-0.15％、无菌水94-96％、pH7.0-7.2，121℃灭菌20-25min。
所述发酵液培养基：豆粕10-15％、鱼粉8-12％、麦麸4-10％、玉米浆6-10％、葡萄糖1-3％、氯化钠0.5-1.5％、酵母膏0.5-1.0％、硫酸镁0.05-0.1％、磷酸二氢钾0.5-1.0％，硫酸铵0.5-1.5％、硫酸锰0.005-0.01％、硫酸亚铁0.01-0.03％，无菌水62-65％，pH7.2-7.4，121℃灭菌20-25min。
第四步：生物活性肽的分离
在复合菌的最佳发酵条件下完成对复合蛋白原料的发酵后，将发酵液在4500-5500rpm转速条件下离心25-35min，取上清液进行真空浓缩，冷冻干燥制得生物活性肽的粗品。
将生物活性肽的粗品溶解于去离子水中，配置成溶液，用截留分子量为10KDa的超滤膜对生物活性肽的粗品溶液进行分离，收集所得到透过液，再经截留分子量为5KDa的超滤膜进一步分离，随后按照同样的方法分别采用3KDa、1KDa的超滤膜逐级分离，将最后收集得到生物活性肽超滤片段，经真空浓缩后，冷冻干燥成冻干粉备用。再将生物活性肽超滤片段冻干粉溶解于去离子水中配置成质量体积浓度为50mg/mL的溶液，混合均匀后上样2mL进行交联葡聚糖凝胶色谱纯化，洗脱流速为0.8-1.2mL/h，检测波长为220nm，利用自动收集器进行分离组分的收集，重复多次上样，不断富集各组分并冷冻干燥得到生物活性肽的纯品，保存备用。对分离提纯的多肽进行氨基酸测序，其氨基酸序列为Arg-Pro-Cys-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Leu-Ser-Thr-Ser-Val，如序列表SEQ ID No.1所 示。
二、将制备得到的生物活性肽应用于仔猪，评价生物活性肽促仔猪生长的效果，具体方法包括：
人工胃液的制备：量取234mL浓盐酸加入无菌水稀释至1000mL，制得10％稀盐酸。取该稀盐酸16.4mL，加入无菌水800mL和胃蛋白酶10g，搅拌均匀，加入无菌水稀释至1000mL即得。
供试品溶液的制备：精确称取生物活性肽冻干粉成品0.04g，用100.0g人工胃液溶解稀释制成供试品溶液，4℃保存备用。
选取10-15日龄的仔猪100头，随机分为A、B两组，每组50头。对每头仔猪用编号的耳部标号分别加以识别。A组作为对照组，每天灌服2mL的供试品溶液，连续灌喂20天；B组作为对照组，自由饮水、采食，与A组的区别仅在于未灌服供试品溶液。每天观察仔猪的生长状态，对仔猪进行称重，并作好记录。为期20天的试验，试验组的仔猪平均日增重提高6.2％(P＜0.05)，仔猪断奶之后，采食量增加4.2％(P＜0.05)，死亡率较对照组降低50％(P＜0.05)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。