一种连续发酵或半连续发酵获取脂肪酶的方法.pdf

本发明涉及一种连续发酵或半连续发酵获取脂肪酶的方法。采用本方法，可以通过连续发酵或半连续获得含有脂肪酶的发酵液。本发明所用方法节约了洗罐、灭菌等辅助操作时间，具有生产强度高、易自动化的优点。

1、  一种连续发酵或半连续发酵获取脂肪酶的方法。

2、  如权利要求1所述的应用，菌种为沙雷氏杆菌Serratia marcescens ECU1010(保藏号CGMCC No.1219)。

3、  如权利要求1所述的应用，采用连续发酵方式或半连续发酵方式培养沙雷氏杆菌获取脂肪酶，设备可分为种子罐、发酵罐。

4、  如权利要求1所述的应用，整个过程可分为种子培养和发酵产酶。
(1)斜面种子培养。斜面培养基(g/L)：蔗糖5-20，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，食盐5-10，pH7.5。将菌种转接于斜面上，20-40℃培养20-48h。
(2)摇瓶种子培养。摇瓶培养基(g/L)：糊精5-20，吐温-80 0-15，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，KH₂PO4 2-5，(NH₄)₂SO₄ 2-5，食盐5-10，MgSO₄ 0-2，FeSO₄·7H₂O 0-0.1，CaCl₂ 0-0.5。以氢氧化钠调pH7.5。500ml三角瓶装液量50-150ml，接1环菌种至三角瓶中，20-40℃培养12-24h。
(3)种子罐培养。发酵罐所用培养基同摇瓶培养基。接种量1-10％，25-35℃，0.5-2.0vvm，培养8-24h。当发酵液浊度OD₆₀₀达到0.650时，按停留时间1-3h，边进料，边排出成熟的种子液进入发酵罐。所用培养基同摇瓶培养基。
(4)发酵罐产酶。当种子液进入发酵罐后，开始流加10-30g/L浓度的吐温-80，使发酵液中吐温浓度达到1-15g/L，诱导微生物产脂肪酶。

5、  如权利要求4所述的应用，可以采用1-6个发酵罐串联进行连续发酵，也可以采用1-6个发酵罐并联进行半连续发酵。

6、  如权利要求5所述的应用，采用连续发酵方式时，种子罐流加发酵培养基，第一个发酵罐流加吐温-80。采用罐顶进料、罐底出料的方式进行培养，发酵罐装料系数始终维持在60-80％。发酵液依次流过每个发酵罐直至出料。种子罐压力维持在0.1MPa，第一个发酵罐压力维持在0.07-0.08MPa，之后每个发酵罐压力递降0.01MPa。出料时，脂肪酶活5000-12000U/L。
连续发酵时，种子罐、发酵罐时刻有料液。发酵液仅从最后一个发酵罐流出。发酵过程中，发酵罐仅在第一次使用前空消灭菌；连续发酵过程，发酵罐不再空消灭菌。

7、  如权利要求5所述的应用，采用半连续发酵方式时，发酵罐之间并联，没有连接。种子罐流加发酵培养基，第一个发酵罐流加吐温-80。当第一个发酵罐装液量达到60-80％时，切换管道，将种子液转向第二个发酵罐，第一个发酵罐自然发酵结束。如此不断循环。种子罐压力维持在0.1MPa，所有并联发酵罐压力均维持在0.07-0.08MPa。出料时，脂肪酶活5000-12000U/L。
半连续发酵时，发酵液可以从任一发酵罐流出。过程中维持正压操作，发酵罐在第一次使用前需要空消灭菌，之后可不再灭菌。

一种连续发酵或半连续发酵获取脂肪酶的方法
技术领域
本发明涉及一种利用连续发酵获半连续发酵获取脂肪酶的方法。
技术背景
地尔硫卓是一种钙离子通道阻滞剂，被广泛应用于心绞痛和高血压的长期治疗。采用脂肪酶拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，不需要的(+)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯被脂肪酶选择性地水解，(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯被保留下来，可用于合成(+)-地尔硫卓。
脂肪酶是生产(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的关键。利用沙雷氏杆菌Serratiamarcescens ECU1010(保藏号CGMCC No.1219)所产脂肪酶进行手性拆分，产品光学纯度能达到99％ee以上。
文献J.Ind.Microbiol Biotechnol 2004，31：525-530报道了通过分批发酵获取脂肪酶的方法。通过培养基、溶氧、诱导剂优化，5L发酵罐分批发酵，脂肪酶酶活达到11060U/L。
发明目的
本发明的目的在于，通过连续发酵、半连续发酵方式获得脂肪酶，缩短辅助操作时间、提高生产强度。
本发明通过下列方案实现：
(1)用沙雷氏杆菌Serratia marcescens ECU1010(保藏号CGMCC No.1219)作为发酵产脂肪酶菌种。
(2)发酵过程由种子培养、发酵产酶两部分组成，需要种子罐和发酵罐。
(3)进种子罐前，经过斜面种子培养和摇瓶种子培养。
斜面培养基(g/L)：蔗糖5-20，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，食盐5-10，pH7.5。将菌种转接于斜面上，20-40℃培养20-48h。
摇瓶培养基(g/L)：糊精5-20，吐温-80 0-15，蛋白胨5-20，牛肉膏5-20，KH₂PO₄2-5，(NH₄)₂SO₄2-5，食盐5-10，MgSO₄0-2，FeSO₄·7H₂O 0-0.1，CaCl₂0-0.5。氢氧化钠调pH7.5。500ml三角瓶装液量50-150ml，接1环菌至三角瓶中，20～40℃培养8-24h。
种子罐培养基同摇瓶培养基。接种量1-10％，25～35℃，0.5～2vvm，培养12-24hr。当发酵液浊度OD₆₀₀达到0.650时，按停留时间1～3h，边进料，边排出成熟的种子进入发酵罐。所用培养基同摇瓶培养基。
种子液进入发酵罐后，流加10-30g/L浓度的吐温-80。此时即进入发酵产酶阶段。发酵液中吐温浓度1-15g/L，诱导微生物产脂肪酶。
(4)采用连续发酵方式时，种子罐流加发酵培养基，第一个发酵罐流加吐温-80。采用罐顶进料、罐底出料的方式进行培养，发酵罐装料系数始终维持在60-80％。发酵液依次流过每个发酵罐直至出料。种子罐压力维持在0.1MPa，第一个发酵罐压力维持在0.07-0.08MPa，之后每个发酵罐压力降低0.01MPa。出料时，脂肪酶活5000-12000U/L。生产强度500-1200U/L·h。
连续发酵时，种子罐、发酵罐时刻有料液。发酵液仅从最后一个发酵罐流出。发酵过程中，发酵罐仅在第一次使用前空消灭菌；连续发酵过程，发酵罐不再空消灭菌。
(5)半连续培养获取脂肪酶时，发酵罐并联。种子液进入一个发酵罐后，连续流加诱导剂吐温-80、诱导微生物产生脂肪酶。发酵罐液位达到60～80％时，将种子液引入另一个发酵罐，连续流加诱导剂。如此不断循环。种子罐压力维持在0.1MPa，所有并联发酵罐压力均维持在0.07～0.08MPa。出料时，脂肪酶活5000-12000U/L。生产强度800-2000U/L·h。
半连续发酵时，发酵液可以从任一发酵罐流出。过程中维持正压操作，发酵罐在第一次使用前需要空消灭菌，之后可不再灭菌。
具体实施方式
实施例1：
用沙雷氏杆菌Serratia marcescens ECU1010(保藏号CGMCC No.1219)作为发酵产脂肪酶菌种。
斜面培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，食盐5，pH7.5。将菌种转接于斜面上，30℃培养48hr。
摇瓶培养基(g/L)：糊精5，吐温-80 10，蛋白胨10，牛肉膏10，KH₂PO₄2，(NH₄)₂SO₄2，食盐5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，CaCl₂ 0.1。氢氧化钠调pH7.5。500ml三角瓶装液量50ml，接1环菌至三角瓶中，30℃培养12hr。
种子罐培养基(g/L)：糊精5，吐温-80 10，蛋白胨10，牛肉膏10，KH₂PO₄2，(NH₄)₂SO₄2，食盐5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，CaCl₂ 0.1。氢氧化钠调pH7.5。接种量5％，30℃，1vvm，250r/min，培养8hr。当发酵液浊度OD₆₀₀达到0.650时，连续流加培养基。培养基组成(g/L)：糊精5，吐温-80 10，蛋白胨10，牛肉膏10，KH₂PO₄2，(NH₄)₂SO₄2，食盐5，MgSO₄0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，CaCl₂0.1。氢氧化钠调pH至7.5。
使用1个5L种子罐进行种子培养，液位控制在80％。培养基进料速度为2L/h，种子出料速度为2L/h。停留时间控制在2h。流加时，温度30℃，通气量1vvm，搅拌转速250r/min，罐压0.1MPa。流出的种子液直接进入发酵罐。
使用3个5L发酵罐进行连续发酵产酶。发酵罐底和下一个发酵罐顶通过管道相连通，每个发酵罐液位控制在80％。种子罐流出的种子液进入第一个发酵罐的同时，连续补入30g/L吐温-80，使发酵液中吐温-80含量达到2g/L。第一个发酵罐温度30℃，通气量1vvm，搅拌转速250r/min，罐压0.08MPa。
当第一个发酵罐液位达到80％，将正在培养的发酵液通过管道转入第二个发酵罐，流速2.1L/h。第二个发酵罐温度30℃，通气量1vvm，搅拌转速250r/min，罐压0.07MPa。
当第二个发酵罐液位达到80％，将正在培养的发酵液通过管道转入第三个发酵罐，流速2.1L/h。第三个发酵罐温度30℃，通气量1vvm，搅拌转速250r/min，罐压0.06MPa。
当第三个发酵罐液位达到80％，发酵结束，脂肪酶活8000U/L。控制出料速度2.1L/h。料液收集后可用于制备固定化脂肪酶。
连续发酵过程中，产酶情况如下表所示(以出料作为0h)：