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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210545880.1 (22)申请日 2012.12.14 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 益善生物技术股份有限公司 地址 510663 广东省广州市广州科学城揽月 路 80 号广州科技创新基地 B、 C 区五层 (72)发明人 刘丽 许昌有 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 万志香 秦雪梅 CN 102010906 A,2011.04.13, WO 2005/047533 A1,2005.05.26, 李卓等 . 北京地区。
2、慢性乙型重型肝炎患者肿 瘤坏死因子基因多态性相关性分析 .中华医学 杂志 .2007, 第 87 卷 ( 第 30 期 ),2105-2110. 刘军等 . 肿瘤坏死因子 TNF- 基因多态性 与精神分裂症易感性关系的 Meta 分析 .检验医 学 .2011, 第 26 卷 ( 第 5 期 ),306-311. (54) 发明名称 TNF 基因突变检测特异性引物和液相芯片 (57) 摘要 本发明公开了一种 TNF 基因突变检测液相芯 片和特异性引物， 该液相芯片主要包括有 ： 每种 由 5端的 tag 序列和 3端针对目的基因突变 位点的特异性引物序列组成的 ASPE 引物， 所述 特异性引。
3、物序列为 ： 针对 G8226A 位点的 SEQ ID NO.15 及 SEQ ID NO.16， 针对 G-308A 位点的 SEQ ID NO.17 及 SEQ ID NO.18， 针对 A1031G 位点的 SEQ ID NO.19 及 SEQ ID NO.20， 针对 G863T 位点 的 SEQ ID NO.21 及 SEQ ID NO.22， 针对 G857A 位 点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24， 针对G8146C 位点的 SEQ ID NO.25 及 SEQ ID NO.26， 和 / 或针 对C5478T位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO。
4、.28 ； 有不同 anti-tag 序列包被的微球 ； 扩增引物。本 发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法 的吻合率高达 100， 实现多个突变位点的野生 型和突变型并行检测。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张丽华 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书24页 序列表11页 CN 103865989 B 2016.05.18 CN 103865989 B 1.一种TNF基因突变检测液相芯片， 其特征是， 包括有： (A).针对TNF基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对： 每条ASPE 引物由5 端的tag序。
5、列和3 端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成， 所述ASPE引 物为： 针对G8226A位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.15组成的序列及由SEQIDNO.2和 SEQIDNO.16组成的序列， 以及选自针对G-308A位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.17组 成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.18组成的序列， 针对A1031G位点的由SEQIDNO.5 和SEQIDNO.19组成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.20组成的序列， 针对G863T位点 的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.21组成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO。
6、.22组成的序 列， 针对G857A位点的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.23组成的序列及由SEQIDNO.10和SEQ IDNO.24组成的序列， 针对G8146C位点的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.25组成的序列及由 SEQIDNO.12和SEQIDNO.26组成的序列， 和针对C5478T位点的由SEQIDNO.13和SEQID NO.27组成的序列及由SEQIDNO.14和SEQIDNO.28组成的序列中的至少一对； (B).有不同anti-tag序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述anti-tag序列与微 球连接中间还设有间隔臂序列； 所述anti-tag序列。
7、选自SEQIDNO.29SEQIDNO.42， 且 所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、 具有相应突变位点的目标序列的引物； 所述扩增引物为针对G8226A、 G-308A位点的SEQIDNO.43及SEQIDNO.44， 以及选自 针对A1031G、 G863T、 G857A位点的SEQIDNO.45及SEQIDNO.46， 针对G8146C位点的SEQID NO.47及SEQIDNO.48， 和针对C5478T位点的SEQIDNO.49及SEQIDNO.50中的至少一对。 2.根据权利要求1所述的TNF基因突变检测液相芯片， 。
8、其特征是， 所述ASPE引物为： 针对 G8226A位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.15组成的序列及由SEQIDNO.2和SEQID NO.16组成的序列， 针对G-308A位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.17组成的序列及由SEQ IDNO.4和SEQIDNO.18组成的序列， 针对A1031G位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.19组 成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.20组成的序列， 针对G863T位点的由SEQIDNO.7 和SEQIDNO.21组成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.22组成的序列， 针对G857A位点 的由SEQ。
9、IDNO.9和SEQIDNO.23组成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.24组成的序 列， 针对G8146C位点的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.25组成的序列及由SEQIDNO.12和 SEQIDNO.26组成的序列， 和针对C5478T位点的由SEQIDNO.13和SEQIDNO.27组成的序 列及由SEQIDNO.14和SEQIDNO.28组成的序列。 3.根据权利要求1或2所述的TNF基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述间隔臂为5 10个T。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103865989 B 2 TNF基因突变检测特异性引物和液相芯片 技术领域 000。
10、1 本发明属于分子生物学领域， 涉及医学和生物技术， 具体的是涉及一种TNF基因突 变检测特异性引物和液相芯片。 背景技术 0002 肿瘤坏死因子 （tumornecrosisfactor， TNF） 位于6号染色体6p21.3短臂上， 是肿 瘤坏死因子超家族成员之一。 肿瘤坏死因子是以巨噬细胞为主产生的一种细胞因子， 它的 最明显的活性特征是可以在体内或体外特异性地杀伤肿瘤细胞， 对正常组织细胞则无明显 毒性作用。 淋巴细胞产生的淋巴毒素(Lymphotoxin， LT)在DNA及氨基酸序列上与肿瘤坏死 因子同源性较高， 尤其是功能上非常相似， 因此又将巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子命名为 肿瘤。
11、坏死因子 (TNF- )， 将淋巴细胞产生的淋巴毒素命名为肿瘤坏死因子 (TNF )。 TNF作 为一种细胞因子， 不仅具有对瘤细胞的细胞毒杀伤作用， 同时也参与抗病毒、 抗感染、 凝血、 发热、 休克、 多器官功能衰竭、 恶液质等多种病理生理过程， TNF还可激活巨噬细胞及多形核 粒细胞、 增强其吞噬功能， 促进组织相容性抗原的表达、 促分化诱导以及调节机体的免疫应 答等多种重要的生物功能， 是一种具有潜在前途的抗肿瘤、 抗病毒感染以及免疫调节生物 制剂。 另外TNF与多种疾病的发生存在相关性， 例如， TNF与胃癌、 慢性支气管炎、 全结肠炎、 克罗恩病、 强迫性精神障碍、 糖尿病和消化道。
12、癌等疾病有关。 0003 目前， TNF基因突变检测方法主要有： PCR-RFLP技术、 荧光定量PCR技术和SNaPshot 技术。 PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变， 如位点丢失或产 生新位点， 通过PCR扩增某一特定片段， 再用限制性内切酶酶切扩增产物， 电泳观察片段的 大小， 这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变， 可直接判断基因型， 但该法不能用于没 有产生新酶切位点的基因突变检测。 。 荧光定量PCR技术存在灵敏度低， 样品易污染、 假阳性 率高的缺点。 SNaPShot技术检测效率高,但存在仪器昂贵、 样品分析均价高、 对样品要求高、 重复性差等。
13、缺点， 而且众多疾病与易感基因关系的研究仍需常规实验室中小规模研究。 发明内容 0004 本发明的目的之一是提供TNF基因突变检测液相芯片， 该液相芯片可用于单独或 并行检测TNF基因七种常见基因型G8226A、 G-308A、 A1031G、 G863T、 G857A、 G8146C和C5478T 的野生型和突变型。 0005 一种TNF基因突变检测液相芯片， 包括有： 0006 （A） .针对TNF基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对： 每条 ASPE引物由5 端的tag序列和3 端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成， 所述特 异性引物序列为： 针对G8226A位。
14、点的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16， 针对G-308A位点的SEQ IDNO.17及SEQIDNO.18， 针对A1031G位点的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20， 针对G863T位 点的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22， 针对G857A位点的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24， 针对 G8146C位点的SEQIDNO.25及SEQIDNO.26， 和/或针对C5478T位点的SEQIDNO.27及SEQ 说明书 1/24 页 3 CN 103865989 B 3 IDNO.28； 所述tag序列选自SEQIDNO.1SEQIDNO.14； 0007 （。
15、B） .有不同anti-tag序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述anti-tag序列 与微球连接中间还设有间隔臂序列； 所述anti-tag序列选自SEQIDNO.29SEQID NO.42， 且所述anti-tag序列能相应地与 （A） 中所选的tag序列互补配对； 0008 （C） .用于扩增出需要检测的、 具有相应突变位点的目标序列的引物。 0009 在其中一个实施例中， 所述扩增引物为： 针对G8226A、 G-308A位点的SEQIDNO.43 及SEQIDNO.44， 针对A1031G、 G863T、 G857A位点的SEQIDNO.45及SEQIDNO.46， 针对 G。
16、8146C位点的SEQIDNO.47及SEQIDNO.48， 和/或针对C5478T位点的SEQIDNO.49及SEQ IDNO.50。 0010 在其中一个实施例中， 所述ASPE引物为： 针对G8226A位点的由SEQIDNO.1和SEQ IDNO.15组成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.16组成的序列， 针对G-308A位点的由 SEQIDNO.3和SEQIDNO.17组成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.18组成的序列， 针 对A1031G位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.19组成的序列及由SEQIDNO.6和SEQID NO.20组成的序列， 针对。
17、G863T位点的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.21组成的序列及由SEQ IDNO.8和SEQIDNO.22组成的序列， 针对G857A位点的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.23组成 的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.24组成的序列， 针对G8146C位点的由SEQIDNO.11 和SEQIDNO.25组成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.26组成的序列， 和/或针对 C5478T位点的由SEQIDNO.13和SEQIDNO.27组成的序列及由SEQIDNO.14和SEQID NO.28组成的序列。 0011 本发明的另一目的是提供用于TNF基因突变检测。
18、的特异性引物。 0012 具体技术方案如下。 用于TNF基因突变检测的特异性引物， 特异性引物为针对 G8226A位点的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16， 针对G-308A位点的SEQIDNO.17及SEQID NO.18， 针对A1031G位点的SEQIDNO.19及SEQIDNO.20， 针对G863T位点的SEQIDNO.21 及SEQIDNO.22， 针对G857A位点的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24， 针对G8146C位点的SEQ IDNO.25及SEQIDNO.26， 和/或针对C5478T位点的SEQIDNO.27及SEQIDNO.28。 0013 本发明的。
19、主要优点在于： 0014 1.本发明所提供的TNF基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达 100， 且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术， 特别符合实际应用需要。 所制备的 TNF基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比， 并且所设计的探针以及anti-tag序 列之间基本上不存在交叉反应， tag标签序列、 anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列 与具体ASPE引物的结合， 能够避免交叉反应， 实现多个突变位点的并行检测。 0015 2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作， 从众多的特异性引 物中选取了最优的组合。 本发明设计的ASPE引物特异性。
20、引物能够灵敏特异地识别目标检测 的突变位点， 准确区分各种型别的基因型； 在同一个反应体系中， 不同的特异性引物之间、 特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应， 检测特异性好， 交叉 反应率低于3； 除了能够检测单个位点突变情况， 也能够同时并行检测多个突变位点的突 变情况， 检测效果一致。 0016 3.本发明的检测方法步骤简单， 7种突变位点检测可通过一步PCR即可完成4条含 有突变位点的目标序列的扩增， 避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定 说明书 2/24 页 4 CN 103865989 B 4 因素， 因而可大大提高检测准确率， 体现了精确的。
21、同时定性、 定量分析特征。 0017 4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高， 检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进， 使得所制备微球能适用于不同的检测项目， 具有很 强的拓展性。 检测的荧光信号值大大提高， 从而使得检测的灵敏度进一步得到提高， 信噪比 增强， 检测结果更加准确可靠。 具体实施方式 0018 实施例1TNF基因突变检测液相芯片， 主要包括有： 0019 一、 ASPE引物 0020 针对TNF基因七种常见基因型G8226A、 G-308A、 A1031G、 G863T、 G857A、 G8146C和 C5478T的野生型和突变型， 分别设计特异性。
22、引物序列。 ASPE引物由 “tag序列+特异性引物序 列” 组成。 ASPE引物序列如下表所示： 0021 表1TNF基因的ASPE引物序列 （tag序列+特异性引物序列） 0022 0023 说明书 3/24 页 5 CN 103865989 B 5 0024 每条ASPE引物包括两个部分， 5 端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag 序列， 3 端为突变型或野生型特异的引物片段 （如上述表1所示） 。 所有ASPE引物由上海生工 说明书 4/24 页 6 CN 103865989 B 6 生物工程技术服务有限公司合成。 合成后的每条引物分别用10mmol/LTrisBuff。
23、er配制成 100pmol/mL的贮存液。 0025 二、 anti-tag序列包被的微球 0026 根据所设计的ASPE特异性引物片段， 选择tag序列， 最大限度地减少各微球的 anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构， 选择的14种微球 编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示： 0027 表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列 0028 0029 说明书 5/24 页 7 CN 103865989 B 7 0030 选择的14种微球购自美国Luminex公司， 将anti-tag序列包被于微球上。 anti-tag 序列与微球之间连接。
24、有510个T的间隔臂序列， 即在每个anti-tag序列前加上一段510 个T的间隔臂序列， anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 将合成的 anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。 所述间隔臂为用于将anti-tag与微 球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。 通过在anti-tag序列与微球之 间设置适当长度的间隔臂序列， 可减少空间位阻， 提高杂交反应的效率以及杂交反应的特 异性。 常见的间隔臂序列包括多聚dT， 即poly （dT） ， 寡聚四聚乙二醇以及 （CH2） n间隔臂 （n 3） ， 如 （CH2） 。
25、12、（CH2） 18等。 另外， 如果存在poly （dA） 干扰， 还可以用poly （TTG） 作为间隔臂。 本发明间隔臂优选为510个T， 微球包被的过程如下： 0031 分别取5106个上述编号的羧基化的微球 （购自Luminex公司） 悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中 （pH4.5） ， 加入10ul合成的anti-tag分子 （100nmol/ml） 。 配制10ng/ml 的EDC （N- （3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide）（购自PierceChemical公司） 工作液。 往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作。
26、液， 恒温孵育30分钟， 再加入2.5ul的EDC工作 液， 再恒温孵育30分钟。 反应结束后， 用0.02的Tween-20洗涤一次， 再用0.1的SDS液洗 涤一次。 将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液10mmol/L Tris （pH8.0） ， 1mmol/LEDTA中， 2-8避光保存。 0032 三、 扩增出含有突变位点的目标序列的引物 0033 针对TNF基因七种常见基因型G8226A、 G-308A、 A1031G、 G863T、 G857A、 G8146C和 C5478T， 设计扩增引物对 （见表3） ， 扩增出4条含有7个突变。
27、位点的目标序列。 0034 表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物 0035 0036 说明书 6/24 页 8 CN 103865989 B 8 0037 所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 合成后的每条引物分别用 10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。 0038 实施例2运用实施例1所述的TNF基因突变检测液相芯片对样本的检测 0039 所述各种溶液的配方如下： 0040 50mM的MES缓冲液 （pH5.0） 配方 （250ml） ： 0041 0042 2Tm杂交缓冲液 0043 0044 过滤后贮存于4。 0045 ExoSAP-IT试。
28、剂盒购自美国USB公司。 0046 生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。 0047 一、 样本的DNA提取： 0048 参照 分子克隆 关于DNA提取的相关方法， 得到待检测的DNA。 0049 二、 待测样品的PCR扩增 0050 设计4对引物， 多重PCR一步扩增出4条分别含TNF基因七种常见基因型G8226A、 G- 308A； A1031G、 G863T和G857A； G8146C， C5478T的目标序列， 产物大小分别为420bp、 464bp、 165bp、 282bp， 引物序列 （SEQIDNO.43-50） 见上述表3所示。 0051 首先配制多重PC。
29、R引物工作液： 分别各取SEQIDNO.43-50的引物贮存液100ul于 1.5ml微量离心管中， 混合均匀即为多重PCR引物工作液。 多重PCR反应体系如下： 说明书 7/24 页 9 CN 103865989 B 9 0052 0053 PCR扩增程序为： 953min； 9430s， 5630s， 7240s， 30个循环； 7210min； 4 保存备用。 0054 三、 PCR产物的酶切处理 0055 1.取7.5ulPCR反应后的产物， 加入1ul10SAP缓冲液、 1ulSAP酶和0.5ulExo- I酶； 0056 2.37孵育15min， 80孵育15min， 灭活多余的酶。
30、。 酶切处理后的产物直接用于后 续的ASPE引物延伸反应。 0057 四、 位点特异的引物延伸反应 （ASPE） 0058 利用实施例1中设计的ASPE引物进行引物延伸反应， 在反应过程中掺入生物素标 记的dCTP， 从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。 0059 首先配制混合的ASPE引物工作液： 分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE 引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中， 加入10mmol/LTrisBuffer补至200ul， 混合均匀 即为ASPE混合引物工作液。 ASPE反应的体系如下： 0060 0061 反应程序为： 962min； 9430s， 541min，。
31、 722min， 30个循环； 4保存备用。 0062 五、 杂交反应 0063 1.根据设计的ASPE引物， 每组选择相应的14种包被的微球 （如实施例1所述） ， 每种 微球浓度均为2.5105个/ml； 0064 2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中； 0065 3.微球于 10000g离心1-2min； 说明书 8/24 页 10 CN 103865989 B 10 0066 4.弃去上清， 微球重悬于100ul的2Tm杂交缓冲液中， 涡旋混匀； 0067 5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中， 对照孔加25ul的ddH2O； 0068 6.取5-25u。
32、l的ASPE反应液于相应的孔中， 用ddH2O补足至50ul； 0069 7.用锡箔纸包住96孔板以避光， 9560s， 3715min孵育杂交； 0070 8.杂交后的微球于 3000g离心25min； 0071 9.去上清， 将微球重悬于75ul的1Tm杂交缓冲液中； 0072 10.微球于 3000g离心25min； 0073 11.将微球重悬于75ul的1Tm杂交缓冲液中， 加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲 和素-藻红蛋白 （SA-PE） ； 0074 12.37孵育15min， 于Luminex仪器上检测。 0075 六、 结果检测与数据分析 0076 反应后产物通过Lumi。
33、nex系列分析仪器检测。 检测结果如表4、 表5和表6所示。 0077 对荧光值 （MFI） 和数据处理有以下要求： 0078 1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10PCR阴性对照MFI； 0079 2.NETMFI=样品MFIPCR阴性对照MFI （NETMFI小于0的以0表示） ； 0080 3.满足以上两个条件的数据， 按下列公式计算突变比值： 0081 突变比值突变型NETMFI （突变型NETMFI野生型NETMFI） 0082 4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值 （cut-off值） ， 以划分野生型纯 合子、 杂合子和突变型纯合子。 0083 使用。
34、本方法检测20份样本的TNF基因SNP位点， 实验数据符合上述要求， 因此可计 算得它们的突变比值。 阈值 （cut-off值） 的设置如下： 突变比值范围在0%-20%视为野生型纯 合子； 30%-70%视为杂合子； 80%-100%视为变异型纯合子。 以测序法检测与液相芯片结果作 对照， 计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。 本方法检测20份样本的TNF基因型 检测结果与测序结果吻合率达到100。 可见本发明所提供的TNF基因SNP检测液相芯片能 够准确地检测出TNF的SNP类型， 且结果稳定可靠。 0084 表4样本检测结果 （MFI） 之一 0085 0086 说明书 9/24。
35、 页 11 CN 103865989 B 11 0087 表5样本检测结果 （MFI） 之二 0088 说明书 10/24 页 12 CN 103865989 B 12 0089 0090 表6样本TNF基因突变比值 （%） 0091 说明书 11/24 页 13 CN 103865989 B 13 0092 0093 表7样本TNF基因突变类型分析结果 0094 样本号液相芯片检测结果测序结果 1野生型野生型 2野生型野生型 38146CC8146CC 4野生型野生型 5野生型野生型 6野生型野生型 7野生型野生型 8野生型野生型 说明书 12/24 页 14 CN 103865989 B 。
36、14 9野生型野生型 10野生型野生型 111031AG1031AG 12野生型野生型 13野生型野生型 14857AA857AA 15野生型野生型 16野生型野生型 178226AA8226AA 18野生型野生型 19野生型野生型 20野生型野生型 0095 实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对TNF基因SNP位点的检测 0096 一、 液相芯片制备的设计 （Tag序列及Anti-Tag序列的选择） 0097 以TNF基因G8226A、 A1031G、 G857A和G8146C位点突变检测液相芯片为例， 分别针对 G8226A、 A1031G、 G857A和G8146C的野生型和突变型设计。
37、ASPE引物3 端的特异性引物序列， 而ASPE引物5 端的Tag序列则选自SEQIDNO.1-SEQIDNO.14， 相应的， 包被于微球上的与 对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQIDNO.29-SEQIDNO.42。 具体设计如下表 （表8） 所示。 ASPE引物的合成、 anti-tag序列包被微球、 扩增引物、 检测方法等如实施例1和 实施例2所述。 0098 表8液相芯片制备的设计 0099 说明书 13/24 页 15 CN 103865989 B 15 0100 说明书 14/24 页 16 CN 103865989 B 16 0101 一、 样品检测 010。
38、2 采用上述设计制备的液相芯片， 按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行 检测， 检测结果如下： 0103 表9样本TNF基因G8226A检测结果与基因多态性分析 0104 说明书 15/24 页 17 CN 103865989 B 17 0105 0106 表10样本TNF基因A1031G检测结果与基因多态性分析 0107 说明书 16/24 页 18 CN 103865989 B 18 0108 表11样本TNF基因G857A检测结果与基因多态性分析 0109 说明书 17/24 页 19 CN 103865989 B 19 0110 表12样本TNF基因G8146C检测结果与基。
39、因多态性分析 0111 说明书 18/24 页 20 CN 103865989 B 20 0112 0113 从上述实施例可见， 其它针对不同突变位点的液相芯片， ASPE引物运用不同的tag 序列， 其结果依然稳定可靠， 具体数据省略。 而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引 物序列搭配时， 效果更佳 （信噪比更好） ， 参见本实施例试验组1、 试验组5、 试验组9和试验组 12。 其它不同tag序列与特异性引物序列搭配， 与实施例2和本实施例的结果相同， 具体数据 省略。 0114 实施例4TNF基因突变检测特异性引物序列的选择 说明书 19/24 页 21 CN 1038659。
40、89 B 21 0115 一、 液相芯片制备的设计 （野生型和突变型特异性引物序列的选择） 0116 以TNF基因G863T和C5478T的多态性位点检测液相芯片为例， 以该突变位点所在目 标序列的正向或反向互补序列为模板， 分别针对G863T和C5478T的野生型和突变型设计 ASPE引物3 端的特异性引物序列， 包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条备选 的特异性引物序列， 如表13所示。 其中， 内碱基为多态性位点。 0117 表13特异性引物序列 0118 0119 以TNF基因G863T和C5478T的多态性位点检测液相芯片为例， 针对G863T和C5478T 选用不同的特异。
41、性引物序列， 而ASPE引物5 端的tag序列则固定为实施例1中的最佳效果序 列， 并选用与之相对应的anti-tag序列， 具体设计如下表 （表14） 所示。 ASPE引物的合成、 anti-tag序列包被微球、 扩增引物、 检测方法等如实施例1和实施例2所述。 0120 表14液相芯片制备的设计之二 0121 说明书 20/24 页 22 CN 103865989 B 22 0122 0123 二、 样品检测 0124 采用上述设计制备的液相芯片， 按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行 检测， 检测结果如下： 0125 表15样本TNF基因G863T检测结果与基因多态性分析 0。
42、126 说明书 21/24 页 23 CN 103865989 B 23 0127 0128 表16样本TNF基因C5478T检测结果与基因多态性分析 0129 说明书 22/24 页 24 CN 103865989 B 24 0130 由本实施例可见， ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列与tag序列搭配时， 效 果更佳 （信噪比更好） ， 参见本实施例试验组13和试验组16。 其它来源于目标检测位点所在 序列的正向或反向互补序列的不同特异性引物序列与tag序列搭配， 与实施例2和本实施例 的结果相同， 即依然是实施例2中所述的特异性引物序列与不同的tag序列搭配效果更佳， 具体数据省略。
43、。 0131 其它针对不同的SNP位点的多种特异性引物序列与tag序列搭配， 与实施例2和本 实施例的结果相同， 即实施例1所选择的特异性引物， 具有更好的信噪比， 检测效果也更好， 具体数据省略。 0132 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 说明书 23/24 页 25 CN 103865989 B 25 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说明书 24/。
44、24 页 26 CN 103865989 B 26 0001 0002 序列表 1/11 页 27 CN 103865989 B 27 序列表 2/11 页 28 CN 103865989 B 28 0003 0004 序列表 3/11 页 29 CN 103865989 B 29 序列表 4/11 页 30 CN 103865989 B 30 0005 序列表 5/11 页 31 CN 103865989 B 31 0006 序列表 6/11 页 32 CN 103865989 B 32 0007 序列表 7/11 页 33 CN 103865989 B 33 0008 序列表 8/11 页 34 CN 103865989 B 34 0009 序列表 9/11 页 35 CN 103865989 B 35 0010 0011 序列表 10/11 页 36 CN 103865989 B 36 序列表 11/11 页 37 CN 103865989 B 37 。