利用固定化脂肪酶制备地尔硫卓手性前体的装置及方法.pdf

本发明涉及一种利用固定化脂肪酶水解底物制备地尔硫卓手性前体的装置及方法。采用本发明中的装置及方法，可实现固定化脂肪酶连续或半连续拆分消旋物(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，获得地尔硫卓关键前体(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。本发明所用的装置及方法具有操作简易、产品易回收的优点。

1、  一种固定化脂肪酶连续制备地尔硫卓手性前体的装置及方法。

2、  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所用的装置及方法可实现固定化脂肪酶连续或半连续水解(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯获得(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。

3、  如权利要求2所述的应用，其特征在于所用脂肪酶通过沙雷氏杆菌Serratia marcescensECU1010(保藏号CGMCC No.1219)按专利ZL 200410067046.1发酵获得。

4、  如权利要求2所述的应用，采用壳聚糖-戊二醛交联法制备固定化脂肪酶。制备过程包括下列步骤：
(1)制备固定化载体：将0.5-2g壳聚糖，溶于20-50ml 1.5-4％的醋酸溶液中，用注射器逐滴滴到5-20％NaOH溶液中，抽滤收集获得的小球，水洗至中性，备用。
(2)固定化载体活化：将获得的壳聚糖载体投入到50ml 0.5-3％的戊二醛水溶液中，30℃振摇2-12h，选择孔径大小为100目、120目尼龙网过滤(截留直径大小约为120微米到150微米的壳聚糖载体)，洗涤。
(3)酶固定化：投入50ml发酵液中，4℃搅拌固定化2h，抽滤、洗涤。固定化酶备用。

5、  如权利要求2所述的应用，其特征在于带搅拌的釜式反应器，可控温、控pH。

6、  如权利要求2所述的应用，其特征在于釜式反应器内带有可拆卸的、带孔径大小为200目的框，固定化脂肪酶可放在此部件中。

7、  如权利要求2所述的应用，其特征在于在固定化酶置于釜式反应器后，加入含有底物(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的甲苯，同时加入等体积的水，搅拌转速100-200r/min，温度20-40℃，pH 6.0-9.0。待剩余底物的ee值高于99％时终止反应，从反应器底部排出料液，固定化酶被拦截在反应器内，不随料液排出。重新加入含有底物的甲苯和水，继续反应。可以实现固定化酶半连续水解获得(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。当固定化酶达到半衰期后，直接将框从反应器内取出，完全倾出固定化酶，加入新的固定化酶，重新放入反应器内。反应器其它部件不需拆卸、清洗。底物浓度控制在1.5mol/L。

8、  如权利要求2所述的应用，其特征在于在固定化酶置于釜式反应器后，加入含有底物的甲苯，同时加入等体积的水。搅拌转速100-200r/min，温度20-40℃，pH 6.0-9.0。待剩余底物的ee值高于99％时，从反应器顶部流加含有底物的甲苯和水，从反应器底部按同等速度排出料液。过程中始终控制排出料液ee值高于99％。可以实现固定化酶连续水解获得(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯。当固定化酶达到半衰期后，直接将框从反应器内取出，完全倾出固定化酶，加入新的固定化酶，重新放入反应器内。反应器其它部件不需拆卸、清洗。底物浓度控制在0.5mol/L。

利用固定化脂肪酶制备地尔硫卓手性前体的装置及方法
技术领域
本发明涉及一种利用固定化脂肪酶水解底物制备地尔硫卓手性前体的装置及方法。
技术背景
地尔硫卓是一种钙离子通道阻滞剂，被广泛应用于心绞痛和高血压的长期治疗。采用来自沙雷氏杆菌(Serratia marcescens ECU1010，保藏号CGMCC No.1219)的脂肪酶拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，不需要的(+)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯被脂肪酶选择性地水解，(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯被保留下来，可用于合成地尔硫卓。
固定化酶具有回收容易、可反复使用的优点。与分批操作方式相比，以固定化酶为催化剂、利用反应器实现连续或半连续获取产物，有助于减轻劳动强度、减少辅助操作时间、提高生产强度。
文献Journal of Fermentation and Bioengineering 1994，78：59-63介绍了一种利用膜进行脂肪酶固定化及拆分(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯获得(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的反应器和方法。其不足之处在于反应器所用膜必须是由耐有机溶剂的特殊材料制成，装置成本高。
发明内容
本发明的目的在于，提供利用固定化酶连续或半连续制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的装置和方法，减少辅助操作时间。
本发明通过以下方案实现：
(1)采用Serratia marcescens ECU1010(保藏号CGMCC No.1219)按专利ZL200410067046.1所公开的方法发酵获得脂肪酶。
(2)用壳聚糖-戊二醛交联方法进行脂肪酶的固定化。
第一步，制备固定化载体。将0.5-2g壳聚糖，溶于20-50ml 1.5-4％的醋酸溶液中，用注射器逐滴滴到5-20％NaOH溶液中，抽滤收集获得的小球，水洗至中性，备用。
第二步，固定化载体活化。将获得的壳聚糖载体投入到50ml 0.5-3％的戊二醛水溶液中，30℃振摇2-12h，选择孔径大小为100目、120目尼龙网过滤(截留直径大小约为120微米到150微米的壳聚糖载体)，洗涤。第三步，酶固定化。投入50ml发酵液中，4℃搅拌固定化2h，抽滤、洗涤。固定化酶备用。
(3)将固定化脂肪酶置于带有搅拌的釜式反应器中，此反应器可控温、调pH，并带有可拆卸的、带孔径大小为200目的框，固定化酶便放在此部件中。
(4)进行半连续反应时，向装有固定化酶的反应器加入含有底物(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的甲苯和等体积的水，搅拌转速100-200r/min，温度20-40℃，pH 6.0-9.0。不断检测，当剩余底物的ee值高于99％时，从反应器底部排出料液，固定化酶被拦截在反应器内，不随料液排出。固定化酶不需清洗，重新加入含有底物的甲苯和水，继续反应。
当固定化酶达到半衰期后，直接将框从反应器内取出，完全倾出固定化酶，加入新的固定化酶，重新放入反应器内。反应器其它部件不需拆卸、清洗。
(5)进行连续反应时，向装有固定化酶的反应器加入含有底物(±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的甲苯和等体积的水，搅拌转速100-200r/min，温度20-40℃，pH 6.0-9.0。不断检测水解过程。当剩余底物的ee值高于99％时，从反应器顶部流加含有底物的甲苯和水，按同等速度从反应器底部排出料液。整个过程，维持料液ee值高于99％。
具体实施方式
实施例1：
固定化载体：将0.5g壳聚糖，溶于20ml 2.5％的醋酸溶液中，用注射器逐滴滴到20％NaOH溶液中，抽滤收集获得的小球，水洗至中性，备用。
将获得的壳聚糖载体投入到50ml 1％的戊二醛水溶液中，30℃振摇12h，抽滤，洗涤。投入50ml脂肪酶发酵液(5000U/L)中，4℃搅拌固定化2h，抽滤、洗涤。
表1壳聚糖固定化沙雷氏菌脂肪酶

实施例2：
按实施例1制备固定化酶。取1kg固定化脂肪酶(21U/g)投入10L反应器(尺寸)中。该反应器内有4个长方体方框，每个方框内分别装入0.25kg固定化酶。反应器有保温夹套和pH探头。加入624g(±)-MPGM(3.0mol)，加3L甲苯以及3L自来水，30℃，200rpm搅拌反应，流加氨水控制反应pH恒定为8.5。间歇取样，待剩余底物的ee值高于99％时终止反应，打开反应器底阀，排出料液。固定化酶不用取出、也不用清洗，投入底物、甲苯、水，重新进行反应。连续反应7批，反应过程情况如表2所示。产率为1.3kg(-)-MPGM/kg固定化酶。
7批反应后，直接取出装有固定化酶的框，将固定化酶倒净，仍补入1kg固定化酶，放回反应器后继续拆分。
实施例3：
按实施例1制备固定化酶。采用实施例2的反应器，固定化酶用量及底物用量同实施例2。30℃，200rpm搅拌反应，流加氨水控制反应pH恒定为8.5。7h后，底物的ee值高于99％时，打开底阀，按流量0.9L/h排出料液，顶部同时流加甲苯和水，流速均控制在0.45L/h。反应进程结果如表2所示，产率为1.5kg(-)-MPGM/kg固定化酶。
表2壳聚糖固定化酶催化拆分(±)-MPGM的反应进程