一类螺甾类化合物及其应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201610301627.X	申请日：	20160506
公开号：	CN105859825A	公开日：	20160817
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C07J71/00,A61K31/58,A61K31/7048,A61P35/00,A61P29/00	主分类号：	C07J71/00,A61K31/58,A61K31/7048,A61P35/00,A61P29/00
申请人：	广东药学院
发明人：	何祥久,向丽敏,王宜海,易晓敏
地址：	510006 广东省广州市大学城外环东路280号
优先权：	CN201610301627A
专利代理机构：	广州嘉权专利商标事务所有限公司	代理人：	胡辉;舒胜英
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内容摘要

本发明公开了一类螺甾类化合物及其应用。所述螺甾类化合物从开口箭根茎中提取分离得到，经过实验研究发现本发明获得的9种螺甾皂苷类化合物在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用，对咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌等都具有一定的抑制作用。说明本发明螺甾类化合物具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。

权利要求书

1.螺甾类化合物，其结构式分别为：化合物1：化合物2：化合物3：化合物4：化合物5：化合物6：化合物7：化合物8：化合物9： 2.权利要求1所述螺甾类化合物在制备防治癌症药物中的应用。 3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述癌症为咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌。 4.权利要求1所述螺甾类化合物在制备抗炎药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及螺甾类化合物及其应用。

背景技术

肿瘤是人体器官组织的细胞在外来和内在有害因素的长期作用下所产生的一种以细胞过度增殖为主要特点的新生物，在医学上可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。良性肿瘤对人体健康影响较小，而恶性肿瘤(又称癌症)则严重威胁着人类的健康。根据世界卫生组织和美国癌症协会的最新统计数据，癌症已成为人类死亡的首要病因，2008年全世界约有1270万新诊断癌症病例和760万癌症死亡病例(约占所有死亡人数的13％)，且大约有70％的癌症死亡病例发生在中低收入国家。预计到2030年，癌症年诊断和死亡病例将分别高达2140万和1320万。

天然药物尤其是来源于植物的药物具有化学结构多样性和生物活性多样性，一直是人类预防和治疗疾病的主要来源。临床上应用的许多药物都直接或间接来源于天然产物，天然产物不仅可以作为药物半合成的前体物，而且可以作为药物化学合成的的模板，为新药设计提供新思路。天然产物已成为发现新药物或先导化合物的主要源泉之一。

开口箭(Tupistra Chinensis)为百合科(Liliaceae)铃兰族(Convallarieae)开口箭属(Tupistra)植物。主要分布于我国中部和西南部，主产于湖北三峡库区及神龙架林区。开口箭在土家族医药中享有极高声誉,为神农架四大名药之一药用部位为其根状茎。开口箭味甘微苦，性寒，具有清热解毒、益气活血、散瘀止痛等多种功效，民间用于咽喉肿痛、劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调等症。使用方便,疗效显著,已有数百年的应用历史。临床上，开口箭饮片治疗慢性咽炎效果良好。

开口箭根茎的主要活性成分为甾体皂苷类成分。现代药理实验研究表明开口箭具有较强的抗肿瘤、抗炎、抑菌等活性。现有研究对开口箭化学成分研究仍不够彻底，因而开口箭中甾体类化学成分值得进一步研究和开发利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一类螺甾类化合物。

本发明的另一目的在于提供螺甾类化合物的应用。

本发明所采取的技术方案是：

螺甾类化合物，其结构式分别为：

化合物1：

化合物2：

化合物3：

化合物4：

化合物5：

化合物6：

化合物7：

化合物8：

化合物9：

上述螺甾类化合物在制备防治癌症药物中的应用。

进一步的，上述癌症为咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌。

上述螺甾类化合物在制备抗炎药物中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明通过长期研究，从开口箭根茎中分离鉴定了一类新型螺甾类化合物1～9。通过研究发现该化合物1～9在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用。该类化合物从植物中提取获得，具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。

附图说明

图1为本发明化合物(50μM)对不同肿瘤细胞的抑制作用；

图2为本发明化合物(50μM)对Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的抑制作用；ctl-：空白对照；ctl+：模型组；*p<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 螺甾类化合物的提取及鉴定

一、螺甾类化合物的提取

取开口箭根茎17kg，用60％乙醇加热回流提取4次，每次4小时，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏，将总浸膏用水混悬，用乙酸乙酯等体积萃取4次，除去脂溶性杂质，水层经D101大孔树脂柱层析分离，分别以水、20％乙醇，60％乙醇，80％乙醇、95％乙醇进行洗脱，得到5个馏分TA、TB、TC、TD、TE。取馏分TC(60％乙醇洗脱部分)200g，采用硅胶柱色谱、ODS中低压柱色谱、反相高效液相色谱等分离方法，分离得到本发明化合物1和2。采用同样的分离手段从馏分TD(80％乙醇洗脱部分)中分离得到本发明化合物3-9。通过理化常数和现代波谱学手段(HRESIMS,1D-NMR,2D-NMR)鉴定以上9个化合物的结构，化合物1为spirost-25(27)-en-1β,3α,5β-triol，化合物2为spirost-25(27)-en-1β,3α,4β,5β,6β-pentol，化合物3为5β-spirost-25(27)-en-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside，化合物4为5β-spirost-25(27)-en-1β,3β-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside，化合物5为(25R)-5β-spirostan-1β,3β-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside,化合物6为(25R)-5β-spirostan-1β,3β-diol-3-O-β-D-fructofuranosyl-(2→6)-β-D-glucopyranoside，化合物7为spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,5β-tetraol-5-O-β-D-glucopyranoside，化合物8为spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,4β,5β-pentol-2-O-β-D-xylopyranoside，化合物9为spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,4β,5β-pentol-2-O-α-L-arabinopyranoside。所获得的化合物1～9的结构以表1所示的结构式为准。

表1 本发明9个螺甾类化合物的结构

二、螺甾类化合物的鉴定

化合物1-9的结构鉴定过程如下：

化合物1的鉴定

spirost-25(27)-en-1β,3α,5β-triol(化合物1):白色无定形粉末，在IR(KBr)中显示出强的多羟基的吸收峰3300cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，提示该化合物为螺甾类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 447.3112(calcd.for C27H43O5447.3110)，提示其分子量为446，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C27H42O5。

在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ0.87(3H，s，Me-18)、1.50(3H,s，Me-19)及1.12(3H,d,J＝7.0Hz，Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号δ4.83(1H，brs)和4.80(1H，brs)。

13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)给出27个碳信号，提示该化合物为螺甾皂苷元。其中δ109.8为螺甾皂苷C-22特征信号，δ144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号，在糖端基碳区未见糖端基碳信号，说明该化合物为甾体皂苷元。比较该化合物与化合物(25R,S)-spirostan-1β,3α,5β-triol的碳谱数据，A、B、C、D、E环数据基本一致，仅F环数据有差异，推测可能是该化合物的25位与27位碳形成末端双键的缘故。在HMBC谱中，两个末端双键上的质子信号δ4.83(1H，brs)和4.80(1H，brs)与C-24(δ29.3)和C-26(δ65.4)相关，也证明25(27)位双键的存在。综合以上信息，化合物1鉴定为spirost-25(27)-en-1β,3α,5β-triol。通过HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱可对化合物1的核磁信号进行完全归属，化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据见表2，结构见表1。

化合物2的鉴定

spirost-25(27)-en-1β,3α,4β,5β,6β-pentol(化合物2):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3398cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，提示该化合物为螺甾类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 479.3018(calcd.for C27H43O7 479.3009)，提示其分子量为478，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C27H42O7。

通过对化合物2的1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC和1H-1H COSY和NOESY谱的分析可以对其分子中的碳及氢信号进行全面归属。其1H-NMR谱给出三个特征的甲基信号δ0.87(3H，s，Me-18)、1.86(3H,s，Me-19)和1.10(3H,d,J＝7.0Hz，Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号δ4.81(1H，s)和4.78(1H，s)。13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出27个碳信号，在糖端基碳信号区没有出现糖端基碳信号，说明化合物2是一个甾体皂苷元。其中δ109.8为螺甾皂苷C-22特征信号，δ144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号。

在1H-1H COSY谱中，两个亚甲基质子δ2.23(H-2α)和2.62(H-2β)与连氧次甲基质子δ4.19(H-1)和4.85(H-3)相关，而连氧次甲基质子δ4.85(H-3)与另一个连氧次甲基质子δ4.34(H-4)相关，连氧次甲基质子δ4.95(H-6)与两个亚甲基质子δ1.55(H-7α)和2.07(H-7β)相关。此外，在1H-NMR谱低场区存在一个尖锐单峰质子信号δ6.00，由于该质子与C-4、C-5、C-6和C-10分别具有HMBC相关，可以将该质子归属为C-5上连接的羟基质子。通过以上分析，可以确定该化合物含有5个羟基基团，分别连接在C-1、C-3、C-4、C-5和C-6位。

化合物2的相对构型可以通过NOESY谱得以确定。在NOESY谱中，H-4α与H-7α和H-9α相关，H-2α与H-9α相关，说明A、B环是顺式相连，因而C-4和C-5羟基为β构型。另外，H-1α与Me-19和H-11相关，H-3β与H-2β相关，H-6α与H-7α相关，表明C-1和C-6羟基为β构型，C-3羟基为α构型。综合以上信息，化合物2鉴定为spirost-25(27)-en-1β,3α,4β,5β,6β-pentol。化合物2的1H-NMR和13C-NMR数据见表2，化合物2的结构见表1。

化合物3的鉴定

5β-spirost-25(27)-en-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(化合物3):白色无定形粉末，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 739.4254(calcd.forC39H63O13 739.4269)，提示其分子量为738，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C39H62O13。

在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ0.82(3H，s，Me-18)、0.84(3H,s，Me-19)和1.10(3H,d,J＝6.9Hz，Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号δ4.83(1H，s)和4.79(1H，s)；在糖端基信号区给出两个糖端基氢信号δ4.91(1H,d,J＝7.8Hz)和5.23(1H,d,J＝7.9Hz)，提示该化合物为双糖螺甾皂苷。

13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出39个碳信号，其中δ109.8为螺甾皂苷C-22特征信号，δ144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号。该化合物的碳谱数据与文献报道的5β-spirost-25(27)-en-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside基本一致，仅糖链部分数据存在差异。在糖端基碳区给出两个糖端基碳信号δ103.2和105.3，结合酸水解结果，确定为两分子葡萄糖。通过与化合物3对照，它们糖区碳谱数据基本一致，故可推测该化合物糖链连接为-Glc4-Glc,其二维图谱也证明了上述推测。结合HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱可对化合物3的核磁信号进行完全归属。综合以上信息，化合物3鉴定为5β-spirost-25(27)-en-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside。化合物3的1H-NMR和13C-NMR数据见表3，化合物3的结构见表1。

化合物4的鉴定

5β-spirost-25(27)-en-1β,3β-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(化合物4):白色无定形粉末，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 755.4807(calcd.forC39H63O14 755.4218)，提示其分子量为754，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C39H62O14。

1H-NMR谱中，高场区出现三个特征的甲基信号，其中两个为单峰，分别位于δ0.84(3H,s,Me-18)和1.26(3H,s,Me-19)，另一个为双峰，位于δ1.10(3H,d,J＝7.0Hz,Me-21)。较低场区显示两个末端双键上的质子信号δ4.82(1H,s)和4.79(1H,s)。在糖端基信号区给出两个糖端基质子信号δ5.21(1H,d,J＝7.9Hz)和4.97(1H,d,J＝7.8Hz)，提示化合物4为双糖螺甾皂苷。

13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)中共有39个碳信号。其中δ109.8为螺甾类皂苷骨架上22位碳的特征信号，δ144.8和109.1为一对末端双键的特征信号，δ105.3与101.3为糖端基碳信号。将该化合物苷元部分碳信号与已知化合物isorhodeasapogenin比较，发现除了F环及3位碳信号有较大差别外，其余碳信号基本一致，因此可以推测该化合物苷元为25(27)位双键结构的isorhodeasapogenin。此外化合物4的3位碳信号较isorhodeasapogenin向低场发生了较大位移，因此可以推断该化合物的3位羟基成苷。通过与已知化合物isorhodeasapogenin3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside对照，它们糖区碳谱数据基本一致，故推测化合物4的糖链连接顺序为3-O-β-D-Glc-(1→4)-β-D-Glc。在HMBC谱中糖端基质子δ5.21与内侧糖的C-4(δ81.5)相关,内侧糖端基质子δ4.97与苷元C-3(δ75.2)相关，进一步确定该化合物的糖链与化合物isorhodeasapogenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside完全相同。综上所述，化合物4鉴定为5β-spirost-25(27)-en-1β,3β-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside。化合物4的1H-NMR和13C-NMR数据见表3，化合物4的结构见表1

化合物5的鉴定

(25R)-5β-spirostan-1β,3β-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside(化合物5):白色无定形粉末，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 757.4403(calcd.forC39H65O14 757.4374)，提示其分子量为756，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C39H64O14。

在IR(KBr)中，3411cm-1为多羟基的吸收峰，在1000-800cm-1之间，919cm-1(B带)小于899cm-1(C带)，说明化合物25位为R构型[97]。

在1H-NMR谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个特征的甲基信号，其中两个为单峰，分别位于δ0.81(3H,s,Me-18)和1.24(3H,s,Me-19)，另外两个为双峰，位于δ0.68(3H,d,J＝5.6Hz,Me-27)和1.14(3H,d,J＝6.9Hz,Me-21)。在糖端基信号区给出两个糖端基质子信号δ5.02(1H,d,J＝7.7Hz)和4.93(1H,d,J＝7.8Hz)，提示化合物5为双糖螺甾皂苷。由糖端基氢信号的J值可知两个葡萄糖均为β构型。

13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)中共有39个碳信号。其中δ109.6为螺甾类皂苷骨架上22位碳的特征信号，δ105.3与102.4为两个糖端基碳信号。该化合物的碳谱数据与已知化合物isorhodeasapogenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside十分相似，仅糖区的碳信号有所差别，因此可以推测二者拥有相同的苷元及糖组成，只是糖的连接方式不相同。分析化合物5葡萄糖的碳谱数据，发现一个葡萄糖的6位碳(δ70.7)向低场位移了7.7ppm，因此推测两个葡萄糖连接方式为-Glc-(6→1)-Glc。在HMBC谱中糖端基质子δ5.02与内侧糖的C-6(δ70.7)相关,内侧糖端基质子δ4.93与苷元C-3(δ76.0)相关，进一步证明了两个葡萄糖链接位点的正确性。综合以上信息，化合物5鉴定为(25R)-5β-spirostan-1β,3β-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside。化合物5的1H-NMR和13C-NMR数据见表4，化合物5的结构见表1。

化合物6的鉴定

(25R)-5β-spirostan-1β,3β-diol-3-O-β-D-fructofuranosyl-(2→6)-β-D-glucopyranoside(化合物6)：化合物6为白色无定形粉末，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖和D-果糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z757.4401(calcd.for C39H65O14 757.4374)，提示其分子量为756，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C39H64O14。

在IR(KBr)中，3391cm-1为多羟基的吸收峰，在1000-800cm-1之间，918cm-1(B带)小于899cm-1(C带)，说明化合物25位为R构型。

在1H-NMR谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个特征的甲基信号，其中两个为单峰，分别位于δ0.81(3H,s,Me-18)和1.23(3H,s,Me-19)，另外两个为双峰，位于δ0.69(3H,d,J＝5.6Hz,Me-27)和1.14(3H,d,J＝7.0Hz,Me-21)。在糖端基信号区只给出一个糖端基质子信号δ4.89(1H,d,J＝7.8Hz)。

13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)中共有39个碳信号。其中δ109.6为螺甾类皂苷骨架上22位碳的特征信号。在糖端基信号区给出两个糖端基碳信号δ106.2和102.1，提示化合物6为双糖螺甾皂苷。结合DEPT谱可知106.2处为季碳，提示该化合物含有一分子酮糖，与酸水解检出D-果糖(六碳酮糖)一致。化合物6的苷元部分及葡萄糖部分的碳信号与化合物5基本一致，提示化合物6也是isorhodeasapogenin的3位成苷的螺甾皂苷。在HMBC谱中，葡萄糖6位质子信号δ4.85(1H,d,J＝9.1Hz)和4.55(1H,m)与果糖2位碳信号(δ106.2)相关，葡萄糖1位质子信号δ4.89(1H,d,J＝7.8Hz)与苷元3位碳信号(δ75.6)相关，结合文献，确定该化合物的糖链链接为3-O-Glc-(6→2)-Fru。综合以上信息，化合物6鉴定为(25R)-5β-spirostan-1β,3β-diol-3-O-β-D-fructofuranosyl-(2→6)-β-D-glucopyranoside。化合物6的1H-NMR和13C-NMR数据见表4，化合物6的结构见表1。

化合物7的鉴定

spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,5β-tetraol-5-O-β-D-glucopyranoside(化合物7):化合物7为白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3424cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 625.3630(calcd.for C33H53O11 625.3588)，提示其分子量为624，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C33H52O11。

在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ0.83(3H，s，Me-18)、1.62(3H,s，Me-19)和1.08(3H,d,J＝7.0Hz，Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号δ4.83(1H，s)和4.79(1H，s)；在糖端基信号区给出一个糖端基氢信号δ5.29(1H,d,J＝7.7Hz)，结合糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，提示该化合物为含有一个β-D-葡萄糖单糖螺甾皂苷。

13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出33个碳信号，其中δ109.8为螺甾皂苷C-22特征信号，δ144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号，δ97.7为糖端基碳信号。经与文献对照[102]，该化合物与spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,5β-tetraol-5-O-β-D-galactopyranoside苷元部分的碳谱数据基本一致，仅糖区信号不同，提示化合物7的苷元为spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,5β-tetraol。在HMBC谱中，葡萄糖端基质子信号δ5.29(1H,d,J＝7.7Hz)与苷元C-5(δ83.4)相关，从而确定葡萄糖连接在化合物7的C-5位。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC、1H-1H COSY和NOESY谱并结合文献可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物7鉴定为spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,5β-tetraol-5-O-β-D-glucopyranoside。化合物7的1H-NM和13C-NMR数据见表5，化合物7的结构见表1。

化合物8的鉴定

spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,4β,5β-pentol-2-O-β-D-xylopyranoside(化合物8):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3364cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-木糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z611.3437(calcd.for C32H51O11 611.3431)，提示其分子量为610，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C32H50O11。

在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ0.84(3H，s，Me-18)、1.59(3H,s，Me-19)和1.09(3H,d,J＝7.0Hz，Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号δ4.82(1H，s)和4.79(1H，s)；在糖端基信号区给出一个糖端基氢信号δ5.15(1H,d,J＝7.5Hz)，结合糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，提示该化合物为含有一个β-D-木糖的单糖螺甾皂苷。

13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出32个碳信号，其中δ109.8为螺甾皂苷C-22特征信号，δ144.7和109.1为25和27位末端双键的特征信号，δ103.5为糖端基碳信号。另将该化合物苷元部分碳谱数据与已知化合物Δ25(27)-pentrogenin比较，发现除了2位碳信号向低场位移6.6ppm外，其余信号基本一致，因此推测该化合物为Δ25(27)-pentrogenin的2位苷化后形成的甾体皂苷。在HMBC谱中，木糖端基质子信号δ5.15(1H,d,J＝7.5Hz)与苷元C-2(δ74.4)相关，从而确定木糖连接在化合物T38的C-2位。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物8鉴定为spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,4β,5β-pentol-2-O-β-D-xylopyranoside。化合物8的1H-NMR和13C-NMR数据见表6，化合物8的结构见表1。

化合物9的鉴定

spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,4β,5β-pentol-2-O-α-L-arabinopyranoside(化合物9):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3422cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出L-阿拉伯糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 611.3412(calcd.for C32H51O11 611.3431)，提示其分子量为610，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C32H50O11。

在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号δ0.83(3H，s，Me-18)、1.58(3H,s，Me-19)和1.09(3H,d,J＝7.0Hz，Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号δ4.81(1H，s)和4.78(1H，s)；在糖端基信号区给出一个糖端基氢信号δ5.13(1H,d,J＝7.0Hz)，结合糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，提示该化合物为含有一个α-L-阿拉伯糖的单糖螺甾皂苷。

13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)显示出32个碳信号，其中δ109.8为螺甾皂苷C-22特征信号，δ144.7和109.1为25和27位末端双键的特征信号，δ103.4为糖端基碳信号。另将该化合物的碳谱数据与化合物8比较，二者苷元部分数据基本一致，仅糖区信号有差异，推测该化合物同样也为Δ25(27)-pentrogenin的2位苷化后形成的甾体皂苷，只是2位连接的是阿拉伯糖而不是木糖。在HMBC谱中，阿拉伯糖端基质子信号δ5.13(1H,d,J＝7.0Hz)与苷元C-2(δ74.0)相关，从而确定阿拉伯糖连接在化合物9的C-2位。通过1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物9鉴定为spirost-25(27)-en-1β,2β,3β,4β,5β-pentol-2-O-α-L-arabinopyranoside。化合物9的1H-NMR和13C-NMR数据见表6，化合物9的结构见表1。

表2 本发明化合物1和化合物2的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)

表3 本发明化合物3和化合物4的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)

表4 本发明化合物5和化合物6的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)

表5 本发明化合物7的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)

表6 本发明化合物8和化合物9的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5)

实施例2 抑瘤试验：

本发明化合物对人体7个瘤株的体外抑瘤活性实验，这7个瘤株包括FaDu(人咽鳞癌细胞)、Detroit 562(人咽头癌胸水转移细胞)，CNE-1(高分化人鼻咽鳞癌细胞),CNE-2(低分化人鼻咽鳞癌细胞),HepG2(人肝癌细胞),K562(人慢性骨髓性白血病细胞),SPC-A-1(人肺腺癌细胞)七种人体肿瘤细胞的细胞毒活性以及对正常细胞L-929(小鼠成纤维细胞)的毒性。抗癌药cis-dichlorodiamineplatinum(II)(顺铂)作为阳性对照。

抑制肿瘤细胞增殖(MTT法)

将肿瘤细胞接种于96孔板中，培养24h后加入待测试样品，再培养48h后用MTT法测定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。

细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(阴性对照组OD值平均值-空白对照组OD值平均值)×100％

实验结果见表7和图1。

表7:本发明化合物对不同肿瘤细胞的抑制作用

从表7和图1的实验数据可知，化合物1～9对不同的肿瘤细胞均具有较好的抑制作用，尤其是化合物1、3～6对不同的肿瘤细胞表现出很好的抑制作用(见表7)，而其余化合物在浓度为50μM时对不同的肿瘤细胞也有不同程度的抑制作用(见图1)。

实施例3 抗炎试验：

本发明化合物对体外抗炎活性实验，采用LPS(脂多糖)诱导的Raw 264.7(小鼠巨噬细胞)细胞，建立体外炎症模型。采用MTT和Griess实验，考察本发明化合物对经脂多糖诱导后的Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的影响。抗炎药Indomethacin(吲哚美辛)作为阳性对照。

1)MTT实验

Raw 264.7细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后用MTT法测定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。

细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(阴性对照组OD值平均值-空白对照组OD值平均值)×100％

2)Griess实验

Raw 264.7细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后，吸取各孔培养液50μL，加入50μL Griess A试剂和50μL Griess B试剂混匀，用酶标仪于546nm处测定OD值，按如下公式计算对NO产生的抑制率，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。

NO抑制率＝(模型对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(模型对照组OD值平均值-阴性对照组OD值平均值)×100％

实验结果见表8和图2。

表8:本发明化合物对Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的抑制作用

从表8和图2的实验数据可知，本发明化合物1～9具有较好体外抗炎活性，尤其是化合物2～8表现出更佳的抗炎活性(见表8)，化合物1和9在浓度为50μM时对LPS诱导的Raw264.7细胞释放炎症介质NO也有不同程度的抑制作用(见图2)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610301627.X (22)申请日 2016.05.06 (71)申请人广东药学院地址 510006 广东省广州市大学城外环东路280号 (72)发明人何祥久向丽敏王宜海易晓敏 (74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 代理人胡辉舒胜英 (51)Int.Cl. C07J 71/00(2006.01) A61K 31/58(2006.01) A61K 31/7048(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 2。

2、9/00(2006.01) (54)发明名称一类螺甾类化合物及其应用 (57)摘要本发明公开了一类螺甾类化合物及其应用。所述螺甾类化合物从开口箭根茎中提取分离得到，经过实验研究发现本发明获得的9种螺甾皂苷类化合物在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用，对咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌等都具有一定的抑制作用。说明本发明螺甾类化合物具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。权利要求书2页说明书18页附图1页 CN 105859825 A 2016.08.17 CN 105859825 A 1.螺甾类化合物，其结构式分。

3、别为：化合物1：化合物2：化合物3：化合物4：化合物5：权利要求书 1/2 页 2 CN 105859825 A 2 化合物6：化合物7：化合物8：化合物9： 2.权利要求1所述螺甾类化合物在制备防治癌症药物中的应用。 3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述癌症为咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌。 4.权利要求1所述螺甾类化合物在制备抗炎药物中的应用。权利要求书 2/2 页 3 CN 105859825 A 3 一类螺甾类化合物及其应用技术领域 0001 本发明属于医药技术领域，具体涉及螺甾类化合物及其应用。背景技术 0。

4、002 肿瘤是人体器官组织的细胞在外来和内在有害因素的长期作用下所产生的一种以细胞过度增殖为主要特点的新生物，在医学上可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。良性肿瘤对人体健康影响较小，而恶性肿瘤(又称癌症)则严重威胁着人类的健康。根据世界卫生组织和美国癌症协会的最新统计数据，癌症已成为人类死亡的首要病因， 2008年全世界约有1270万新诊断癌症病例和760万癌症死亡病例(约占所有死亡人数的13)，且大约有 70的癌症死亡病例发生在中低收入国家。预计到2030年，癌症年诊断和死亡病例将分别高达2140万和1320万。 0003 天然药物尤其是来源于植物的药物具有化学结构多样。

5、性和生物活性多样性，一直是人类预防和治疗疾病的主要来源。临床上应用的许多药物都直接或间接来源于天然产物，天然产物不仅可以作为药物半合成的前体物，而且可以作为药物化学合成的的模板，为新药设计提供新思路。天然产物已成为发现新药物或先导化合物的主要源泉之一。 0004 开口箭(TupistraChinensis)为百合科(Liliaceae)铃兰族(Convallarieae)开口箭属(Tupistra)植物。主要分布于我国中部和西南部，主产于湖北三峡库区及神龙架林区。开口箭在土家族医药中享有极高声誉,为神农架四大名药之一药用部位为其根状茎。开口箭味甘微苦，性寒，。

6、具有清热解毒、益气活血、散瘀止痛等多种功效，民间用于咽喉肿痛、劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调等症。使用方便,疗效显著,已有数百年的应用历史。临床上，开口箭饮片治疗慢性咽炎效果良好。 0005 开口箭根茎的主要活性成分为甾体皂苷类成分。现代药理实验研究表明开口箭具有较强的抗肿瘤、抗炎、抑菌等活性。现有研究对开口箭化学成分研究仍不够彻底，因而开口箭中甾体类化学成分值得进一步研究和开发利用。发明内容 0006 本发明的目的在于提供一类螺甾类化合物。 0007 本发明的另一目的在于提供螺甾类化合物的应用。 0008 本发明所采取的技术方案是： 0009 螺。

7、甾类化合物，其结构式分别为： 0010化合物1：说明书 1/18 页 4 CN 105859825 A 4 化合物2：化合物3： 0011化合物4： 0012化合物5： 0013化合物6：说明书 2/18 页 5 CN 105859825 A 5 0014化合物7： 0015化合物8： 0016化合物9： 0017 上述螺甾类化合物在制备防治癌症药物中的应用。 0018 进一步的，上述癌症为咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌。 0019 上述螺甾类化合物在制备抗炎药物中的应用。 0020 本发明的有益效果是： 0021 本发明通过长期研究，从开口箭。

8、根茎中分离鉴定了一类新型螺甾类化合物19。通过研究发现该化合物19在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用。该类化合物从植物中提取获得，具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。附图说明 0022 图1为本发明化合物(50 M)对不同肿瘤细胞的抑制作用； 0023 图2为本发明化合物(50 M)对Raw264.7细胞释放炎症介质NO的抑制作用； ctl-：空白对照； ctl+：模型组； *p0.05。具体实施方式 0024 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。 0025 实施例1螺甾类化合物的提取及鉴定 0026 一、螺甾类化合物的提取。

9、0027 取开口箭根茎17kg，用60乙醇加热回流提取4次，每次4小时，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏，将总浸膏用水混悬，用乙酸乙酯等体积萃取4次，除去脂溶性杂质，水层说明书 3/18 页 6 CN 105859825 A 6 经D101大孔树脂柱层析分离，分别以水、 20乙醇， 60乙醇， 80乙醇、 95乙醇进行洗脱，得到5个馏分TA、 TB、 TC、 TD、 TE。取馏分TC(60乙醇洗脱部分)200g，采用硅胶柱色谱、 ODS中低压柱色谱、反相高效液相色谱等分离方法，分离得到本发明化合物1和2。采用同样的分离手段从馏分TD(80乙醇洗脱部分)中分。

10、离得到本发明化合物3-9。通过理化常数和现代波谱学手段(HRESIMS ,1D-NMR ,2D-NMR)鉴定以上9个化合物的结构，化合物1为 spirost-25(27)-en-1,3 ,5 -triol，化合物2为spirost-25(27)-en-1,3 ,4 ,5 ,6 - pentol，化合物3为5 -spirost-25(27)-en-3 -ol-3-O- -D-glucopyranosyl-(14)- -D- glucopyranoside，化合物4为5-spirost-25(27)-en-1,3-diol-3-O-D- glucopyranosyl-(14)- -D-。

11、glucopyranoside，化合物5为(25R)-5 -spirostan-1 ,3 - diol-3-O- -D-glucopyranosyl-(16)- -D-glucopyranoside,化合物6为(25R)-5 - spirostan-1 ,3 -diol-3-O- -D-fructofuranosyl-(26)- -D-glucopyranoside，化合物7为spirost-25(27)-en-1 ,2 ,3 ,5 -tetraol-5-O- -D-glucopyranoside，化合物8为 spirost-25(27)-en-1,2,3,4,5 -pentol-2-。

12、O- -D-xylopyranoside，化合物9为 spirost-25(27)-en-1 ,2 ,3 ,4 ,5 -pentol-2-O- -L-arabinopyranoside。所获得的化合物19的结构以表1所示的结构式为准。 0028 表1本发明9个螺甾类化合物的结构 0029 说明书 4/18 页 7 CN 105859825 A 7 0030 说明书 5/18 页 8 CN 105859825 A 8 0031 0032 二、螺甾类化合物的鉴定 0033 化合物1-9的结构鉴定过程如下： 0034 化合物1的鉴定 0035 spirost-25( 27 )-en-1,3,。

13、5-triol( 化合物1 ):白色无定形粉末，在IR( K Br )中显示出强的多羟基的吸收峰 3300cm - 1 ，对 Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，提示该化合物为螺甾类化合物。 HRESIMS(positive)给出准分子离子峰M+H+m/z447.3112(calcd.forC27H43O5 447.3110)，提示其分子量为446，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C27H42O5。 0036 在1H-NMR(500MHz， pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号 0。

14、.87(3H， s， Me-18)、 1.50(3H,s， Me-19)及1.12(3H,d,J7.0Hz， Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号 4.83(1H， brs)和4.80(1H， brs)。 0037 13C-NMR(126MHz， pyridine-d5)给出27个碳信号，提示该化合物为螺甾皂苷元。其中 109.8为螺甾皂苷C-22特征信号， 144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号，在糖端基碳区未见糖端基碳信号，说明该化合物为甾体皂苷元。比较该化合物与化合物(25R, S)-spirostan-1,3 ,5 -triol的碳谱数据。

15、， A、 B、 C、 D、 E环数据基本一致，仅F环数据有差异，推测可能是该化合物的25位与27位碳形成末端双键的缘故。在HMBC谱中，两个末端双键上的质子信号 4.83(1H， brs)和4.80(1H， brs)与C-24( 29.3)和C-26( 65.4)相关，也证明 25(27)位双键的存在。综合以上信息，化合物1鉴定为spirost-25(27)-en-1,3,5 - triol。通过HSQC、 HMBC和1H-1HCOSY谱可对化合物1的核磁信号进行完全归属，化合物1的 1H-NMR和13C-NMR数据见表2，结构见表1。 0038 化合物2的鉴定 003。

16、9 spirost-25(27)-en-1,3,4,5,6 -pentol(化合物2):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3398cm-1，对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，提示该化合物为螺甾类化合物。 HRESIMS (positive)给出准分子离子峰M+H+m/z479.3018(calcd.forC27H43O7479.3009)，提示其分子量为478，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C27H42O7。说明书 6/18 页 9 CN 105859825 A 9 0040 通过对化合。

17、物2的1H-NMR、 13C-NMR(DEPT)、 HSQC、 HMBC和1H-1HCOSY和NOESY谱的分析可以对其分子中的碳及氢信号进行全面归属。其1H-NMR谱给出三个特征的甲基信号 0.87(3H， s， Me-18)、 1.86(3H,s， Me-19)和1.10(3H,d,J7.0Hz， Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号 4.81(1H， s)和4.78(1H， s)。 13C-NMR(126MHz， pyridine-d5)显示出 27个碳信号，在糖端基碳信号区没有出现糖端基碳信号，说明化合物2是一个甾体皂苷元。其中 109.8为螺甾皂苷C-22。

18、特征信号， 144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号。 0041 在1H-1HCOSY谱中，两个亚甲基质子 2.23(H-2)和2.62(H-2)与连氧次甲基质子 4.19(H-1)和4.85(H-3)相关，而连氧次甲基质子 4.85(H-3)与另一个连氧次甲基质子 4.34(H-4)相关，连氧次甲基质子 4.95(H-6)与两个亚甲基质子 1.55(H-7)和2.07(H-7) 相关。此外，在1H-NMR谱低场区存在一个尖锐单峰质子信号 6.00，由于该质子与C-4、 C-5、 C-6和C-10分别具有HMBC相关，可以将该质子归属为C-5上连接的羟基质子。通过。

19、以上分析，可以确定该化合物含有5个羟基基团，分别连接在C-1、 C-3、 C-4、 C-5和C-6位。 0042 化合物2的相对构型可以通过NOESY谱得以确定。在NOESY谱中， H-4与H-7和H-9 相关， H-2与H-9相关，说明A、 B环是顺式相连，因而C-4和C-5羟基为构型。另外， H-1与Me- 19和H-11相关， H-3与H-2相关， H-6与H-7相关，表明C-1和C-6羟基为构型， C-3羟基为构型。综合以上信息，化合物2鉴定为spirost-25(27)-en-1 ,3 ,4 ,5 ,6 -pentol。化合物 2的1H-NMR和13C-NM。

20、R数据见表2，化合物2的结构见表1。 0043 化合物3的鉴定 0044 5 -spirost-25(27)-en-3 -ol-3-O- -D-glucopyranosyl-(14)- -D- glucopyranoside(化合物3):白色无定形粉末，对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。 HRESIMS(positive)给出准分子离子峰M+H+m/z739.4254(calcd.for C39H63O13739.4269)，提示其分子量为738，结合1H-NMR和13C-NM。

21、R(DEPT)可确定其分子式为 C39H62O13。 0045 在1H-NMR(500MHz， pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号 0.82(3H， s， Me-18)、 0.84(3H,s， Me-19)和1.10(3H,d,J6.9Hz， Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号 4.83(1H， s)和4.79(1H， s)；在糖端基信号区给出两个糖端基氢信号 4.91 (1H,d,J7.8Hz)和5.23(1H,d,J7.9Hz)，提示该化合物为双糖螺甾皂苷。 0046 13C-NMR(126MHz， pyridine-d5)显示出39个碳信。

22、号，其中 109.8为螺甾皂苷C-22特征信号， 144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号。该化合物的碳谱数据与文献报道的5-spirost-25( 27 )-en-3-ol-3-O-D-glucopyranosyl-( 12 )-D- galactopyranoside基本一致，仅糖链部分数据存在差异。在糖端基碳区给出两个糖端基碳信号 103.2和105.3，结合酸水解结果，确定为两分子葡萄糖。通过与化合物3对照，它们糖区碳谱数据基本一致，故可推测该化合物糖链连接为-Glc4-Glc,其二维图谱也证明了上述推测。结合HSQC、 HMBC和1H-1H。

23、COSY谱可对化合物3的核磁信号进行完全归属。综合以上信息，化合物3鉴定为5 -spirost-25(27)-en-3 -ol-3-O- -D-glucopyranosyl-(14)- -D- glucopyranoside。化合物3的1H-NMR和13C-NMR数据见表3，化合物3的结构见表1。 0047 化合物4的鉴定 0048 5 -spirost-25(27)-en-1,3 -diol-3-O- -D-glucopyranosyl-(14)- -D- 说明书 7/18 页 10 CN 105859825 A 10 glucopyranoside(化合物4):白色无定形粉末，对。

24、Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。 HRESIMS(positive)给出准分子离子峰M+H+m/z755.4807(calcd.for C39H63O14755.4218)，提示其分子量为754，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为 C39H62O14。 0049 1H-NMR谱中，高场区出现三个特征的甲基信号，其中两个为单峰，分别位于 0.84 (3H,s,Me-18)和1.26(3H,s,Me-19)，另一个为双峰，位于 1.10(3H,d,。

25、J7.0Hz,Me-21)。较低场区显示两个末端双键上的质子信号 4.82(1H,s)和4.79(1H,s)。在糖端基信号区给出两个糖端基质子信号 5.21(1H,d,J7.9Hz)和4.97(1H,d,J7.8Hz)，提示化合物4为双糖螺甾皂苷。 0050 13C-NMR(126MHz， pyridine-d5)中共有39个碳信号。其中 109.8为螺甾类皂苷骨架上22位碳的特征信号， 144.8和109.1为一对末端双键的特征信号， 105.3与101.3为糖端基碳信号。将该化合物苷元部分碳信号与已知化合物isorhodeasapogenin比较，发现除了F 环及3位。

26、碳信号有较大差别外，其余碳信号基本一致，因此可以推测该化合物苷元为25(27) 位双键结构的isorhodeasapogenin。此外化合物4的3位碳信号较isorhodeasapogenin向低场发生了较大位移，因此可以推断该化合物的3位羟基成苷。通过与已知化合物 isorhodeasapogenin3-O- -D-glucopyranosyl-(14)- -D-glucopyranoside对照，它们糖区碳谱数据基本一致，故推测化合物4的糖链连接顺序为3-O- -D-Glc-(14)- -D-Glc。在HMBC谱中糖端基质子 5.21与内侧糖的C-4( 81.5)相。

27、关,内侧糖端基质子 4.97与苷元C- 3( 75.2)相关，进一步确定该化合物的糖链与化合物isorhodeasapogenin3-O- -D- glucopyranosyl-(14)- -D-glucopyranoside完全相同。综上所述，化合物4鉴定为5 - spirost-25( 27 )-en-1,3-diol-3-O-D-glucopyranosyl-(14 )-D- glucopyranoside。化合物4的1H-NMR和13C-NMR数据见表3，化合物4的结构见表1 0051 化合物5的鉴定 0052 (25R)-5 -spirostan-1,3 -diol-3-O。

28、- -D-glucopyranosyl-(16)- -D- glucopyranoside(化合物5):白色无定形粉末，对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。 HRESIMS(positive)给出准分子离子峰M+H+m/z757.4403(calcd.for C39H65O14757.4374)，提示其分子量为756，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为 C39H64O14。 0053 在IR(KBr)中， 3411cm-1为多羟基的吸收峰，在1000-8。

29、00cm-1之间， 919cm-1(B带)小于899cm-1(C带)，说明化合物25位为R构型97。 0054 在1H-NMR谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个特征的甲基信号，其中两个为单峰，分别位于 0.81(3H,s,Me-18)和1.24(3H,s,Me-19)，另外两个为双峰，位于 0.68(3H,d,J 5.6Hz,Me-27)和1.14(3H,d,J6.9Hz,Me-21)。在糖端基信号区给出两个糖端基质子信号 5.02(1H,d,J7.7Hz)和4.93(1H,d,J7.8Hz)，提示化合物5为双糖螺甾皂苷。由糖端基氢信号的J值可知两个葡萄糖均为构型。 00。

30、55 13C-NMR(126MHz， pyridine-d5)中共有39个碳信号。其中 109.6为螺甾类皂苷骨架上22位碳的特征信号， 105.3与102.4为两个糖端基碳信号。该化合物的碳谱数据与已知化说明书 8/18 页 11 CN 105859825 A 11 合物isorhodeasapogenin3-O- -D-glucopyranosyl-(14)- -D-glucopyranoside十分相似，仅糖区的碳信号有所差别，因此可以推测二者拥有相同的苷元及糖组成，只是糖的连接方式不相同。分析化合物5葡萄糖的碳谱数据，发现一个葡萄糖的6位碳( 70.7)向低场位。

31、移了7.7ppm，因此推测两个葡萄糖连接方式为-Glc-(61)-Glc。在HMBC谱中糖端基质子 5.02与内侧糖的C-6( 70.7)相关,内侧糖端基质子 4.93与苷元C-3( 76.0)相关，进一步证明了两个葡萄糖链接位点的正确性。综合以上信息，化合物5鉴定为(25R)-5 -spirostan-1 ,3 -diol-3-O- -D-glucopyranosyl-(16)- -D-glucopyranoside。化合物5的1H-NMR 和13C-NMR数据见表4，化合物5的结构见表1。 0056 化合物6的鉴定 0057 (25R)-5 -spirostan-1,3 -。

32、diol-3-O- -D-fructofuranosyl-(26)- -D- glucopyranoside(化合物6)：化合物6为白色无定形粉末，对 Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-葡萄糖和D-果糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。 HRESIMS(positive)给出准分子离子峰M+H+m/z 757.4401(calcd.forC39H65O14757.4374)，提示其分子量为756，结合1H-NMR和13C-NMR (DEPT)可确定其分子式为C39H64O14。 0058 在IR(KBr)中， 3391c。

33、m-1为多羟基的吸收峰，在1000-800cm-1之间， 918cm-1(B带)小于899cm-1(C带)，说明化合物25位为R构型。 0059 在1H-NMR谱中，高场区给出甾体皂苷元上四个特征的甲基信号，其中两个为单峰，分别位于 0.81(3H,s,Me-18)和1.23(3H,s,Me-19)，另外两个为双峰，位于 0.69(3H,d,J 5.6Hz,Me-27)和1.14(3H,d,J7.0Hz,Me-21)。在糖端基信号区只给出一个糖端基质子信号 4.89(1H,d,J7.8Hz)。 0060 13C-NMR(126MHz， pyridine-d5)中共有39个碳。

34、信号。其中 109.6为螺甾类皂苷骨架上22位碳的特征信号。在糖端基信号区给出两个糖端基碳信号 106.2和102.1，提示化合物 6为双糖螺甾皂苷。结合DEPT谱可知106.2处为季碳，提示该化合物含有一分子酮糖，与酸水解检出D-果糖(六碳酮糖)一致。化合物6的苷元部分及葡萄糖部分的碳信号与化合物5基本一致，提示化合物6也是isorhodeasapogenin的3位成苷的螺甾皂苷。在HMBC谱中，葡萄糖6 位质子信号 4.85(1H,d,J9.1Hz)和4.55(1H,m)与果糖2位碳信号( 106.2)相关，葡萄糖1 位质子信号 4.89(1H,d,J7.8Hz。

35、)与苷元3位碳信号( 75.6)相关，结合文献，确定该化合物的糖链链接为3-O-Glc-(62)-Fru。综合以上信息，化合物6鉴定为(25R )-5- spirostan-1 ,3 -diol-3-O- -D-fructofuranosyl-(26)- -D-glucopyranoside。化合物6的1H-NMR和13C-NMR数据见表4，化合物6的结构见表1。 0061 化合物7的鉴定 0062 spirost-25(27)-en-1 ,2 ,3 ,5 -tetraol-5-O- -D-glucopyranoside(化合物 7):化合物7为白色无定形粉末，红外谱图中显示强。

36、的多羟基吸收峰3424cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出 D-葡萄糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。 HRESIMS(positive)给出准分子离子峰M+ H+m/z625.3630(calcd.forC33H53O11625.3588)，提示其分子量为624，结合1H-NMR和13C- NMR(DEPT)可确定其分子式为C33H52O11。 0063 在1H-NMR(500MHz， pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号 0.83(3H，说明书 9/18 页 12 CN 105859。

37、825 A 12 s， Me-18)、 1.62(3H,s， Me-19)和1.08(3H,d,J7.0Hz， Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号 4.83(1H， s)和4.79(1H， s)；在糖端基信号区给出一个糖端基氢信号 5.29 (1H,d,J7.7Hz)，结合糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，提示该化合物为含有一个 -D-葡萄糖单糖螺甾皂苷。 0064 13C-NMR(126MHz， pyridine-d5)显示出33个碳信号，其中 109.8为螺甾皂苷C-22特征信号， 144.8和109.1为25和27位末端双键的特征信号， 97.7为糖端基碳。

38、信号。经与文献对照 102 ，该化合物与spirost-25( 27 )-en-1,2,3,5-tetraol-5-O-D- galactopyranoside苷元部分的碳谱数据基本一致，仅糖区信号不同，提示化合物7的苷元为spirost-25(27)-en-1,2,3,5 -tetraol。在HMBC谱中，葡萄糖端基质子信号 5.29 (1H,d,J7.7Hz)与苷元C-5( 83.4)相关，从而确定葡萄糖连接在化合物7的C-5位。通过 1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、 HSQC、 HMBC、1H-1HCOSY和NOESY谱并结合文献可以对该化合物的碳及氢信号。

39、进行全面归属。综合以上信息，化合物7鉴定为spirost-25(27)-en-1 ,2 ,3 ,5 - tetraol-5-O- -D-glucopyranoside。化合物7的1H-NM和13C-NMR数据见表5，化合物7的结构见表1。 0065 化合物8的鉴定 0066 spirost-25(27)-en-1 ,2 ,3 ,4 ,5 -pentol-2-O- -D-xylopyranoside(化合物 8):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰3364cm -1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出D-木糖，。

40、提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。 HRESIMS(positive)给出准分子离子峰M+H+m/z 611.3437(calcd.forC32H51O11611.3431)，提示其分子量为610，结合1H-NMR和13C-NMR (DEPT)可确定其分子式为C32H50O11。 0067 在1H-NMR(500MHz， pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号 0.84(3H， s， Me-18)、 1.59(3H,s， Me-19)和1.09(3H,d,J7.0Hz， Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号 4.82(1H， s)和4.79(1H，。

41、 s)；在糖端基信号区给出一个糖端基氢信号 5.15 (1H,d,J7.5Hz)，结合糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，提示该化合物为含有一个 -D-木糖的单糖螺甾皂苷。 0068 13C-NMR(126MHz， pyridine-d5)显示出32个碳信号，其中 109.8为螺甾皂苷C-22特征信号， 144.7和109.1为25和27位末端双键的特征信号， 103.5为糖端基碳信号。另将该化合物苷元部分碳谱数据与已知化合物25(27)-pentrogenin比较，发现除了2位碳信号向低场位移6.6ppm外，其余信号基本一致，因此推测该化合物为25(27)-pentro。

42、genin的2位苷化后形成的甾体皂苷。在HMBC谱中，木糖端基质子信号 5.15(1H,d,J7.5Hz)与苷元C-2( 74.4)相关，从而确定木糖连接在化合物T38的C-2位。通过1H-NMR、 13C-NMR(DEPT)、 HSQC、 HMBC和1H-1HCOSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物8 鉴定为spirost-25(27)-en-1 ,2 ,3 ,4 ,5 -pentol-2-O- -D-xylopyranoside。化合物8 的1H-NMR和13C-NMR数据见表6，化合物8的结构见表1。 0069 化合物9的鉴定 0070 s。

43、pirost-25(27)-en-1 ,2 ,3 ,4 ,5 -pentol-2-O- -L-arabinopyranoside(化合物9):白色无定形粉末，红外谱图中显示强的多羟基吸收峰 3422cm-1，对Anisaldehyde(A试剂)反应显黄色，对Ehrlish(E试剂)不显色，酸水解检出L-阿说明书 10/18 页 13 CN 105859825 A 13 拉伯糖，提示该化合物为螺甾皂苷类化合物。 HRESIMS(positive)给出准分子离子峰M+H+ m/z611.3412(calcd.forC32H51O11611.3431)，提示其分子量为610，结合1H。

44、-NMR和13C-NMR (DEPT)可确定其分子式为C32H50O11。 0071 在1H-NMR(500MHz， pyridine-d5)谱中，高场区给出三个特征的甲基信号 0.83(3H， s， Me-18)、 1.58(3H,s， Me-19)和1.09(3H,d,J7.0Hz， Me-21)；在低场区给出两个末端双键上的质子信号 4.81(1H， s)和4.78(1H， s)；在糖端基信号区给出一个糖端基氢信号 5.13 (1H,d,J7.0Hz)，结合糖端基氢信号的J值与酸水解分析结果，提示该化合物为含有一个 -L-阿拉伯糖的单糖螺甾皂苷。 0072 13C-NMR(1。

45、26MHz， pyridine-d5)显示出32个碳信号，其中 109.8为螺甾皂苷C-22特征信号， 144.7和109.1为25和27位末端双键的特征信号， 103.4为糖端基碳信号。另将该化合物的碳谱数据与化合物8比较，二者苷元部分数据基本一致，仅糖区信号有差异，推测该化合物同样也为25(27)-pentrogenin的2位苷化后形成的甾体皂苷，只是2位连接的是阿拉伯糖而不是木糖。在HMBC谱中，阿拉伯糖端基质子信号 5.13(1H,d,J7.0Hz)与苷元C-2 ( 74.0)相关，从而确定阿拉伯糖连接在化合物9的C-2位。通过1H-NMR、 13C-NMR。

46、(DEPT)、 HSQC、 HMBC和1H-1HCOSY谱可以对该化合物的碳及氢信号进行全面归属。综合以上信息，化合物9鉴定为spirost-25(27)-en-1 ,2 ,3 ,4 ,5 -pentol-2-O- -L-arabinopyranoside。化合物9的1H-NMR和13C-NMR数据见表6，化合物9的结构见表1。 0073 表2本发明化合物1和化合物2的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5) 说明书 11/18 页 14 CN 105859825 A 14 0074 0075 表3本发明化合物3和化合物4的1H-NMR和13C-NMR谱数据(py。

47、ridine-d5) 说明书 12/18 页 15 CN 105859825 A 15 0076 0077 表4本发明化合物5和化合物6的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5) 说明书 13/18 页 16 CN 105859825 A 16 0078 0079 表5本发明化合物7的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5) 说明书 14/18 页 17 CN 105859825 A 17 0080 0081 表6本发明化合物8和化合物9的1H-NMR和13C-NMR谱数据(pyridine-d5) 0082 说明书 15/18 页 18 CN 1058。

48、59825 A 18 0083 0084 实施例2抑瘤试验： 0085 本发明化合物对人体7个瘤株的体外抑瘤活性实验，这7个瘤株包括FaDu(人咽鳞癌细胞)、 Detroit562(人咽头癌胸水转移细胞)， CNE-1(高分化人鼻咽鳞癌细胞),CNE-2 (低分化人鼻咽鳞癌细胞),HepG2(人肝癌细胞),K562(人慢性骨髓性白血病细胞),SPC-A-1 (人肺腺癌细胞)七种人体肿瘤细胞的细胞毒活性以及对正常细胞L-929(小鼠成纤维细胞) 的毒性。抗癌药cis-dichlorodiamineplatinum(II)(顺铂)作为阳性对照。 0086 抑制肿瘤细胞增殖(MTT法) 008。

49、7 将肿瘤细胞接种于96孔板中，培养24h后加入待测试样品，再培养48h后用MTT法测定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。 0088 细胞增殖抑制率(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)(阴性对照组 OD值平均值-空白对照组OD值平均值)100 说明书 16/18 页 19 CN 105859825 A 19 0089 实验结果见表7和图1。 0090 表7:本发明化合物对不同肿瘤细胞的抑制作用 0091 0092 从表7和图1的实验数据可知，化合物19对不同的肿瘤细胞均具有较好的抑制作用，尤其是化合物1、 36对不同的肿瘤细胞表现出很好的抑制作用(见表7)，而其余化合物在浓度为50 M时对不同的肿瘤细胞也有不同程度的抑制作用(见图1)。 0093 实施例3抗炎试验： 0094 本发明化合物对体外抗炎活性实验，采用LPS(脂多糖)诱导的Raw264.7(小鼠巨噬细胞)细胞，。

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