三个新异戊二烯环己醇类化合物的制备方法及其抗流感用途.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510057980.3 (22)申请日 2015.02.03 C07D 493/04(2006.01) C07D 493/10(2006.01) A61P 31/16(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路 5 号 申请人 中国大洋矿产资源研究开发协会 (72)发明人 林文翰 周德敏 赵阳 司龙龙 刘东 (54) 发明名称 三个新异戊二烯环己醇类化合物的制备方法 及其抗流感用途 (57) 摘要 本发明公开了三。

2、个新异戊二烯环己醇类化合 物及其制备方法， 本发明还披露了其抗流感用途。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图8页 CN 105985350 A 2016.10.05 CN 105985350 A 1/1 页 2 1.一种式 I 式 III 化合物 2.权利要求 1 所述的化合物的制备方法， 包括下述步骤 ： 1)以海洋真菌Truncatella angustata XSB-01-43为菌种， 利用固体发酵培养， 获得含 上述化合物的发酵物 ； 2) 将发酵物通过硅胶、 凝胶、 ODS 等色谱手段分离与纯化， 在同。

3、一发酵物中制备上述化 合物。 3.式I式III所示化合物， 其药学上可接受的盐或它们的混合物的用途， 用于制备药 物， 所述药物用于治疗流感。 权 利 要 求 书 CN 105985350 A 2 1/5 页 3 三个新异戊二烯环己醇类化合物的制备方法及其抗流感用 途 技术领域 0001 本发明属于药学领域， 本发明介绍了三个新异戊二烯环己醇类化合物及其制备方 法， 本发明还揭示了所述化合物的抗流感用途。 背景技术 0002 流行性感冒 ( 流感 ) 是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病， 传染性强， 发 病率高， 容易引起爆发流行或大流行。根据其内部核蛋白 (NP) 和基质蛋白 (M) 的。

4、抗原性 不同， 流感病毒可分为 A 型、 B 型和 C 型。A 型 ( 又称甲型 ) 流感病毒大规模流行可引起极 高的发病率和死亡率， 严重威胁着人类的健康 (W.H.O.2003 ； Coleman 2007)。A 型流感病 毒在二十世纪主要引起了三次大型流感， 即 1918 年的 H1N1， 1957 年的 H2N2 以及 1968 年 的 H3N2， 共造成约 5000 万人死亡 (Kilbourne 2006 ； Taubenberger， Hultin et al.2007)。 2009年甲型流感也是由H1N1流感病毒引起(Dawood， Jain et al.2009 ； Zimm。

5、er and Burke 2009)， 其传播之迅速， 引起了世界的关注。据世界卫生组织统计， 每年北半球有超过一亿 人感染流感， 并且有 30-50 万人死于流感， 造成的经济损失超过百亿美元。目前， 临床上应 用的抗流感药物的主要作用靶点包括血凝素、 RNA 聚合酶、 M2 离子通道、 核蛋白以及神经氨 酸酶， 如 RNA 聚合酶抑制剂 T-705， M2 离子通道阻断剂金刚烷胺以及神经氨酸酶抑制剂扎 那米韦、 奥斯他韦、 帕拉米韦以及达菲等。由于流感病毒表面抗原能经常不断地发生变异， 使本来有效的流感病毒疫苗很快失效。美国疾病预防控制中心抽样调查发现， 2008/2009 年的 H3N2。

6、 毒株和 2009 年大流行 H1N1 病毒中， 100的毒株对金刚烷类药物都具有耐药 性 ； 99.6的季节性H1N1流感病毒对达菲具有耐药性(http ： /www.cde.gov/flu/weekly/ weeklychjves2008-2009/weekly35.htm)。我国人口基数大、 密度高， 流感的潜在威胁性极 高。因此， 新型多靶点抗流感病毒药物的研发， 对于保障人民生命安全、 提高国民生活质量 具有重要的意义。 0003 专利发明者通过前期研究， 从一株海洋真菌 Truncatella angustata XSB-01-43 发酵物中制备并鉴定了三个新化合物(式I式III)。

7、， 并通过抗流感病毒活性筛选， 发现其 具有显著的抗 H1N1 活性。经过初步机制研究， 发现该类化合物能在 H1N1 病毒整个复制周 期的末期， 通过阻碍病毒的组装和释放发挥抗病毒功效。具有进一步研究开发的潜力。 发明内容 0004 本发明的目的之一在于提供三个新异戊二烯环己醇类化合物。 0005 本发明的目的之二在于提供该类化合物的制备方法。 0006 本发明的目的之三在于揭示该类化合物在治疗流感方面的用途。 0007 本发明第一方面提供式 I 式 III 所示化合物 ： 0008 说 明 书 CN 105985350 A 3 2/5 页 4 0009 0010 本发明第二方面提供上述化合。

8、物的制备方法， 包括如下步骤 ： 0011 1) 利用深海真菌 Truncatella angustata XSB-01-43 作为工程菌种， 经过固体发 酵培养， 获得含上述化合物的发酵物 ； 0012 2) 将发酵物通过硅胶、 凝胶、 HPLC 等色谱手段分离与纯化， 从菌株发酵物中制备 上述化合物 ； 0013 本发明第三方面本通过如下方法评价了上述式 I 化合物抑制流感病毒进入细胞 的生物活性 ： 0014 1. 细胞病变 (CPE) 抑制试验。 0015 流感病毒感染细胞后会导致细胞病变， 使得细胞活力降低。如果药物能够抑制流 说 明 书 CN 105985350 A 4 3/5 页。

9、 5 感病毒复制， 则会降低细胞病变数量， 提高细胞活力。具体来说 ： 0016 1) 将犬肾上皮细胞 (MDCK) 以 1 3 的比例传代到白色的 96 孔板中， 在 37细胞 培养箱中用含 10 FBS 的 DMEM 培养基培养 24h。 0017 2) 将流感病毒 (A/WSN/33(H1N1)， 感染复数 (MO1) 1) 与一定浓度的待检化合物 加入到 100L 含有 2g/mL TPCK 处理的胰酶、 1 FBS 的 DMEM 中， 充分混匀。化合物的阴 性对照为 1 DMSO( 稀释化合物所用的溶剂 )。同时设立一组只加各化合物不加病毒实验 组， 用来检测化合物对细胞活力的影响。。

10、 0018 3) 将 96 孔板中的 MDCK 细胞的培养基吸出， 将混合有病毒和化合物的培养基加入 到 MDCK 细胞中， 37细胞培养箱中培养 48h。每个样品三个复孔。 0019 4) 用 CellTiter-Glo 荧光细胞活性检测试剂盒 (Cat.G7571， Promega) 检测细 胞活力。首先将细胞和 CellTiter-Glo 检测试剂放于室温环境， 待其温度平衡至室温， 将 100L/ 孔的 CellTiter-Glo 检测试剂加入到细胞的培养上清中， 震动 2min 后， 避光静置 10min。用仪器 Tecan Infinite M2000PROTM 检测细胞活力。 0。

11、020 5)EC50 的计算方法 ： 首先对化合物进行浓度系列稀释， 然后利用上述方法测定 出细胞活力。化合物对细胞病变的保护率 100(1-(Test compound-Median Virus1)/ (Median Cells-Median Virus2).其中Test compound表示只加待检化合物不加病毒组的 细胞活力 ； Median Virus1 表示加了待检化合物和病毒组的细胞活力 ； Median Cells 表示 只加入 1 DMSO 组的细胞活力 ； Median Virus2 表示加入 1 DMSO 和病毒组的细胞活力。 将化合物浓度和相应的保护率输入到软件Prism。

12、， 即可计算EC50。 此方法已被广泛应用于抗 病毒药物筛选领域 (Noah， Severson et al.2007)。 0021 6)CC50的计算方法 ： CellTiter-Glo 也可以用来检测化合物对细胞的毒性。首先 对化合物进行浓度系列稀释， 然后将其加入到细胞中， 方法同 2)-4)， 但不加入病毒。培养 48h 后， 测定细胞活力。然后将对照组细胞活力 (1 DMSO) 定义为 100， 将其他各化合物 组细胞活力标准化， 除以对照组 1 DMSO 的细胞活力， 再乘以 100。将化合物的浓度和相 应的标准化的细胞活力输入到软件 Prism， 即可计算出 CC50。 0022。

13、 2. 加药时间点实验。 0023 用以分析化合物作用于病毒感染细胞的哪一阶段。具体步骤 ： 0024 1)将MDCK细胞传代到六孔板中， 在37细胞培养箱中用含10FBS的DMEM培养 基培养 24h。 0025 2) 将 A/WSN/33(H1N1) 病毒 (MOI 1) 稀释到不含血清的 DMEM 中， 感染 MDCK 细 胞。 0026 3) 流感病毒从吸附到子代病毒粒子释放， 其复制周期约为 6-8h。故在以下时间段 将药物加入到细胞培养基中 ： 0-10、 0-2、 2-5、 5-8 或 8-10h。 0027 4) 感染 10h 后， 用冰预冷的 PBS 清洗细胞一次， 用 20。

14、0l/ 孔的 PIPA 裂解液裂解 细胞。用细胞刮将细胞刮下， 吸入 1.5mL EP 管中， 置于冰上 15min。以 12000rpm 4离心 10min， 将上清液转移到另一个 1.5mL EP 管中。 0028 5) 吸取 30L 样品与等体积的 2 蛋白上样缓冲液混合， 100煮样 10min。 0029 6) 将煮好的样品各 20L 加入到 12的蛋白质凝胶加样孔中， 进行 SDS-PAGE 电 泳。 说 明 书 CN 105985350 A 5 4/5 页 6 0030 7)用免疫印迹法(Western blotting)检测流感病毒的NP蛋白的表达水平(以此 来检测病毒在细胞内。

15、的复制情况 ) ； 同时以细胞蛋白 GAPDH 作为细胞内参 ( 也可用于验证 药物对细胞的毒性 ) 附图说明 0031 图 1 ： 式 I 化合物的 1H-NMR 谱 ； 0032 图 2 ： 式 I 化合物的 APT 谱 ； 0033 图 3 ： 式 I 化合物的高分辨质谱 ； 0034 图 4 ： 式 I 化合物的 X-ray 单晶衍射晶体结构式 ； 0035 图 5 ： 式 II 化合物的 1H-NMR 谱 ； 0036 图 6 ： 式 II 化合物的 APT 谱 ； 0037 图 7 ： 式 II 化合物的高分辨质谱 ； 0038 图 8 ： 式 III 的 1H-NMR 谱 ； 0。

16、039 图 9 ： 式 III 的 APT 谱 ； 0040 图 10 ： 式 I 化合物加药时间点实验图 ； 具体实施方案 ： 0041 根据本发明所公开的技术内容， 本领域技术人员将更好的理解本专利实质， 下述 实施方案仅作示例。 0042 实例 1 ： 真菌 Truncatella angustata XSB-01-43 的固体发酵培养 0043 1. 菌株背景 0044 Truncatella angustata XSB-01-43 分离自永兴岛海域 Amphimedon 属海绵， 菌种 保藏于北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室海洋天然产物研究组。 0045 2. 固体培养基的制。

17、备 ： 0046 将 100mL 人工海水与 100g 大米加入 500mL 三角瓶中， 静置 12h， 后于 121高压湿 热灭菌 30min， 放凉待用。 0047 3. 菌株发酵 ： 0048 在 PDA( 马铃薯、 葡萄糖、 琼脂 ) 培养皿上挑取长有新鲜 T.angustata 的琼脂片 (1 2cm2)， 接种于大米培养基上， 25下避光恒温培养 30d， 得到发酵产物。 0049 实例 2 ： 式 I 式 III 的制备 0050 发酵产物捣碎后用乙酸乙酯超声萃取 3 次， 每次 1.5h， 减压浓缩得粗浸膏 (19.0g)。浸膏用等比例硅胶 (160 200 目 ) 拌样， 利。

18、用减压硅胶柱色谱以石油醚 / 乙酸 乙酯为流动相梯度洗脱。硅胶柱色谱石油醚 / 乙酸乙酯 (20 1， v/v) 洗脱组分 (4.8g) 用 ODS 柱色谱以甲醇 / 水为流动相 (40， v/v) 等梯度洗脱， 分成 5 个洗脱组分。组分 5(1.0g) 半制备高效液相色谱以 40 80甲醇 / 水为流动相梯度洗脱， 纯化得到式 I 化 合物 (10.3mg)、 式 II 化合物 (6.4mg) 和式 III 化合物 (2.3mg)。 0051 式 I 式 III 化合物的波谱见附图说明图 1 图 10。 0052 实例 3 ： 式 I 式 III 化合物的抗流感病毒活性研究 ： 0053 。

19、1. 式 I 式 III 化合物能够有效抑制流感病毒的复制 说 明 书 CN 105985350 A 6 5/5 页 7 0054 通过 CPE 抑制试验和噬斑抑制实验证明化合物对流感病毒有着明显的抑制作用， 强于阳性药物达菲。 CPE抑制试验表明式I式III对流感病毒的EC50分别为分别8.8M， 55.0M， 68.5M， 阳性药物达菲 ( 磷酸奥司他韦， OSV-P) 的 EC50为 46.5M， 利巴韦林 (RBV) 的 EC50为 42.7M( 见表 1)。而式 I 式 III 化合物在 MDCK、 HepG2 以及 Hela 细胞 中的 CC50均大于 100M， 说明式 I 式 。

20、III 化合物的细胞毒性很小。 0055 表 1. 式 I 式 III 化合物抑制流感病毒 (WSN) 的活性及其细胞毒性分析。 0056 式 I 化合物式 II 化合物式 III 化合物OSV-PRBV EC50(M)8.855.068.546.542.7 0057 CC50： 半数细胞毒性浓度 ； EC 50： 半数有效浓度， 即抑制一半细胞病变的化合物浓 度。 0058 2. 化合物 1 能够抑制流感病毒进入细胞和细胞内的复制 0059 通过上述加药时间点实验可以初步断定， 式 I 化合物作用于病毒进入细胞过程。 ( 见图 10) 0060 结果显示， 在全程给药 (0-10h) 以及 。

21、5-8h 加药能够有效地抑制流感病毒的复制。 说明药物在病毒感染后 5-8h 内发挥抑制作用。实验表明式 I 化合物作用于病毒在细胞内 组装和释放阶段。 说 明 书 CN 105985350 A 7 1/8 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 105985350 A 8 2/8 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 105985350 A 9 3/8 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 105985350 A 10 4/8 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 105985350 A 11 5/8 页 12 图 6 说 明 书 附 图 CN 105985350 A 12 6/8 页 13 图 7 说 明 书 附 图 CN 105985350 A 13 7/8 页 14 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 105985350 A 14 8/8 页 15 图 10 说 明 书 附 图 CN 105985350 A 15 。