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1、(10)申请公布号 CN 102757993 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757993 A *CN102757993A* (21)申请号 201110109483.5 (22)申请日 2011.04.28 C12P 21/00(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 同济大学 地址 200092 上海市杨浦区四平路 1239 号 (72)发明人 李平 李延飞 张晨璐 周丛照 (74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 31225 代理人 林君如。
2、 (54) 发明名称 一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶 体的方法， 属于微生物工程和生物防治领域， 借助 紫外线 UVC 进行诱变， 分离纯化苏云金芽孢杆菌 Bacillusthuringiensis 菌株， 经活化、 种子培养 后接入发酵培养基， 进行饥饿培养， 发酵液经过高 速冷冻离心， 用生理盐水洗涤、 稳定， 再经无菌水 反复洗涤、 离心， 分离出纯度达到 99以上的伴 孢晶体。与现有技术相比， 本发明操作更简便、 周 期短、 成本也相对较低， 此方法提取的伴孢晶体纯 度达到 99以上， 本发明分离纯化的伴孢晶体单 一性强， 。
3、形态均一， 便于对伴孢晶体毒力蛋白杀虫 机理的研究。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ： (1) 活化培养 ： 将精制的苏云金芽孢杆菌接种在斜面培养基上， 在 28 32的温度下 斜面培养 24 48 小时， 作为活化种子 ； (2)种子培养 ： 将活化种子接种在液体种子培养基上， 控制温度为2832， 在120 200rpm 转速下， 培养 24 。
4、36h， 作为种子液 ； (3) 发酵培养 ： 将种子液按照 1 5v/v的接种量接入发酵培养基， 控制温度为 28 32， 在 120 200rpm 转速下， 培养 3 5 天， 得到饥饿培养后的菌株发酵液 ； (4) 伴孢晶体分离纯化 ： 饥饿培养后的菌株发酵液分装于离心管中， 4， 转速为 40006000rpm下冷冻离心1530min， 将得到的沉淀用0.10.5wt的生理盐水洗涤， 然后在 4， 4000 6000rpm 下冷冻离心 15 30min， 再用无菌水洗涤， 反复 3 5 次后即 得到苏云金芽孢杆菌伴孢晶体。 2. 根据权利要求 1 所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的。
5、方法， 其特征在于， 所 述的精制的苏云金芽孢杆菌采用以下步骤制备 ： (1) 菌种活化 ： 将普通的苏云金芽孢杆菌接种到斜面培养基上， 在 28 32的温度下 斜面培养 12 48h， 作为活化菌种 ； (2) 诱变处理 ： 利用无菌水将活化菌种稀释 10-6 10-12倍， 转接入平板培养基上， 控制 紫外线装置与活化菌种的距离为3050cm， 对该菌种的正面照射35min， 反复38次， 最后筛选出所需的精制的苏云金芽孢杆菌即可。 3.根据权利要求1或2所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法， 其特征在于， 所述的斜面培养基包括以下组分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 10g/L、 酵母浸膏。
6、 5g/L、 氯化钠 10g/ L、 琼脂 15 20g/L， pH 为 7.2。 4. 根据权利要求 1 所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法， 其特征在于， 所 述的液体种子培养基包括以下组分及含量 ： 胰蛋白胨 5.0g/L、 酵母膏 5.0g/L、 葡萄糖 1.0g/ L、 磷酸氢二钠 0.8g/L， pH 为 7.2。 5. 根据权利要求 1 所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法， 其特征在于， 所 述的发酵培养基包括以下组分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 5g/L、 酵母浸膏 2.5g/L、 氯化钠 5g/L， pH 为 7.2。 6. 根据权利要求 2 所述的一种制备苏云金。
7、芽孢杆菌伴孢晶体的方法， 其特征在于， 所 述的平板培养基包括以下组分及含量 ： 胰蛋白胨 10g/L、 酵母膏 5.0g/L， 氯化钠 10g/L、 琼脂 15g/L， pH 为 7.2。 7. 根据权利要求 1 所述的一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法， 其特征在于， 所 述的生理盐水为市售的 Triton-X100 生理盐水。 权 利 要 求 书 CN 102757993 A 2 1/4 页 3 一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物工程及生物防治领域， 尤其是涉及一种制备苏云金芽孢杆菌伴 孢晶体的方法。 背景技术 0002 苏云金芽孢杆菌 (Bac。
8、illus thuringiensis， Bt) 是一种革兰氏阳性芽孢杆菌， 其 菌体为短杆状、 有鞭毛。当菌体营养生长到一定阶段时， 菌体的一端会形成芽孢， 另一端形 成近菱状的蛋白质晶体称之为伴孢晶体。菌体破裂后可释放出芽孢和伴孢晶体， 伴孢晶体 ( 原毒素 ) 对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性。 0003 苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白是目前世界上研究最多、 产量最大、 应用范围最 广的微生物杀虫剂， 具有专一性强、 对人畜无害、 防治效果好、 易生物降解及无残毒等优点。 人工制备时， 菌种干粉需要经过活化、 种子培养、 发酵培养等步骤产生大量的伴孢晶体。伴 孢晶体的分离纯化方法种类。
9、比较多， 纯化得到的晶体纯度不一， 本发明采用高速冷冻离心 法分离纯化。 发明内容 0004 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作更简便、 周 期短， 伴孢晶体单一性强、 形态均一的制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法。 0005 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现 ： 0006 一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ： 0007 (1) 活化培养 ： 将苏云金芽孢杆菌接种在斜面培养基上， 控制温度为 28 32斜 面培养 24 48 小时， 作为活化种子 ； 0008 (2) 种子培养 ： 将活化种子接种在液体种子培养基上， 控制温。
10、度为 28 32， 在 120 200rpm 转速下， 培养 24 36h， 作为种子液 ； 0009 (3) 发酵培养 ： 将种子液按照 1 5v/v的接种量接入发酵培养基， 控制温度为 28 32， 在 120 200rpm 转速下， 培养 3 5 天， 得到饥饿培养后的菌株发酵液 ； 0010 (4) 伴孢晶体分离纯化 ： 饥饿培养后的菌株发酵液分装于离心管中， 4， 转速为 40006000rpm下冷冻离心1530min， 将得到的沉淀用0.10.5wt的生理盐水洗涤， 然后在 4， 4000 6000rpm 下冷冻离心 15 30min， 再用无菌水洗涤， 反复 3 5 次后即 得到。
11、苏云金芽孢杆菌伴孢晶体。 0011 所述的伴孢晶体主要为菱形。 0012 所述的苏云金芽孢杆菌采用以下步骤制备 ： 0013 (1) 菌种活化 ： 将普通的苏云金芽孢杆菌接种到斜面培养基上， 控制温度为 28 32斜面培养 12 48h， 作为活化菌种 ； 0014 (2) 诱变处理 ： 利用无菌水将活化菌种稀释 10-6 10-12倍， 转接入平板培养基上， 控制紫外线装置与活化菌种的距离为 30 50cm， 对该菌种的正面照射 3 5min， 反复 3 说 明 书 CN 102757993 A 3 2/4 页 4 8 次， 最后筛选出所需要的苏云金芽孢杆菌即可。 0015 所需要的苏云金芽。
12、孢杆菌的菌株形态特征 ： 营养菌体呈杆状， 钝圆， 菌体有鞭毛， 芽孢呈椭圆形， 端生。 0016 所述的斜面培养基包括以下组分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 10g/L、 酵母浸膏 5g/L、 氯 化钠 10g/L、 琼脂 15 20g/L， pH 为 7.2。 0017 所述的液体种子培养基包括以下组分及含量 ： 胰蛋白胨 5.0g/L、 酵母膏 5.0g/L、 葡萄糖 1.0g/L、 磷酸氢二钠 0.8g/L， pH 为 7.2。 0018 所述的发酵培养基包括以下组分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 5g/L、 酵母浸膏 2.5g/L、 氯化钠 5g/L， pH 为 7.2。 0019 所述的平板培。
13、养基包括以下组分及含量 ： 胰蛋白胨 10g/L、 酵母膏 5.0g/L， 氯化钠 10g/L、 琼脂 15g/L， pH 为 7.2。 0020 所述的生理盐水为市售的 Triton-X100 生理盐水。 0021 与现有技术相比， 本发明在生物防治等领域提供了一个新的产有效杀虫蛋白的菌 株， 操作更简便、 周期短、 成本也相对较低， 此方法提取的伴孢晶体纯度达到 99以上， 本发 明分离纯化的伴孢晶体单一性强， 形态均一， 便于对伴孢晶体毒力蛋白杀虫机理的研究。 附图说明 0022 图 1 为苏云金芽孢杆菌 BtTJLZ1109 的 SEM 图 ； 0023 图 2 为 2m 级尺度下的 。
14、Bt TJLZ1109 伴孢晶体及菌体 SEM 图 ； 0024 图 3 为 1m 级尺度下的 Bt TJLZ1109 伴孢晶体 SEM 图 ； 0025 图 4 为 0.2m 级尺度下的 Bt TJLZ1109 伴孢晶体 SEM 图。 具体实施方式 0026 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。 0027 实施例 1 0028 在紫外杀菌后的超净台中， 用接种环挑取本实验室保藏的母株， 接种到斜面培养 基上， 30下活化培养 48 小时。 0029 用移液管向活化后的菌株上注入 1mL 无菌水， 振荡后移液枪吸取一定菌液， 注入 试管中， 无菌水稀释 10-10倍。均匀滴加到事先已。
15、灭菌处理好的平板培养基上， 无菌涂布棒 均匀涂布。涂布后将培养基置于距紫外灯 40cm 处正面照射， 反复照射 3 次， 每次 5min。 0030 紫外光处理后， 用接种环依次挑取单菌落， 分别 “之” 字形接种到斜面培养基上， 30下培养 48h。挑取单菌落扫描电镜镜检观察。结果见图 1 所示， 苏云金芽孢杆菌的菌株 形态特征 ： 营养菌体呈杆状， 钝圆， 菌体有鞭毛， 芽孢呈椭圆形， 端生。 0031 实施例 2 0032 用接种环挑取 Bt TJLZ1109 菌株， 接种在斜面培养基上， 30下活化培养 24h。接 种环挑取活化种子接种入液体种子培养基， 30， 130rpm 转速下摇。
16、床培养 24h。用移液枪将 种子培养液以 1的比例接入到发酵培养基中， 30， 130rpm 摇床培养 3 天。 0033 将发酵培养液分装到 50mL 离心管中， 4500rpm， 4冷冻离心 20min。弃去上清液， 0.1 Triton-X100 的生理盐水洗涤沉淀物， 4500rpm， 4再次冷冻离心 20min。弃去上清 说 明 书 CN 102757993 A 4 3/4 页 5 液， 用无菌水洗涤沉淀， 再次于 4500rpm， 4冷冻离心 20min。无菌水洗涤沉淀， 冷冻离心反 复 3 次。最终沉淀用无菌水制成菌悬液， 伴孢晶体主要为菱形， 扫描电镜不同倍数下镜检观 察。结果。
17、见 2、 3、 4 图所示。 0034 实施例 3 0035 一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法， 该方法包括以下步骤 ： 0036 (1) 活化培养 ： 将苏云金芽孢杆菌接种在斜面培养基上， 控制温度为 28斜面培 养 48 小时， 作为活化种子， 使用的斜面培养基包括以下组分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 10g/L、 酵母浸膏 5g/L、 氯化钠 10g/L、 琼脂 15g/L， pH 为 7.2 ； 0037 (2) 种子培养 ： 将活化种子接种在液体种子培养基上， 控制温度为 28， 在 120rpm 转速下， 培养 36h， 作为种子液， 使用的液体种子培养基包括以下组分及含量 ： 胰。
18、蛋白胨 5.0g/L、 酵母膏 5.0g/L、 葡萄糖 1.0g/L、 磷酸氢二钠 0.8g/L， pH 为 7.2 ； 0038 (3) 发酵培养 ： 将种子液按照 1v/v的接种量接入发酵培养基， 控制温度为 28， 在120rpm转速下， 培养5天， 得到饥饿培养后的菌株发酵液， 使用的发酵培养基包括以下组 分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 5g/L、 酵母浸膏 2.5g/L、 氯化钠 5g/L， pH 为 7.2 ； 0039 (4) 伴孢晶体分离纯化 ： 饥饿培养后的菌株发酵液分装于离心管中， 4， 转速为 4000rpm下冷冻离心30min， 将得到的沉淀用0.1wt的Triton-X1。
19、00生理盐水洗涤， 然后在 4， 4000rpm 下冷冻离心 30min， 再用无菌水洗涤， 反复 3 次后即得到苏云金芽孢杆菌伴孢 晶体， 伴孢晶体主要为菱形。 0040 苏云金芽孢杆菌采用以下步骤制备 ： 0041 (1) 菌种活化 ： 将普通的苏云金芽孢杆菌接种到斜面培养基上， 控制温度为 28 斜面培养 48h， 作为活化菌种， 使用的斜面培养基包括以下组分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 10g/ L、 酵母浸膏 5g/L、 氯化钠 10g/L、 琼脂 15g/L， pH 为 7.2 ； 0042 (2) 诱变处理 ： 利用无菌水将活化菌种稀释 10-6倍， 转接入平板培养基上， 控制紫 外。
20、线装置与活化菌种的距离为30cm， 对该菌种的正面照射5min， 反复3次， 最后筛选出所需 要的苏云金芽孢杆菌即可， 苏云金芽孢杆菌的菌株形态特征 ： 营养菌体呈杆状， 钝圆， 菌体 有鞭毛， 芽孢呈椭圆形， 端生， 使用的平板培养基包括以下组分及含量 ： 胰蛋白胨 10g/L、 酵 母膏 5.0g/L， 氯化钠 10g/L、 琼脂 15g/L， pH 为 7.2。 0043 实施例 4 0044 一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法， 该方法包括以下步骤 ： 0045 (1) 活化培养 ： 将苏云金芽孢杆菌接种在斜面培养基上， 控制温度为 32斜面培 养 24 小时， 作为活化种子， 使用。
21、的斜面培养基包括以下组分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 10g/L、 酵母浸膏 5g/L、 氯化钠 10g/L、 琼脂 20g/L， pH 为 7.2 ； 0046 (2) 种子培养 ： 将活化种子接种在液体种子培养基上， 控制温度为 32， 在 200rpm 转速下， 培养 24h， 作为种子液， 使用的液体种子培养基包括以下组分及含量 ： 胰蛋白胨 5.0g/L、 酵母膏 5.0g/L、 葡萄糖 1.0g/L、 磷酸氢二钠 0.8g/L， pH 为 7.2 ； 0047 (3) 发酵培养 ： 将种子液按照 5v/v的接种量接入发酵培养基， 控制温度为 32， 在200rpm转速下， 培养3天， 。
22、得到饥饿培养后的菌株发酵液， 使用的发酵培养基包括以下组 分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 5g/L、 酵母浸膏 2.5g/L、 氯化钠 5g/L， pH 为 7.2 ； 0048 (4) 伴孢晶体分离纯化 ： 饥饿培养后的菌株发酵液分装于离心管中， 4， 转速为 说 明 书 CN 102757993 A 5 4/4 页 6 6000rpm下冷冻离心15min， 将得到的沉淀用0.5wt的Triton-X100生理盐水洗涤， 然后在 4， 6000rpm 下冷冻离心 15min， 再用无菌水洗涤， 反复 5 次后即得到苏云金芽孢杆菌伴孢 晶体， 伴孢晶体主要为菱形。 0049 苏云金芽孢杆菌采用以下。
23、步骤制备 ： 0050 (1) 菌种活化 ： 将普通的苏云金芽孢杆菌接种到斜面培养基上， 控制温度为 32 斜面培养 12h， 作为活化菌种， 使用的斜面培养基包括以下组分及含量 ： 牛肉膏蛋白胨 10g/ L、 酵母浸膏 5g/L、 氯化钠 10g/L、 琼脂 20g/L， pH 为 7.2 ； 0051 (2) 诱变处理 ： 利用无菌水将活化菌种稀释 10-12倍， 转接入平板培养基上， 控制紫 外线装置与活化菌种的距离为50cm， 对该菌种的正面照射3min， 反复8次， 最后筛选出所需 要的苏云金芽孢杆菌即可， 苏云金芽孢杆菌的菌株形态特征 ： 营养菌体呈杆状， 钝圆， 菌体 有鞭毛， 芽孢呈椭圆形， 端生。 说 明 书 CN 102757993 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102757993 A 7 。