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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510060607.3 (22)申请日 2015.02.04 C07K 7/06(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (71)申请人 广东中大南海海洋生物技术工程中 心有限公司 地址 510730 广东省广州市萝岗区经济技术 开发区青年路沙湾二街 (72)发明人 梁东 张广献 詹朝宇 刘瑞兰 (54) 发明名称 一种类海马抗菌肽 hkplpl-2 (57) 摘要 本发明涉及一种类海马抗菌肽 hkplpl-2， 其包含源于大海马的抗菌肽 hkplp 保守区域 GIVHAGKT-。
2、NH2 的序列。主要对抗菌肽 hkplp 进 行同源比对， 分析出保守区域后， 以 hkplp 为主 体，与 抗 菌 肽 piscidin-like antimicrobial peptide precursorEpinephelus bleekeri 的 保 守 区 域 IHRRR-NH2 杂 合， 设 计 并 合 成 了 hkplpl-2， 序列为 ： GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG。本 发明的有益效果是 ： 本发明所述的抗菌肽， 具有 高效广谱抑菌作用， 低毒性。 可作为抗生素替代品 使用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请。
3、 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 105985407 A 2016.10.05 CN 105985407 A 1/1 页 2 1.一种类海马抗菌肽 hkplpl-2 的化学合成方法及其部分抗菌谱功能， 主要包括以下 步骤 ： 1) 以 Fmoc- 氨基树脂为载体， 按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸， 获得 hkplpl-2- 氨基树脂， 期间依次脱除 Fmoc 保护基团 ； 2) 用三氟乙酸混合溶液把肽从树脂上切下， 处理干燥得粗品 ； 3) 粗品过 G10 柱纯化， 浓缩干燥获得成品 ； 4) 测定人工合成的抗菌肽 hkplpl-2 的抗菌谱 ； 5) 测定人工合成。
4、的抗菌肽 hkplpl-2 的最小抑菌浓度 (MIC)。 2.根据权利要求1所述方法， 其特征是 ： 固相合成连接氨基酸过程中， Fmoc保护基团脱 除剂用 20哌啶 /DMF， Fmoc-AA 按缩合量的 2-5 倍量加入， 其中 Fmoc-AA、 缩合剂比例按摩 尔比 1 1 投放， 缩合反应每次 2-4 小时。 3.根据权利要求 1 和 2 所述方法， 其特征是 ： 在氨基酸连接过程中， 每一步氨基酸缩合 均采用 Kaise Test 检测反应是否缩合完全， 如显色反应呈阳性重复缩合该氨基酸。 4.根据权利要求 1 和 2 所述方法， 其特征是 ： 缩合剂体系采用 DIC+A 或 A+B。
5、+C， 其中 A 为 HOBt 或 HOAt， B 为 HBTU、 HATU、 PyBOP 或 TBTU， C 为 DIPEA 或 TMP， 可以采用排列组合的方 式相互组合。 5.根 据 权 利 要 求 1 中 2) 所 述 方 法，其 特 征 是 ： 三 氟 乙 酸 混 合 溶 液 为 TFA Tis Phenol 按体积比 95 2.5 2.5， 反应时间为 3-4 小时。 6.根据权利要求 1 中 2) 所述方法， 其特征是 ： 处理干燥是指切割液浓缩或吹至干后用 冰乙醚析出固体， 离心干燥。 7.根据权利要求 1 中 3) 所述方法， 其特征是 ： 用 1的醋酸溶液处理 hkplpl。
6、-2 粗品， 离心取上清过 G10 柱。 8.根据权利要求 1 中 3) 所述方法， 其特征是 ： 收集的 hkplpl-2 过柱液经浓缩后干燥。 9.根据权利要求1中4)所述内容， 其特征是 ： 用平板培养法表明人工合成的hkplpl-2 对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 K12D31、 大肠杆菌 DH5、 沙门氏菌、 动物致病大肠杆菌和医院 临床病例分离的大肠埃希菌、 尿肠球菌、 溶血葡萄球菌均有良好的抗菌活性。 10.根据权利要求 1 中 5) 所述内容， 其特征是 ： 采用倍比稀释的方法配制不同浓度的 hkplpl-2溶液， 加入到培养菌液中培养16h后测OD630值， 确定人工合成hkp。
7、lpl-2对不同菌 株的最小抑菌浓度 MIC。 权 利 要 求 书 CN 105985407 A 2 1/4 页 3 一种类海马抗菌肽 hkplpl-2 0001 专利申请号 ： 0002 技术领域 ： 本发明为一种类海马抗菌肽 hkplpl-2。 0003 背景技术 ： 近年来随着抗生素的滥用， 抗药菌越来越多， 耐药性日益严重。据资 料显示， 在美国临床上分离到的金葡菌有 95对青霉素耐药， 50以上对甲氧西林耐药 (Frindkin SK， Gaynes RP.Antimicrobial resistance in intensive care units.Clin Chest Med.。
8、1999， 20(2) ： 303-316) ； 2012 年我国临床检测发现， 金葡菌和凝固酶阴性葡萄 球菌中甲氧西林耐药株 (MRSA 和 MRCNS) 的检出率平均分别为 47.9和 77.1 (2012 年中 国 CHINET 细菌耐药性监测 Chin J Infect Chemother， 2013， 13(5) ： 321-330)。这种情况 逐渐严重威胁着人类的生产生活， 从而导致人们对此潜在威胁意识的觉醒及食品安全级别 意识的提高， 产生了替代旧抗生素且绿色环保、 安全抗耐药的新一代抗生素的迫切需要。 0004 抗菌肽是生物体内免疫防御系统的重要组成部分， 是一类小分子肽， 被。
9、称为安全 的天然抗生素， 具有抗菌谱广、 无耐药性、 热稳定好、 水溶性高、 无毒无残留等优点。 据统计， 目前我国尚有多达 20 种人畜共用或畜禽专用的抗生素作饲料添加剂， 除此之外， 抗菌肽还 被并将被广泛用于化妆品、 食品保鲜剂、 药物、 转基因表达等与人类生产生活当中。将抗菌 肽产品开发成新的代替传统抗生素的产品， 将给我国的相关行业注入一针强心剂， 推动我 国相关行业不断向前发展。 0005 抗菌肽 hkplpl-2 序列 ： GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG ； 分子式 ： C113H177N37O23， 分子量 MWAV ： 2421.8 ； 不含有稀有氨基酸和外源化。
10、学成分， 具有免疫原性小、 水溶性好、 广谱杀 菌等优点， 能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。 特别是在酸性条件下， 加热甚至是高温高 压处理对其抗菌活性没有影响。 可以在产品保存过程中持续发挥其功能， 保持产品品质， 延 长贮存期限。 Hkplpl-2可以作为新一代的添加剂， 是很好的传统抗生素替代品， 能有效得解 决人和动物药残和病原菌耐药性的问题。 0006 发明内容 ： 本发明的目的在于提供一种人工构建的抗菌肽序列。我们在具有很好 的抗菌活性的抗菌肽 hkplp 原有序列的基础上， 我们对其进行人工改造设计， 根据同源性 比对， 分析出保守序列GIVHAGKT。 与抗菌肽plapp(p。
11、iscidin-like antimicrobial peptide precursorEpinephelus bleekeri) 的保守序列 IHRRR 进行杂合， 设计出十种人工抗菌 肽， 通过筛选， 最终获得序列 ： GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG。 0007 本发明的方法包括如下步骤 ： 0008 步骤 (1) 本发明利用生物信息学方法对抗菌体 hkplp 进行 BLAST 比对， 分析并选 出保守区域 P1 ： GIVHAGKT ； 0009 步骤 (2) 选择与其功能相近的抗菌肽 plapp 的保守区域 P2 ： IHRRR， 与 hkplp 进行 杂合设计 ； 00。
12、10 步骤 (3) 采用化学合成法合成 hkplpl 系列抗菌肽十组 ； 0011 步骤(4)采用平板培养法对合成抗菌肽hkplpl系列设计抗菌肽进行筛选， 并对效 果明显的抗菌肽进 行对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 DH5、 沙门氏菌、 动物致病大肠杆菌和 医院临床病例分离的大肠埃希菌、 溶血葡萄球菌的抗菌实验如图 1 所示， 结果显示抗菌肽 说 明 书 CN 105985407 A 3 2/4 页 4 hkplpl-2 对以上各菌均有良好的抗菌活性。 0012 步骤(5)中采用倍比稀释的方法配制不同浓度的hkplpl-2溶液， 加入到培养菌液 中培养 16h 后测 OD630值， 确定人工合。
13、成 hkplpl-2 对不同菌株的最小抑菌浓度 MIC。 附图说明 ： 0013 图为合成抗菌肽 hkplpl-2 对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 DH5、 沙门氏菌、 动物致 病大肠杆菌和医院临床病例分离的大肠埃希菌、 溶血葡萄球菌的抗菌实验结果， 图中 ： 1 表 示氨苄青霉素的抗菌活性 ； 0 为阴性对照 ddH2O ； 2、 3、 4 为人工合成抗菌肽的抗菌活性。 具体实施方式 ： 0014 以下给出实施例对本发明进行具体描述， 但需指出的是本发明不限于具体实施 例， 实施例只用于对本发明的进一步说明， 不能理解为对本发明范围的限制。 0015 具体实施例说明 ： 0016 实施例 1 。
14、： Fmoc-Arg(pbf)- 氨基树脂的制备 0017 将氨基树脂Fmoc-Rink Amide 10.03g， 替代度0.84mmol/g， 加入到固相反应器中， 加入 DMF 浸泡， 使其充分溶胀 30min， 抽干， 加 20哌啶 /DMF 溶液脱 Fmoc 5min、 15min， 用 DMF、 DCM、 MeOH洗涤干净。 取11.1g Fmoc-Arg(Pbf)-OH， 2.24gHOBt， 6.14gHBTU用DMF溶解后 加入到反应器中平衡 5min， 加入 6.0ml DIPEA 室温反应 1 小时， 抽干， 先后用 DMF、 DCM、 MeOH 各洗涤 3 次， 干燥称。
15、重 17.12g Fmoc-Arg(pbf)-Rink Amide 树脂， 检测取代度为 0.67mmol/ g。 0018 实施例 2 ： hkplpl-1- 氨基树脂的制备 0019 将上述树脂放于接肽瓶中， 加入 20哌啶 /DMF 溶液脱 Fmoc 5min、 15min， 用 DMF、 DCM、 MeOH 洗涤干净。然后按序列 GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG-NH2的顺序依次接 Fmoc 保护 的氨基酸， 反应体系摩尔比为 Fmoc-AA ： DIC.HOBt 按 1 1 1 投放， 在此例中 Fmoc-AA 按 树脂量的 3 倍加入， 每次 DIC 加 4.10g 左。
16、右， HOBt 加 4.27g 左右。期间依次 20哌啶 /DMF 脱除Fmoc保护基团2次， 第一次反应5min， 第二次反应15min ； 每一步氨基酸缩合反应一次 2-4 小时， 均采用 Kaise Test 检测反应是否缩合完全， 如显色反应呈阳性重复缩合该氨基 酸， 序列缩合最后直接脱除 Fmoc 保护基团， DMF、 DCM、 MeOH 洗涤几次。 0020 实施例 3 ： hkplpl-1 粗品的制备 0021 Hkplpl-1氨基树脂用TFA ： Tis ： Phenol按体积比952.52.5的混合溶液处理 肽树脂 3-4 小时， 把肽从树脂上切下来及切除侧链保护基， 浓缩至。
17、干后用冰乙醚析出固体， 离心干燥得粗品 29.51g。 0022 实施例 4 ： hkplpl-1 成品的制备 0023 Hkplpl-1粗品用1醋酸溶液溶解后， 离心取上清过G10柱， 收集抗菌肽hkplpl-1 峰浓缩干燥得成品 17.71g。纯度大于 60， 总收率达 54。 0024 实施例 5 ： 按实施例 1 至 4 合成其余 hkplpl 系列的多肽。序列如下 ： 0025 hkplpl-2 ： GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG 0026 hkplpl-3 ： GLIFKGIVHAGKT LHRVIHRRG 0027 hkplpl-4 ： GLFIKGIVHAGKT 。
18、LHRVIHRRG 说 明 书 CN 105985407 A 4 3/4 页 5 0028 hkplpl-5 ： GLIKFGIVHAGKT LHRVIHRRR 0029 hkplpl-6 ： GLIFKGIVHAGKT KHRVIHRRR 0030 hkplpl-7 ： GLIFKGIVHAGKT HLRVIHRRR 0031 hkplpl-8 ： GILKFGIVHAGKT LHRVIHRRR 0032 hkplpl-9 ： GILKFGIVHAGKT IKRVIHRRR 0033 hkplpl-10 ： GLIFHGIVHAGKT LKRVIHRRR 0034 实施例 6 ： hkplp。
19、l 系列筛选 0035 从 YPD 平板上挑取 PCR 鉴定为阳性的单菌落接种于 100mlBMGY 培养基， 30振荡 培养至 OD6002 6， 去上清， 加入 20mlBMMY 培养基重悬菌体， 30振荡培养 96 小时， 每隔 24 小时取 1ml 样品于 Eppendorff 管中， 取上清用于抗菌活性检测。 0036 将琼脂培养基在水浴中加热熔化， 冷却至 50左右， 用无菌操作法吸取 60l 的 金黄色葡萄球菌 (OD600 0.3)， 加入 20ml 琼脂培养基中， 迅速混匀， 倾倒入直径为 9cm 的 无菌平面皿内， 水平放置待凝固。在琼脂上打直径为 2.7mm 的圆孔， 分。
20、别在孔中加入用磷酸 盐缓冲液配制的合成hkplpl， 无菌水和100mg/ml Amplicin。 将平皿倒置于37培养过夜， 次日观察结果。结果见表 1。 0037 表 1 金黄色葡萄球菌 Hkplpl 系列多肽筛选 0038 0039 实施例 7 ： 合成抗菌肽 hkplpl-2 抗菌谱的测定 0040 从 YPD 平板上挑取 PCR 鉴定为阳性的单菌落接种于 100mlBMGY 培养基， 30振荡 培养至 OD6002 6， 去上清， 加入 20mlBMMY 培养基重悬菌体， 30振荡培养 96 小时， 每隔 24 小时取 1ml 样品于 Eppendorff 管中， 取上清用于抗菌活性。
21、检测。 0041 将琼脂培养基在水浴中加热熔化， 冷却至 50左右， 用无菌操作法吸取 60l 的 生测菌 (OD600 0.3)， 加入 20ml 琼脂培养基中， 迅速混匀， 倾倒入直径为 9cm 的无菌平面 皿内， 水平放置待凝固。在琼脂上打直径为 2.7mm 的圆孔， 分别在孔中加入用磷酸盐缓冲液 配制的合成 hkplpl-2， 无菌水和 100mg/ml Amplicin。 将平皿倒置于 37培养过夜， 次日 观察结果。 0042 人工合成的抗菌肽 hkplpl-2 对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 DH5、 沙门氏菌、 动物 致病大肠杆菌和医院临床病例分离的大肠埃希菌、 溶血葡萄球菌的抗。
22、菌实验如图 1 所示， 该抗菌肽对以上各菌均有良好的抗菌活性。 0043 实施例 8 ： 人工合成 hkplpl-2 最小抑菌浓度 (MIC) 的测定 0044 MIC ： 将测试菌株培养至对数生长期的菌液稀释为约 5106CFU/ml， 加入 96 孔培 养板中， 测试孔每孔加入菌液 90l， 然后加入倍比稀释的不同浓度的合成抗菌肽溶液， 10l/孔。 阳性对照为100l/孔的菌液， 阴性对照为相应的100l培养基。 然后于37 慢摇培养约 16h， 用酶标仪测 OD630。抑制细菌生长的最低浓度即为 MIC， 结果见表 2。 0045 表 2 重组抗菌肽 HKPLPL-2 的 MIC 00。
23、46 说 明 书 CN 105985407 A 5 4/4 页 6 0047 实施例 9 ： 人工合成抗菌肽 hkplpl-2 抗菌活性单位确定 0048 我们将 1mg 纯度不低于 95的固相化学合成的抗菌肽 hkplpl-1 的抗菌活力定义 为 1000U。因此人工合成的抗菌肽 hkplpl-2 的抗菌活力不低于 630U/mg。 0049 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明的进一步详细说明， 不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下， 本发明所属技术领域的 技术人员可以做出若干推演或替换， 都应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 105985407 A 6 1/1 页 7 说 明 书 附 图 CN 105985407 A 7 。