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1、(10)申请公布号 CN 102757957 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757957 A *CN102757957A* (21)申请号 201210249152.6 (22)申请日 2012.07.18 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 张振 刘建国 庞通 李凌 林伟 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 周秀梅 李颖 (54) 发明名称 一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星 标记。
2、及其特异性引物和应用 (57) 摘要 本发明属于海洋生物技术领域， 具体的说是 一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记 及其特异性引物和应用。长心卡帕藻微卫星标记 为 SEQ.ID.NO1-5 碱基序列所示 ； 细齿麒麟菜的微 卫星标记为 SEQ.ID.NO6-10 碱基序列所示。利用 SEQ.ID.NO1-10 碱基序列所示微卫星标记的特异 性引物扩增， 样品中扩增出约150bp的特异性DNA 片段， 进而区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜以及检 测这两种海藻半精品是否互相掺杂。采用本发明 微卫星标记进行区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的 方法高效、 稳定性高、 操作简单， 能在约 4 小时内 完成鉴。
3、别、 检测工作。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 7 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记， 其特征在于 ： 长心卡帕藻微卫星 标记为SEQ.ID.NO1-5碱基序列所示 ； 细齿麒麟菜的微卫星标记为SEQ.ID.NO6-10碱基序列 所示。 2. 一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记的特异性引物， 其特征在于 ： 所述 SEQ.ID.NO1 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异。
4、性引物为 ： F:TTCCTCAAGACGCTCCACCAAAC， R:GCGAGGTGTGAGATGCCGAGT ； SEQ.ID.NO2 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为 ： F:GCCAACTCTGGTTACACATATT， R:GAGGTTTGGTTGATGAATTGA ； SEQ.ID.NO3 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为 ： F:ACAATCATATACGTCGCAAACG， R:ACAGGTAGTTGAGTGGTTGGAAAC ； SEQ.ID.NO4 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为 ： F:TGTGACGACGGCGGAGA。
5、ATG， R:TCTCACCAGGCGACTGCTCATC ； SEQ.ID.NO5 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为 ： F:GATGGCGTGAAGATAAAAGAGA， R:ATCACTTCCACTGTCCCTATGT ； SEQ.ID.NO6 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： F:CCCGCGACTAATGCAAAAGGT， R:CGTGGCTCACTATGATGAATCTAAC ； SEQ.ID.NO7 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： F:TGAATGTTAGCTCGCATACCG， R:TCACAGGGCAACTTCAACA。
6、A ； SEQ.ID.NO8 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： F:GATGTTGAGCAGCCTTGGGG， R:GGGTGTTTACCGCTTCTTCTTTT ； SEQ.ID.NO9 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： F:CCCGTCTATTCTCGACCAGGCA， R:TTTGTGAATGTTAGCTCGCATACCG ； SEQ.ID.NO10 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： F:ACGCCCTTGTATTGCTTGTACGG， R:GACATCAAGAAGGCTCCGAGCTAC。 3. 按权利要求 2 所述的区分长心。
7、卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记的特异性引物的 应用， 其特征在于 ： 利用 SEQ.ID.NO1-10 碱基序列所示微卫星标记的特异性引物扩增， 样品 中扩增出约 150bp 的特异性 DNA 片段， 进而区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜以及检测这两种 海藻半精品是否互相掺杂。 权 利 要 求 书 CN 102757957 A 2 1/5 页 3 一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记及其特异 性引物和应用 技术领域 0001 本发明属于海洋生物技术领域， 具体的说是一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的 微卫星标记及其特异性引物和应用。 背景技术 0002 长心卡帕藻 （Kappaphycus al。
8、varezii） 和细齿麒麟菜 （Eucheuma denticulatum） 分别是国际上生产 - 和 - 卡拉胶的重要原料。其主产区主要有印度尼西亚、 菲律宾、 马 来西亚、 越南等东南亚国家， 坦桑尼亚、 肯尼亚等部分非洲国家， 巴西、 墨西哥等中南美洲国 家以及我国海南省。 上述国家地区人工规模化栽培长心卡帕藻和细齿麒麟菜是维持国际卡 拉胶相关产业发展的基础。 0003 卡拉胶由 D- 半乳糖和 3,6- 内醚半乳糖残基组成的海藻细胞粘性多糖。依据其残 基中酯式硫酸基盐的含量和分子链接位置的差异， 卡拉胶可以被分为型、 型、 型、 型和 型等多种类型的卡拉胶。目前生产应用最为广泛的是 。
9、型卡拉胶， 其次为 型卡 拉胶。其主要原料分别是长心卡帕藻与细齿麒麟菜。 0004 目前在市场流通过程中， 存在着某些长心卡帕藻中掺杂有细齿麒麟菜的现象， 尤 其在长心卡帕藻半精品颗粒中掺杂细齿麒麟菜颗粒比较严重。 这是由于长心卡帕藻与细齿 麒麟菜在形态上比较接近， 其干品在外观上难以区分， 特别是经过初加工处理的半精品如 何检测尚没有具体办法。 0005 由于两种藻含有的卡拉胶的类型不同， 提取工艺也不尽相同， 两种海藻的掺杂不 仅大大降低原材料的利用率， 而且直接影响产品质量， 导致产品不稳定。 而凭借长心卡帕藻 和细齿麒麟菜的藻株外形等形态学物种鉴定方法存在着易受生理状态和人为因素影响等。
10、 弊端， 以及长心卡帕藻半精品颗粒中掺杂细齿麒麟菜颗粒难以检测等问题， 不仅会扰乱了 正常市场交易， 而且不利于后续产品的进一步开发和应用， 易造成不必要的商品经济损失， 并且也会影响栽培、 加工和供应商之间的商业信誉。 为此， 有必要开发一种客观、 高效、 稳定 的方法鉴别两种海藻以及其半精品的技术方法。 0006 微卫星标记是以 DNA 为基础的分子标记， 由于具有易扩增、 重复性高、 检测位点 多、 中性标记等特点， 不受生理、 生活环境变化以及人为因素影响的优点， 被广泛应用到动 植物的物种鉴别和种质鉴定。 发明内容 0007 本发明目的提供一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记的。
11、特异性引物 及其应用。 0008 为实现上述目的， 本发明采用技术方案为 ： 0009 一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记， 长心卡帕藻微卫星标记为 SEQ. ID.NO1-5 碱基序列所示 ； 细齿麒麟菜的微卫星标记为 SEQ.ID.NO6-10 碱基序列所示。 说 明 书 CN 102757957 A 3 2/5 页 4 0010 一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记的特异性引物 ： 0011 所述 SEQ.ID.NO1 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为 ： 0012 F:TTCCTCAAGACGCTCCACCAAAC， R:GCGAGGTGTGAGATGCC。
12、GAGT ； 0013 SEQ.ID.NO2 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为 ： 0014 F:GCCAACTCTGGTTACACATATT， R:GAGGTTTGGTTGATGAATTGA ； 0015 SEQ.ID.NO3 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为 ： 0016 F:ACAATCATATACGTCGCAAACG， 0017 R:ACAGGTAGTTGAGTGGTTGGAAAC ； 0018 SEQ.ID.NO4 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为 ： 0019 F:TGTGACGACGGCGGAGAATG， R:TCTCACCAGGC。
13、GACTGCTCATC ； 0020 SEQ.ID.NO5 碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为 ： 0021 F:GATGGCGTGAAGATAAAAGAGA， R:ATCACTTCCACTGTCCCTATGT ； 0022 SEQ.ID.NO6 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： 0023 F:CCCGCGACTAATGCAAAAGGT， 0024 R:CGTGGCTCACTATGATGAATCTAAC ； 0025 SEQ.ID.NO7 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： 0026 F:TGAATGTTAGCTCGCATACCG， R:TC。
14、ACAGGGCAACTTCAACAA ； 0027 SEQ.ID.NO8 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： 0028 F:GATGTTGAGCAGCCTTGGGG， R:GGGTGTTTACCGCTTCTTCTTTT ； 0029 SEQ.ID.NO9 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： 0030 F:CCCGTCTATTCTCGACCAGGCA， 0031 R:TTTGTGAATGTTAGCTCGCATACCG ； 0032 SEQ.ID.NO10 碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为 ： 0033 F:ACGCCCTTGTATTGCTTGT。
15、ACGG， 0034 R:GACATCAAGAAGGCTCCGAGCTAC。 0035 利用 SEQ.ID.NO1-10 碱基序列所示微卫星标记的特异性引物扩增， 样品中扩增出 约 150bp 的特异性 DNA 片段， 进而区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜以及检测这两种海藻半精 品是否互相掺杂。本发明所具有的优点 ： 本发明利用特定微卫星标记客观、 稳定、 高效的鉴 别长心卡帕藻和细齿麒麟菜， 根据琼脂糖凝胶电泳相应带型的有无可以直观判断待测藻株 属于哪种藻株， 以及分析一种藻的半精品颗粒是否掺杂着另一种藻的颗粒。 附图说明 0036 图 1 为本发明实施例提供的利用细齿麒麟菜微卫星标记 Ed002。
16、、 Ed003 和 Ed005 对 8 个藻株样品的基因组 DNA 进行扩增效果图 （其中， 8 个藻株样品为细齿麒麟菜的新鲜样 品5F、 干燥样品5D以及半精品5S， 长心卡帕藻的新鲜样品7F、 8F、 12F、 半精品12S以及干燥 样品13D ； M为DL500(Takara)， 从下往上7条带分别代表50bp、 100bp、 150bp、 200bp、 300bp、 400bp 和 500bp。 ） 。 0037 图 2 为本发明实施例提供的利用细齿麒麟菜微卫星标记 Ed006 和 Ed007 对 8 个 藻株样品的基因组 DNA 进行扩增效果图 （其中， 8 个藻株样品为细齿麒麟菜的。
17、新鲜样品 5F、 说 明 书 CN 102757957 A 4 3/5 页 5 干燥样品 5D 以及半精品 5S， 长心卡帕藻的新鲜样品 7F、 8F、 12F、 半精品 12S 以及干燥样 品 13D ； M 为 DL500(Takara)， 从下往上 7 条带分别代表 50bp、 100bp、 150bp、 200bp、 300bp、 400bp 和 500bp。 ） 。 0038 图3为本发明实施例提供的利用长心卡帕藻微卫星标记Ka1139、 Ka1272和Ka1340 对 8 个藻株样品的基因组 DNA 进行扩增效果图 （其中， 细齿麒麟菜的新鲜样品 5F、 干燥样 品 5D 以及半精。
18、品 5S， 长心卡帕藻的新鲜样品 7F、 8F、 12F、 半精品 12S 以及干燥样品 13D ； M 为 DL500(Takara)， 从下往上 7 条带分别代表 50bp、 100bp、 150bp、 200bp、 300bp、 400bp 和 500bp。 ） 。 0039 图 4 为本发明实施例提供的利用长心卡帕藻微卫星标记 Ka1450 和 Ka1476 对 8 个藻株样品的基因组 DNA 进行扩增效果图 （其中， 细齿麒麟菜的新鲜样品 5F、 干燥样品 5D 以及半精品 5S， 长心卡帕藻的新鲜样品 7F、 8F、 12F、 半精品 12S 以及干燥样品 13D ； M 为 DL。
19、500(Takara)， 从下往上 7 条带分别代表 50bp、 100bp、 150bp、 200bp、 300bp、 400bp 和 500bp。 ） 。 0040 图 5-9 为本发明实施例 3 提供的是利用 10 个微卫星标记对长心卡帕藻半精品和 细齿麒麟菜半精品的相互掺杂样品的检测示意图 （其中， 长心卡帕藻半精品中掺杂质量比 例为 3%、 5% 和 10% 的细齿麒麟菜半精品， 它们分别用 3E、 5E 和 10E 来表示 ； 细齿麒麟菜半 精品中掺杂质量比例为 3%、 5% 和 10% 的长心卡帕藻半精品， 它们分别用 3K、 5K 和 10K 来表 示） 。 具体实施方式 00。
20、41 实施例 1 0042 从 NCBI（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/） 下载长心卡帕藻和细齿麒麟菜的 EST 序列 ； 利用软件MISA筛选含有微卫星核心序列的片段， 然后利用Primer Primer5.0根据核 心序列两侧的保守序列设计引物 ； 对各个引物进行反应条件优化， 各选取 5 个反应稳定、 带 型清晰的长心卡帕藻和细齿麒麟菜的微卫星标记 （参见表 1） 。 0043 分别提取细齿麒麟菜和长心卡帕藻不同状态样品的 DNA， 以此 DNA 为模板， 利用上 述特异性引物， PCR 扩增反应， 其产物经琼脂糖凝胶电泳， 利用微卫星标记的种特异性， 区分 这两。
21、种海藻。 。 0044 分别提取不同比例掺杂的两种海藻 （细齿麒麟菜和长心卡帕藻） 半精品的 DNA， 以 此 DNA 为模板， 利用上述特异性引物， PCR 扩增反应， 当一 种藻株半精品中含有微量的另一 种藻株半精品时， 提取的DNA即是两个物种DNA的混合物， 因此利用两个物种的微卫星标记 进行扩增， 其产物经琼脂糖凝胶电泳， 均有得到相应的条带， 用于判断这两种海藻半精品是 否互相掺杂。 0045 实施例 2 0046 从海南陵水养殖基地收集细齿麒麟菜的新鲜样品 （5F） 、 干燥样品 (5D) 以及半精 品 (5S) （Hayashi et al.2007） ， Hayashi L.。
22、,de Paula E.J.& Chow F.(2007)Growth rate and carrageenan analyses in four strains of Kappaphycus alvarezii(Rhodophyta,G igartinales)farmed in the subtropical waters of Sao Paulo State,Brazil.Journal of Applied Phycology19,393-9.长心卡帕藻的新鲜样品 （7F、 8F、 12F） 、 干燥样品 （13D） 、 半 说 明 书 CN 102757957 A 5 4/5 页 6。
23、 精品 (12S)。上述海藻的原材料均为从印度尼西亚引进的优良种质。每株藻株提取 DNA 各 一份， 调整 DNA 浓度至 20ng/ul。以每份 DNA 为模板， SEQ.ID.NO1-10 序列所示的微卫星标 记特异性引物为引物， 各个 PCR 扩增的 PCR 反应体系为 20ul， 每个反应体系中加入模板 DNA 1ul， 2PCR Mix Buffer（含有 Mg2+， dNTPs） ( 购自广州东盛生物科技有限公司 )10ul， 正 向引物 （10mM） 0.5ul， 反向引物 （10mM） 0.5ul， HS Taq 酶 ( 购自广州东盛生物科技有限公 司 )0.2ul(0.5U)。
24、， 双蒸水补齐体系至 20ul。 0047 各个 PCR 扩增反应程序如下 ： 94 C 预变性 5min 后进入循环反应， 94 C 变性 30s， 58C退火30s， 72C延伸30s， 共35个循环， 最后72C延伸5min， 4C冰箱保存。 PCR反应产物在2.5%的琼脂糖凝胶电泳 （电压120V， 25min） ， 胶成像系统拍照， 分析胶图， 查 看各个 PCR 反应产物中的特异性条带。 0048 SEQ.ID.NO1-5 所示的微卫星标记 Ed002、 Ed003、 Ed005、 Ed006 和 Ed007 只有以细 齿麒麟菜基因组DNA为模板， 才能稳定扩增出细齿麒麟菜特有的约。
25、为150bp的条带 （参见图 1 和图 2） ； 结果显示细齿麒麟菜 3 个藻株样品在约 150bp 处有特异性条带产出， 而长心卡帕 藻 5 个藻株样品均无扩增产物。 0049 SEQ.ID.NO6-10 所示的微卫星标记 Ka1139、 Ka1272、 Ka1340、 Ka1450 和 Ka1476 只 有以长心卡帕藻基因组DNA为模板， 才能稳定扩增出长心卡帕藻特有的约150bp的条带 （参 见图 3 和图 4） 。结果显示长心卡帕藻 5 个藻株样品在约 150bp 处有特异性条带产出， 而细 齿麒麟菜 3 个藻株样品均无扩增产物。利用这 10 个微卫星标记可以清晰、 客观、 准确地鉴 。
26、别细齿麒麟菜和长心卡帕藻。 0050 实施例 3 0051 从海南养殖基地采集两种海藻样品制作半精品 （半精品制备为 10g 海藻干燥样品 与 250ml 含 10%NaOH 和 5%KCl 的碱混合液混合， 混合液于 60 C 水浴处理 2h， 去除碱液后， 加水浸洗四次至中性， 65 C 烘干至 恒重， 干燥破碎） 。然后将细齿麒麟菜半精品按照质量 比 3%、 5% 和 10% 的比例混入到长心卡帕藻半精品中， 得到 3 份混合样品 ； 同理， 得到 3 份细 齿麒麟菜半精品混合样品， 它们分别混有 3%、 5% 和 10% 长心卡帕藻半精品。 。 0052 按照康为世纪植物基因组试剂盒说。
27、明书， 提取所述6份混合样品的DNA各一份， 调 整 DNA 浓度至 20ng/ul。以每份 DNA 为模板， SEQ.ID.NO1-10 序列所示的微卫星标记特异性 引物为引物。 0053 各个 PCR 扩增的 PCR 反应体系为 20ul， 每个反应体系中加入模板 DNA1ul， 2PCR Mix Buffer（含有 Mg2+， dNTPs） ( 购自广州东盛生物科技有限公司 )10ul， 正向引物 （10mM） 0.5ul， 反向引物 （10mM） 0.5ul， HS Taq酶(购自广州东盛生物科技有限公司)0.2ul(0.5U)， 双蒸水补齐体系至 20ul。 0054 各个 PCR 。
28、扩增反应程序如下 ： 94 C 预变性 5min 后进入循环反应， 94 C 变性 30s， 58C退火30s， 72C延伸30s， 共35个循环， 最后72C延伸5min， 4C冰箱保存。 PCR反应产物在2.5%的琼脂糖凝胶电泳 （电压120V， 25min） ， 胶成像系统拍照， 分析胶图， 查 看各个 PCR 反应产物中的特异性条带。 0055 10 个微卫星标记以 6 种半精品 DNA 为模板， 微卫星标记 PCR 产物的带型亮度与检 测样品中其对应物种样品的浓度呈正比， 但均可以扩增出特异性的条带 （附图 5 至图 9） ， 结 果显示这些微卫星标记均能将样品检测成功， 说明当长心。
29、卡帕藻半精品中仅含有 3% 的细 说 明 书 CN 102757957 A 6 5/5 页 7 齿麒麟菜时， 细齿麒麟菜的微卫星标记便可将掺入的细齿麒麟菜检出 ； 同样， 当细齿麒麟菜 半精品中仅含有 3% 的长心卡帕藻时， 长心卡帕藻的微卫星标记也可将掺入的长心卡帕藻 检出。 0056 表 1 0057 说 明 书 CN 102757957 A 7 1/7 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102757957 A 8 2/7 页 9 0003 序 列 表 CN 102757957 A 9 3/7 页 10 0004 序 列 表 CN 102757957 A 10 4/7 页 11。
30、 0005 序 列 表 CN 102757957 A 11 5/7 页 12 0006 序 列 表 CN 102757957 A 12 6/7 页 13 0007 序 列 表 CN 102757957 A 13 7/7 页 14 序 列 表 CN 102757957 A 14 1/4 页 15 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102757957 A 15 2/4 页 16 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102757957 A 16 3/4 页 17 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102757957 A 17 4/4 页 18 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102757957 A 18 。