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1、(10)申请公布号 CN 102758024 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102758024 A *CN102758024A* (21)申请号 201210278859.X (22)申请日 2012.08.08 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西路 135 号 (72)发明人 蒙子宁 王乐 林浩然 (74)专利代理机构 广州市深研专利事务所 44229 代理人 姜若天 (54) 发明名称 一种用于检测小黄鱼群体结构的选择性分子 标记及其引物与检测方法 (57。
2、) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 用 于 检 测 小 黄 鱼 群 体 结 构 的 选 择 性 分 子 标 记 及 其 引 物 与 检 测 方 法，其 序 列 如 SEQIDNO.1 所 示。 引 物序列为 H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCA， H16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA。检测方法包括如 下步骤 ： 基因组DNA的提取、 PCR扩增反应及测序、 中性检测和群体结构分析。本发明的选择性分子 标记能检测出小黄鱼的群体结构。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局。
3、 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种用于检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记， 其特征在于 ： 所述的标记编号 为 ： H16， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。 2. 权利要求 1 所述选择性分子标记 H16 的引物序列， 其特征在于如下所示 ： H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCA H16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA。 3. 权利要求 1 所述选择性分子标记 H16 的检测方法， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 基因组 DNA 的提取 ： 采用酚氯仿法提取小黄鱼。
4、分布范围内采集到的 32 个产卵群体共 1104 尾小黄鱼个体 的基因组 DNA， 步骤如下 ： 剪取 20mg 尾鳍于 1.5ml 离心管中， 加入 570L STE buffer （10mmol/L Tris-Cl, pH=8.0; 100mmol/L EDTA, pH=8.0; 100mmol/L NaCl） 并将组织剪 碎 ； 加入 10L 20mg/ml 的蛋白酶 K 和 20L 20% SDS， 55-56消化 ； 加入 600L 酚 : 氯 仿 : 异戊醇 （体积比 25:24:1） 抽提两次， 13000r/min 离心 5min， 取上清 ； 加入等体积 -20 预冷的无水乙。
5、醇， 混匀， 13000r/min 离心 5min， 弃上清， 用 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次， 室温下 晾干， 然后加入 50-100L TE buffer（1mmol/L EDTA， 10mmol/L Tris-HCl， pH=8.0） 溶解 DNA ； 紫外分光光度计检测 DNA 浓度， 用 TE buffer 将其稀释至 100g/mL， 并用 1% 的琼脂 糖凝胶电泳检测 DNA 的完整性 ； DNA 样品存于 -80冰箱中备用 ； （2） PCR 扩增反应及测序 ： 扩增反应体系为 20L ： 0.5M 引物 （正向引物 5端用荧光染料 HEX 标记） ， 0.2mM dNTP，。
6、 1.5mM MgCl2， 1PCR buffer， 1U Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA ； 反应程序 ： 94 5min， 94 30s， 58 30s， 72 30s， 最后延伸 5min ； PCR 产物用 ABI PRISM 3730 DNA 自 动测序仪分离， 片段长度用软件 GeneMapper 根据内标 ROX-500 确定 ； （3） 中性检测 ： 采用如下方法一或方法二检测位点是否中性 ： 方法一是利用软件 BAYESCAN 中的贝叶 斯模拟检测， 界定群体 - 位点特异性效应对 FST的影响并用 Markov chain Monte Carlo 方 法来评估其。
7、后验概率分布 ； 方法二是利用软件 Arlequin 3.5 进行结构性的岛模型分析 ； （4） 群体结构分析 小黄鱼的群体结构利用软件 ARLEQUIN 3.5 通过计算 Wright s F 统计用 pairwise FST 矩阵来评估 ； 为了比较不同类型标记及其遗传结构， 采用 SPSS v16.0 对 pairwise FST矩阵 进行了多维尺度分析。 权 利 要 求 书 CN 102758024 A 2 1/4 页 3 一种用于检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记及其引物 与检测方法 0001 技术领域 0002 本发明涉及选择性分子标记和小黄鱼， 具体涉及一种能检测小黄鱼种群结构的。
8、选 择性遗传标记、 引物及其检测方法。 0003 背景技术 0004 渔业资源的保护和管理需要清晰了解鱼类的群体结构， 但洄游性海水鱼类相比较 于淡水鱼类群体结构通常并不明显， 有的甚至可视为一个自由交配群体。这是由于开放 的海洋环境中缺少遗传障碍并且不同洄游群体之间往往在产卵场或索饵场存在混合的现 象， 因而存在着很显著的基因流， 不同地理群体之间的遗传分化很弱 （Waples， The Journal of heredity 1998， 89 ： 438450 ； Ruzzante 等， Proceedings of the Royal Society B-Biological Scien。
9、ces 2006， 273 ： 14591464） 。目前分析鱼类群体遗传结构的技术主 要是使用中性的分子标记， 但即使是灵敏度高的SSR和SNP标记， 在分析这类洄游性鱼类的 群体结构时往往也束手无策。值得指出的是， 广阔而且多变的海洋环境为自然选择提供了 更多的机会， 适应性进化因而可能普遍存在于海洋鱼类中， 因此用选择性标记去分析可能 会检测到洄游性鱼类的群体结构， 这对鱼类群体的保护和管理来说是至关重要的 （Nielsen 等， Molecular Ecology 2009， 18 ： 3128-3150） 。 0005 小黄鱼 （Larimichthys polyactis） 隶属于。
10、鲈形目、 石首鱼科、 黄花鱼属， 为广泛分 布于渤海、 黄海和东海北部的暖温性底层鱼类， 是我国重要的海洋渔业经济种类， 曾被誉为 我国 “四大渔业” 之一。近些年来， 高强度的捕捞压力已经使得小黄鱼资源处于过度捕捞 状态。为了保护和管理小黄鱼渔业资源， 研究其种群遗传结构和遗传变异水平是非常必要 的。 然而， 由于小黄鱼是一种洄游性海水鱼类， 中性线粒体分子标记分析了小黄鱼的群体结 构后认为整个小黄鱼是一个自由交配的群体 （Xiao等， Environmental Biology of Fishes 2009， 85 ： 303-314） 。显然， 开发和应用小黄鱼选择性分子标记是解决问题的。
11、关键。 发明内容 0006 本发明的目的在于针对现有中性分子标记难以检测出小黄鱼群体结构的不足， 提 供一种能够检测小黄鱼群体间遗传差异的选择性分子标记序列及其引物。 0007 本发明的另一个目的在于提供用上述选择性分子标记检测小黄鱼群体结构的方 法。 0008 本发明的目的是通过如下技术方案实现的 ： 一种用于检测小黄鱼群体结构的选择 性分子标记 H16， 其序列如 SEQ ID NO.1 所示。其引物序列为 ： H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCA 说 明 书 CN 102758024 A 3 2/4 页 4 H16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA 一种用于检。
12、测小黄鱼群体结构的选择性分子标记 H16， 其检测方法步骤如下 ： （1） 基因组 DNA 的提取 ： 采用酚氯仿法提取小黄鱼分布范围内采集到的 32 个产卵群体共 1104 尾小黄鱼个体 的基因组 DNA， 步骤如下 ： 剪取 20mg 尾鳍于 1.5ml 离心管中， 加入 570L STE buffer （10mmol/L Tris-Cl, pH=8.0; 100mmol/L EDTA, pH=8.0; 100mmol/L NaCl） 并将组织剪 碎 ； 加入 10L 20mg/ml 的蛋白酶 K 和 20L 20% SDS， 55-56消化 ； 加入 600L 酚 : 氯 仿 : 异戊醇。
13、 （25:24:1） 抽提两次， 13000r/min 离心 5min， 取上清 ； 加入等体积 -20预冷的 无水乙醇， 混匀， 13000r/min 离心 5min， 弃上清， 用 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次， 室温下晾干， 然 后加入 50-100L TE buffer（1mmol/L EDTA， 10mmol/L Tris-HCl， pH=8.0） 溶解 DNA ； 紫 外分光光度计检测DNA浓度， 用TE buffer将其稀释至100g/mL， 并用1%的琼脂糖凝胶电 泳检测 DNA 的完整性 ； DNA 样品存于 -80冰箱中备用 ； （2） PCR 扩增反应及测序 ： 扩增反应。
14、体系为 20L ： 0.5M 引物 （正向引物 5端用荧光染料 HEX 标记） ， 0.2mM dNTP， 1.5mM MgCl2， 1PCR buffer， 1U Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA ； 反应程序 ： 94 5min， 94 30s， 58 30s， 72 30s， 最后延伸 5min ； PCR 产物用 ABI PRISM 3730 DNA 自 动测序仪分离， 片段长度用软件 GeneMapper 根据内标 ROX-500 确定 ； （3） 中性检测 ： 采用如下方法一或方法二检测位点是否中性 ： 方法一是利用软件 BAYESCAN 中的贝叶 斯模拟检测， 界定群体。
15、 - 位点特异性效应对 FST的影响并用 Markov chain Monte Carlo 方 法来评估其后验概率分布 ； 方法二是利用软件 Arlequin 3.5 进行结构性的岛模型分析 ； （4） 群体结构分析 小黄鱼的群体结构利用软件 ARLEQUIN 3.5 通过计算 Wright s F 统计用 pairwise FST 矩阵来评估 ； 为了比较不同类型标记及其遗传结构， 采用 SPSS v16.0 对 pairwise FST矩阵 进行了多维尺度分析 ； 以 isolation by distance 形式用 Mantel tests 检测地理隔离对 小黄鱼遗传结构的影响。 00。
16、09 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 本发明是国内外首次基于选择性分子标记建立的一种小黄鱼群体结构分析新方法， 它 利用来自小黄鱼的BAHCC1基因设计合成的一对特异性引物， 进行PCR反应和测序片段分析 就可以检测出小黄鱼的群体结构， 而中性的分子标记很难检测到洄游性小黄鱼群体间的微 弱遗传差异。 0010 附图说明 0011 图 1 ： 基于选择性分子标记 H16 的小黄鱼群体结构多维尺度 （MDS） 分析图。 0012 BS ： 渤海群体 ； NYS ： 黄海北部群体 ； CYS ： 黄海中部群体 ； SYS ： 黄海南部群体 ； NECS ： 东海北部群体 ； CECS 。
17、： 东海中部群体。 0013 说 明 书 CN 102758024 A 4 3/4 页 5 具体实施方式 0014 下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。 0015 检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记H16， 其序列如SEQ ID NO.1所示。 其引物 序列为 ： H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCA H16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA 检测方法步骤如下 ： （1） 基因组 DNA 的提取 ： 采用酚氯仿法提取小黄鱼分布范围内采集到的32个产卵群体共1104尾小黄鱼个体的 基因组 DNA， 具体步骤如下 ： 剪取 20mg 尾鳍于 1.5ml 离心管中， 。
18、加入 570L STE buffer （10mmol/L Tris-Cl, pH=8.0; 100mmol/L EDTA, pH=8.0; 100mmol/L NaCl） 并将组织剪 碎。加入 10L 20mg/ml 的蛋白酶 K 和 20L 20% SDS， 55-56消化。加入 600L 酚 : 氯 仿 : 异戊醇 （25:24:1） 抽提两次， 13000r/min 离心 5min， 取上清。加入等体积 -20预冷 的无水乙醇， 混匀， 13000r/min 离心 5min， 弃上清， 用 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次， 室温下晾干， 然后加入 50-100L TE buffer（1mm。
19、ol/L EDTA， 10mmol/L Tris-HCl， pH=8.0） 溶解 DNA。 紫外分光光度计检测DNA浓度， 用TE buffer将其稀释至100g/mL， 并用1%的琼脂糖凝胶 电泳检测 DNA 的完整性。DNA 样品存于 -80冰箱中备用。 0016 （2） PCR 扩增反应及测序 ： 扩增反应体系为 20L ： 0.5M 引物 （正向引物 5端用荧光染料 HEX 标记） ， 0.2mM dNTP， 1.5mM MgCl2， 1PCR buffer， 1U Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA。 反应程序 ： 94 5min， 94 30s， 58 30s， 72 30。
20、s， 最后延伸 5min。PCR 产物用 ABI PRISM 3730 DNA 自 动测序仪 （Applied Biosystems） 分离， 片段长度用软件 GeneMapper 根据内标 ROX-500 确 定。 0017 结果表明 ： 选择性分子标记 H16 检测到等位基因大小在 216-256， 杂合度为 0.6332。 0018 （3） 中性检测 ： 采用两种方法检测位点是否中性 ： 一是利用软件 BAYESCAN 中的贝叶斯模拟检测， 界定 群体 - 位点特异性效应对 FST的影响并用 Markov chain Monte Carlo （MCMC） 方法来评估其 后验概率分布。二是。
21、利用软件 Arlequin 3.5 进行结构性的岛模型 （hierarchical island model） 分析。 0019 结果表明 ： BAYESCAN 分析得出位点特异性效应 =3.0859， 后验概率分布 Pr=1.0000 ； hierarchical island model分析得出概率值P-value=0.0000。 两种中性检测 方法都得出 H16 处在显著的选择压力下， 为选择性位点。 0020 （4） 群体结构分析 小黄鱼的群体结构利用软件 ARLEQUIN 3.5 通过计算 Wright s F 统计用 pairwise FST 矩阵来评估。为了比较不同类型标记及其遗。
22、传结构， 采用 SPSS v16.0 对 pairwise FST矩阵 进行了多维尺度 （MDS） 分析。 0021 结果表明 ： 选择性分子标记 H16 检测到整个小黄鱼群体呈现出明显的结构 （FST=0.092， P0.001） ， 东海北部群体和东海中部群体之间存在显著分化， 在其它分布区域 说 明 书 CN 102758024 A 5 4/4 页 6 内属于这两个类群的混合存在 （见附图 1） 。 说 明 书 CN 102758024 A 6 1/1 页 7 SEQUENCE LISTING 中山大学 一种用于检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记及其引物与检测方法 1 PatentIn 。
23、version 3.5 1 378 DNA 小黄鱼 1 caacagaccc agattcatgc atatccatgt cagccagcag ccaacctgct gaagtgtcct 60 tgagcaagac actgaatccc tcccagctct gccaccactg taactgaccc tacagtctga 120 tctgccagca gccgagaaaa ggtgaatttc ccaacgggga tcaaatatca cattattatt 180 acagtatgct acttacaaga catctacagt gcttccttca atcccacaca acggagagtc 240 atatctccat atcactggag caggatgtgt gtgtgcgcgt ctatgtataa ctgtgtgtgt 300 gtgtgttcaa ccacgccgca ccgtatcacc ctccatcatc gtgagctgag gggttgtggt 360 tcctagagaa gcacttta 378 序 列 表 CN 102758024 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102758024 A 8 。