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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510098470.0 (22)申请日 2015.03.05 C07K 14/255(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C07K 16/12(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路 88 号 (72)发明人 焦新安 潘志明 熊丹 宋丽 焦扬 孙林 陈祥 耿士忠 黄金林 殷月兰 (74)专利代理机构 上海光华专利事务所 31219 代理人 郭婧婧 。
2、许亦琳 (54) 发明名称 一种具有抗炎作用的蛋白及其制备与应用 (57) 摘要 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种具 有抗炎作用的蛋白及其制备与应用。所述蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示， 所述蛋白不会产 生过度的免疫排斥反应 ； 其次， 所述蛋白对 TLR 信 号通路的干扰作用存在剂量依赖关系， 通过降低 作用浓度使其产生适度的抑制， 但却不损害宿主 的防御能力， 以避免过度抑炎反应造成的副作用 ； 所述蛋白与临床所应用的抗炎症因子抗体不同的 是， 它们针对的不是单一一种致炎因子， 而是多种 因子、 多条途径， 利于损伤组织的修复。 (51)Int.Cl. (19)中华人。
3、民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表8页 附图2页 CN 105985414 A 2016.10.05 CN 105985414 A 1/1 页 2 1.一种分离的蛋白， 其特征在于， 所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。 2.一种分离的多核苷酸， 其特征在于， 所述多核苷酸编码如权利要求 1 所述的蛋白。 3.根据权利要求 2 所述的分离的多核苷酸， 其特征在于， 所述多核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。 4.一种表达载体， 其含有如权利要求 2 或 3 所述多核苷酸。 5.一种宿主细胞， 其被权利要求 4 所述的表达载。
4、体转化。 6.一种制备如权利要求 1 所述的蛋白的方法， 包括如下步骤 ： 1) 在适合权利要求 1 所述的蛋白表达的条件下， 培养权利要求 5 所述的宿主细胞 ； 2) 从培养物中分离出权利要求 1 所述的蛋白。 7.一种抗体， 其特征在于， 所述抗体与权利要求 1 所述的蛋白特异性结合。 8.如权利要求1所述的分离的蛋白、 权利要求2所述的分离的多核苷酸、 权利要求4所 述的表达载体、 权利要求 5 所述的宿主细胞在制备抗炎药物中的用途。 9.根据权利要求 8 所述的用途， 其特征在于， 所述用途中所述抗炎药物具体是指干扰 TLR 信号通路并抑制炎性细胞因子分泌的药物。 10.一种抗炎药物。
5、组合物， 其特征在于， 所述组合物包含权利要求 1 所述的分离的蛋 白、 权利要求 2 所述的分离的多核苷酸、 权利要求 4 所述的表达载体或权利要求 5 所述的宿 主细胞。 权 利 要 求 书 CN 105985414 A 2 1/6 页 3 一种具有抗炎作用的蛋白及其制备与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种具有抗炎作用的蛋白及其制备与应用。 背景技术 0002 沙门菌是一类人兽共患的肠道致病菌， 在全球范围内每年大约有 13 亿人因感 染沙门菌而导致胃肠炎、 腹泻和伤寒等疾病。天然免疫系统作为机体第一道免疫防线， 可以通过模式识别受体 (Pattern rec。
6、ognition receptors,PRRs) 识别病原相关分子模 式 (Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)， 激活核转录因子 B(Nuclear factorB,NFB) 信号通路， 诱导产生前炎性细胞因子和抗菌肽来抵抗病原微生物的入 侵。 0003 NFB 通路的激活对防御病原微生物的侵袭尤为重要， 然而， 信号的异常活化可 能会引起炎性和自身免疫疾病或癌症。许多感染性疾病、 自身免疫病和恶性肿瘤都会引发 机体产生过度炎症反应， 因而靶向天然免疫应答和信号传递的药物具有潜在的医疗前景。 在革兰氏阴性菌引起的败血症病人中， TLR4 。
7、拮抗剂可用于预防因 LPS 引起的内毒素性休 克， 目前已有两种脂质 A 类似物 TAK-242 和 Eritoran 被批准用于治疗败血病人的临床试 验。TLRs 拮抗剂可用于治疗自身免疫性疾病， 尤其是系统性红斑狼疮 (Systemic lupus erythematosus,SLE)。TLR7 和 TLR9 参与了机体自身抗体的产生， 并靶向内源性 TLR 配体， 同时也是 pDC 介导的型 IFN 产生所必需的。靶向 TLRs 的治疗学方法可能会有效地抑制 自身免疫疾病的发展和恶化。 0004 细菌逃逸 TLRs-NFB 信号通路的机制为未来抗炎性药物的研究提供了理论基 础。微生物已经。
8、进化出相应的策略来抑制机体的炎性应答， 这些细菌效应分子本身或经修 饰后或许会具有治疗药物的潜能。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种具有抗炎作用的蛋白及其制备与应用， 该蛋白能够干扰 TLR 信号通路， 并抑制炎性细胞因子的分泌， 具有抑制炎症反应的功能。 0006 本发明一方面提供了一种分离的蛋白， 所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所 示， 具体为 ： 0007 MSISTTMSNINRIQKDIASLQKQLSDEQRKEAQLSGKINQIKRSVTKSTSLSTLNSKMSEISRHKNDIS RCNSKKADINKKITAKTGDLHRYQLQLIKEQEN。
9、DQKKRIAAQKKLEKEQLDYQKKITRELKSQKRAISPSHKFNRPV INKSDETEDITESYDVFISHATEDKDSFVRPLAELLRAKGINVWYDEFSLGWGKSLRKTIDYGLANSRFGVVVLSKS FIKKDWTEYELNGLTAREMSGENQVILPIWHEVSKSDILKFSPTLVDKMALNTSINTIDEIAEQLESLLK。 0008 在本发明的实施例中， 将本发明的蛋白， 取名为 TcpS。 0009 本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸， 其编码所述蛋白。 0010 本发明的多核苷酸可以是 DNA 形式或 RNA 形式。DNA。
10、 形式包括 cDNA、 基因组 DNA 或人工合成的 DNA。DNA 可以是单链的或是双链的。 说 明 书 CN 105985414 A 3 2/6 页 4 0011 进一步的， 所述多核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示， 具体为 ： ATGTCTATAAGCACCACA ATGTCAAATATCAACAGAATACAAAAAGACATTGCTAGTCTACAAAAACAACTTTCTGATGAGCAGCGTAAAGAGGC CCAACTTTCAGGAAAAATCAATCAAATAAAGCGTAGCGTCACTAAGTCAACGTCTTTAAGCACATTGAATTCCAAAA TGT。
11、CAGAGATCTCTCGTCATAAAAATGATATTTCAAGATGTAACTCTAAAAAAGCAGATATTAATAAAAAAATAACA GCAAAAACTGGAGACTTACACCGTTATCAATTACAACTCATTAAAGAGCAAGAGAATGACCAGAAAAAAAGAATTGC TGCACAGAAGAAACTTGAAAAAGAACAATTAGATTACCAGAAGAAAATCACACGAGAATTGAAATCGCAGAAAAGGG CAATATCTCCAAGCCATAAATTCAATCGTCCAGTCATCAACAAATCTGATGAGACAGAAGATATTACAG。
12、AGAGTTAT GATGTTTTTATCTCTCATGCAACAGAAGATAAAGATAGTTTTGTCCGTCCCCTTGCTGAGTTGTTAAGAGCAAAAGG GATAAATGTATGGTATGACGAATTCTCTTTAGGCTGGGGTAAAAGTCTACGTAAGACAATCGATTATGGATTAGCAA ATTCTCGGTTTGGAGTTGTTGTTTTATCTAAATCCTTTATCAAAAAGGACTGGACAGAGTATGAATTAAATGGTTTG ACTGCTAGAGAGATGAGCGGTGAAAACCAAGTAATACTGCCTATCTGGCACGAAGTA。
13、TCTAAATCTGATATTTTAAA ATTCAGCCCTACACTAGTAGATAAAATGGCATTAAATACATCGATAAATACCATTGATGAAATTGCTGAACAGCTTG AATCATTATTGAAATGA。 0012 本发明第三方面提供了一种表达载体， 其含有前述多核苷酸。 0013 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组 DNA 技术、 DNA 合成技术等。可将编码所述蛋白的 DNA 有效连接到表达载体中的适当启动子上， 以指导 mRNA 合成， 进而表达蛋白。 0014 较佳的， 所述表达载体为真核表达载体。进一步的， 所述真核表达载。
14、体可在 HEK293T 和 RAW264.7 真核细胞内稳定表达， 如真核载体 pCMV-Myc 等。 0015 本发明第四方面提供了一种宿主细胞， 其被前述表达载体所转化。 0016 宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞 ； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞 ； 或是高 等真核细胞， 如哺乳动物细胞。代表性例子有 ： 大肠杆菌， 链霉菌属 ； 鼠伤寒沙门菌的细菌 细胞 ； 真菌细胞如酵母 ； 植物细胞 ； 果蝇 S2 或 Sf9 的昆虫细胞 ； CHO,COs.293 细胞、 或 Bowes 黑素瘤细胞的动物细胞等。 0017 本发明的实施例中， 采用的宿主细胞为 HEK293T 和 RAW2。
15、64.7 细胞。 0018 本发明第五方面提供了所述蛋白的制备方法， 包括下列步骤 ： 0019 1) 在适合表达所述蛋白的条件下， 培养上述被转化的宿主细胞 ； 0020 2) 从培养物中分离出所述蛋白。 0021 从培养物中分离出具有抗炎作用的蛋白的方法可采用镍柱纯化法提取。 0022 本发明第六方面， 提供了与上述蛋白特异结合的抗体。 0023 本发明第七方面， 提供了检测样品中是否存在所述蛋白的方法， 所述方法包括 ： 将 样品与所述蛋白的特异性抗体接触， 观察是否形成抗体复合物， 形成了抗体复合物就表示 样品中存在所述蛋白。 0024 本发明第八方面， 提供了本发明前述分离的蛋白、 。
16、前述分离的多核苷酸、 前述表达 载体、 或前述宿主细胞在制备抗炎药物中的用途。 0025 较佳的， 所述用途中抗炎药物具体是指干扰 TLR 信号通路并抑制炎性细胞因子分 泌的药物。 0026 本发明第九方面， 提供了一种抗炎药物组合物， 所述组合物包含本发明前述分离 的蛋白、 前述分离的多核苷酸、 前述表达载体、 或前述宿主细胞。 说 明 书 CN 105985414 A 4 3/6 页 5 0027 进一步的， 所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。 0028 本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体或赋形剂包括 ( 但不限于 ) 乳糖、 玉米淀粉或其衍生物、 滑石、 植物油。
17、、 蜡、 脂肪、 多羟基化合物例如聚乙二醇、 水、 蔗糖、 乙醇、 甘油， 诸如此类， 各种防腐剂、 润滑剂、 分散剂、 矫味剂。保湿剂、 抗氧化剂、 甜味剂、 着 色剂、 稳定剂、 盐、 缓冲液诸如此类也可加入其中， 这些物质根据需要用于帮助配方的稳定 性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。 0029 进一步的， 所述抗炎药物组合物的抗炎活性成分含有所述蛋白。 0030 较佳的， 所述蛋白为所述抗炎药物组合物的唯一抗炎活性成分。 0031 本发明的有益效果为 ： 0032 TcpS作为一种小分子蛋白， 不会产生过度的免疫排斥反应 ； 其次， TcpS对TL。
18、R信号 通路的干扰作用存在剂量依赖关系， 通过降低作用浓度使其产生适度的抑制， 但却不损害 宿主的防御能力， 以避免过度抑炎反应造成的副作用 ； 而同样具有抑炎功能的 TcpB， 其对 NF-B信号通路的抑制作用有时却是彻底的(图4)， 是不适合药物的设计的。 TcpS与临床 所应用的抗炎症因子抗体不同的是， 它们针对的不是单一一种致炎因子， 而是多种因子、 多 条途径， 利于损伤组织的修复。 附图说明 0033 图 1 ： 为原核表达 TcpS 蛋白的 SDS-PAGE 图片。其中， 泳道 M 为 ： 蛋白 Marker ； 泳 道 1、 2 和 3 为 ： TcpS 蛋白 (36kDa 处。
19、有目的条带 )。 0034 图2 ： 为Western blotting鉴定肠炎沙门菌C50041表达并分泌TcpS图片。 其中， 泳道 M 为 ： 蛋白 Marker ； 泳道 1 为 ： 细菌 C50041 培养后菌体 ； 泳道 2 为 ： 细菌 C50041 培养 后上清 ； 泳道 3 为 ： 细菌与细胞共培养后菌体， 泳道 4 为 ： 细菌与细胞共培养后上清。一抗 为制备的 TcpS 多抗血清 (1:500)。 0035 图3 ： 为Western blotting鉴定真核表达质粒pTcpS在细胞中的表达。 其中， pMyC 表示 HEK293T(pMyC)， pMyC-tcpS 表示。
20、 HEK293T(pMyC-tcpS)。一抗为制备的 TcpS 多抗血清 (1:500)。 0036 图 4 ： 为 TcpS 靶向 TLR2、 TLR4 和 TLR5 介导的 NFB 的活化。共转染 NF-B luciferase reporter、 pTLR4+pMD2( 或 pTLR2、 pTLR5) 和 pTcpS( 或 pTcpB) 到 HEK293T 细 胞中， 转染24h后1g/mL Pam3CSK4(或100ng/mL LPS、 100ng/mL FliC)进行刺激， 刺激5h 后检测荧光素酶活性， 其中 pTcpB 为阳性对照。 0037 图 5 ： 为在 RAW264.7 。
21、细胞中 TcpS 可抑制不同 TLRLs 诱导的 NF-B 的活化。共转 染 NF-B luciferase reporter 和 pTcpS 到 RAW264.7 细胞中， 转染 24h 后分别用 100ng/ mL LPS(TLR4L)， 2.5g/mL R848(TLR7L)， 2M CpG(TLR9L)刺激。 刺激后5h检测荧光素酶 活性。 0038 图 6 ： 为 TcpS 抑制炎性细胞因子 IL-8 的分泌。共转染 pTLR4、 pMD2 和 pTcpS 到 HEK293T 细胞中， 转染 24h 后 100ng/mL LPS 进行刺激， 刺激 5h 后 ELISA 试剂盒 (BD。
22、 公司 ) 检测 IL-8 水平。 0039 图 7 ： 为 TcpS 抑制炎性细胞因子的产生。共转染 pTLR4、 pMD2 和 pTcpS 到 HEK293T 细胞中， 转染24h后100ng/mL LPS进行刺激， 刺激5h后qRT-PCR检测炎性下拨因子IL-1、 说 明 书 CN 105985414 A 5 4/6 页 6 IL-8、 IL-17A 和 TNF- 的转录水平。其中， (A) 为 ： IL-1 ； (B) 为 ： IL-8 ； (C) 为 ： IL-17A ； (D) 为 ： TNF-， 内参为 -actin。 具体实施方式 0040 在进一步描述本发明具体实施方式之前。
23、， 应理解， 本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案 ； 还应当理解， 本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围。 0041 当实施例给出数值范围时， 应理解， 除非本发明另有说明， 每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义， 本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。 除实施例中使用的具体方法、 设备、 材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载， 还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、 设备、 材料相似或等同的现有技术的任何方法、 设备和材料来。
24、实 现本发明。 0042 除非另外说明， 本发明中所公开的实验方法、 检测方法、 制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、 生物化学、 染色质结构和分析、 分析化学、 细胞培养、 重组 DNA 技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明， 具体可参见 Sambrook 等 MOLECULAR CLONING ： A LABORATORY MANUAL， Second edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989and Third edition， 2001 ； Ausubel 等， CURRENT PROTOCOLS。
25、 IN MOLECULAR BIOLOGY， John Wiley&Sons， New York， 1987and periodic updates ； the series METHODS IN ENZYMOLOGY， Academic Press， San Diego ； Wolffe， CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION， Third edition， Academic Press， San Diego， 1998 ； METHODS IN ENZYMOLOGY， Vol.304， Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe。
26、， eds.)， Academic Press， San Diego， 1999 ； 和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY， Vol.119， Chromatin Protocols(P.B.Becker， ed.)Humana Press， Totowa， 1999 等。 0043 实施例 1Western blotting 技术鉴定肠炎沙门菌 C50041 表达并分泌 TcpS 0044 (1) 构建原核表达质粒 pCold-tcpS 0045 首先， 设计带有 KpnI 和 XbaI 双酶切位点的引物 ： 0046 正向引物 ： 5 -GGGGGGTACCATGT。
27、CTATAAGCACCACAATG-3 SEQ ID NO:3 0047 反向引物 ： 5 -GCTCTAGATCATTTCAATAATGATTCAAGC-3 SEQ ID NO:4 0048 然后， 从肠炎 C50041 菌株中提取基因组为模板， 以 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4 的序列为扩增引物 PCR 扩增 tcpS( 序列如 SEQ ID NO:2 所示 ) 基因后进行琼脂糖凝胶电泳 回收， 将tcpS产物和pCold载体分别进行双酶切并回收， 使用T4DNA连接酶16连接过夜， 次日转化DH5， 并涂布抗性LB固体培养基进行筛选。 挑取阳性克隆进行鉴定，。
28、 测序(南京 金斯瑞生物科技有限公司 ) 正确后得到原核表达质粒 pCold-tcpS。 0049 (2) 制备 TcpS 多抗血清 ： 0050 将质粒 pCold-tcpS 转化 BL21(DE3) 大肠杆菌表达菌株， 15 0.5mM IPTG 诱导表 达， 经镍柱纯化后得到 TcpS 蛋白 ( 如图 1 所示 )， 与弗氏佐剂等体积混合后免疫 BALB/c 小 鼠获得抗 TcpS 多抗血清。 0051 (3)Western blotting 技术鉴定肠炎沙门菌 C50041 表达并分泌 TcpS 说 明 书 CN 105985414 A 6 5/6 页 7 0052 将 C50041 。
29、与 RAW264.7 细胞共培养后 5h， 分别收集上清和细胞 ； C50041 过夜培 养后离心收集上清和菌体。使用 TcpS 多抗血清 (1:500) 鉴定 TcpS 的表达情况， Western blotting 结果显示共培养后上清可检测到 TcpS， 表明肠炎 C50041 菌株是可表达并分泌 TcpS 蛋白的， 且共培养能促进沙门菌 TcpS 的表达 ( 如图 2 所示 )， 表明 tcpS 具有编码蛋白 功能的基因。 0053 实施例 2TcpS 可干扰 TLR 信号通路并抑制炎性细胞因子分泌 0054 (1)TcpS 可抑制 TLR2、 TLR4 和 TLR5 介导的 NF-B。
30、 的活化 0055 1) 构 建 真 核 表 达 质 粒 pCMV-Myc-tcpS、 pCMV-Myc-tcpB 和 pCMV-MD2， pcDNA3.1-TLR5 为实验室保存质粒， 购买 pCMV-GFP-TLR2 和 pCMV-GFP-TLR4(Origene 公 司 ) ： 0056 具体的， 真核表达质粒 pCMV-Myc-tcpS 的构建方法为 ： 0057 首先， 设计带有 SalI 和 KpnI 双酶切位点的引物如下 ： 0058 正向引物 ： 5 -ACGCGTCGACCATGTCTATAAGCACCACAATG-3 SEQ ID NO:5 0059 反向引物 ： 5 -C。
31、CCCGGTACCTCATTTCAATAATGATTCAAGC-3 SEQ ID NO:6 0060 然后， 从肠炎 C50041 菌株中提取基因组为模板， 以 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 的序列为扩增引物 PCR 扩增 tcpS( 序列如 SEQ ID NO:2 所示 )， 将 tcpS 片段和 pCMV-Myc 载 体分别经SalI和KpnI双酶切后进行连接， 并转化大肠杆菌DH5， 筛选阳性克隆， 经酶切和 测序鉴定正确后获得重组质粒 pCMV-Myc-tcpS。 0061 具体的， 真核表达质粒 pCMV-Myc-tcpB 的构建方法为 ： 0062 首。
32、先， 设计带有 SalI 和 KpnI 双酶切位点的引物如下 ： 0063 正向引物 ： 5 -ACGCGTCGACCATGTCTAAAGAGAAACAAGCCCAATC-3 SEQ IDNO:7 0064 反向引物 ： 5 -CCCCGGTACCTCAGATAAGGGAATGCAGTTCTTTCG-3 SEQ ID NO:8 0065 然后， 以布鲁氏菌S19基因组(GenBank:CP000887)为模板， 以SEQ ID NO ： 7和SEQ IDNO ： 8 的序列为扩增引物 PCR 扩增 tcpB， 所述 tcpB 的基因序列如 SEQ ID NO:11 所示， 具 体为 ： 006。
33、6 ATGTCTAAAGAGAAACAAGCCCAATCAAAAGCCCACAAAGCCCAACAAGCTATCAGTTCAGCAAAATCA CTCTCCACACAGAAAAGCAAAATGTCAGAGCTTGAGCGCGCCACGAGGGATGGTGCCGCGATTGGCAAGAAGCGAGC GGATATCGCCAAAAAAATTGCCGATAAGGCAAAACAGTTAAGCTCCTATCAGGCTAAGCAATTCAAAGCTGATGAGC AGGCTGTTAAAAAGGTCGCGCAGGAGCAAAAGCGTTTATCAGATGAGCGAACCAAGCATGAAGCTTTCATCA。
34、AACAA TCATTGAGCTCCATGCGAACAACTGCGAGCGCGACTATGGAAGCAGAAGAAGAATACGATTTCTTCATATCACATGC GAGCGAAGACAAAGAAGCATTCGTTCAGGATCTAGCCGCCGCGCTTCGCGACCTAGGAGCTAAGATTTTCTATGACG CATATACGTTGAAGGTCGGTGACAGCCTTCGGCGCAAAATCGATCAGGGGCTCGCGAACTCCAAATTTGGCATAGTT GTTCTATCGGAACACTTTTTTAGCAAGCAATGGCCCGCAAGAGAATTAGATGGACTGACG。
35、GCAATGGAAATTGGCGG ACAGACGCGAATATTGCCGATCTGGCATAAAGTTTCCTACGATGAAGTTCGGCGTTTCAGTCCCTCATTGGCCGACA AAGTGGCACTGAACACATCGCTAAAGAGCGTGGAAGAAATCGCGAAAGAACTGCATTCCCTTATC)，将 tcpB 片 段和pCMV-Myc载体分别经SalI和KpnI双酶切后进行连接， 并转化大肠杆菌DH5， 筛选阳 性克隆， 经酶切和测序鉴定正确后获得重组质粒 pCMV-Myc-tcpB。 0067 具体的， 真核表达质粒 pCMV-MD2 的构建方法为 ： 0068 。
36、首先， 设计带有 SalI 和 KpnI 双酶切位点的引物如下 ： 说 明 书 CN 105985414 A 7 6/6 页 8 0069 正向引物 ： 5 -ACGCGTCGACCATGTTGCCATTTATTCTCTTTTCGAC-3 SEQ ID NO:9 0070 反向引物 ： 5 -CCCCGGTACCCTAATTGACATCACGGCGGTGAATG-3 SEQ ID NO:10 0071 然后， 以RAW264.7细胞基因组为模板， 以SEQ ID NO ： 9和SEQ ID NO ： 10的序列为 扩增引物 PCR 扩增 MD2(GenBank:AB018550)， 将 MD2。
37、 片段和 pCMV 载体分别经 SalI 和 KpnI 双酶切后进行连接， 并转化大肠杆菌 DH5， 筛选阳性克隆， 经酶切和测序鉴定正确后获得 重组质粒 pCMV-MD2。 0072 具 体 的， pcDNA3.1-TLR5 质 粒 来 自 实 验 室 保 存，为 之 前 构 建 (Xiong et al.Molecular cloning and functional analysis of duck Toll-like receptor 5.Res Vet Sci,2014,97(1):43-45.)。 0073 2) 共转染 NF-B luciferase reporter(200ng。
38、/mL)、 pTLR4(5ng/mL)+pMD2(5ng/ mL)( 或 pTLR2、 pTLR5) 和 pTcpS( 或 pTcpB) 到 HEK293T 细 胞 中，转 染 24h 后 1g/mL Pam3CSK4( 或 100ng/mL LPS、 100ng/mL FliC) 进行刺激， 刺激 5h 后检测荧光素酶活性 (Bright-GloTM Luciferase Assay System,Promega)， 同时， Western blotting 检测 TcpS 的表达情况。 0074 3) 结果表明 TcpS 在 HEK293T 细胞中成功表达 ( 如图 3 所示 )， Tcp。
39、S 可以显著抑 制 TLR2(32 -78 )、 TLR4(81 -91 ) 和 TLR5(71 -99 ) 介导的 NF-B 的活化， 且 这种抑制作用存在剂量依赖关系 ( 如图 4 所示 )。 0075 (2) 在 RAW264.7 细胞中 TcpS 可抑制不同 TLRLs 诱导的 NF-B 的活化 0076 共转染 NF-B luciferase reporter 和 pTcpS 到 RAW264.7 细胞中， 转染 24h 后 分别用 100ng/mLLPS(TLR4L)， 2.5g/mL R848(TLR7L)， 2M CpG(TLR9L) 刺激。刺激后 5h 检测荧光素酶活性。结果。
40、表明相对空白组， 转染 pTcpS 组在不同配体的刺激下均显著抑制 了 NFB 的活化 ( 抑制率分别为 81 -99， 56 -99， 49 -89 )， 且抑制作用存在剂 量依赖关系 ( 如图 5 所示 )。 0077 (3)TcpS 可抑制炎性细胞因子的表达 0078 为直接检测 TcpS 对炎性细胞因子的影响， 我们共转染 pTLR4、 pMD2 和 pTcpS 到 HEK293T 细胞中， 转染 24h 后 100ng/mL LPS 进行刺激， 刺激 5h 后 ELISA 试剂盒 (BD 公司 ) 检测培养基上清 IL-8 分泌水平， 同时 Trizol 裂解细胞提取 RNA， 去 。
41、DNA 后反转录成 cDNA， 荧光定量 PCR(qRT-PCR) 检测炎性因子 IL-1、 IL-8、 IL-17A 和 TNF- 的转录水平。结果 表明同 NF-B 活性检测结果一致， TcpS 可显著抑制炎性细胞因子 IL-1(37 -45 )、 IL-8(42 -83 )、 IL-17A(14 -41 ) 和 TNF-(71 -73 ) 的 产 生 ( 内 参 为 -actin)， 且这种抑制作用存在剂量依赖关系 ( 如图 6、 图 7 所示 )。 0079 以上所述， 仅为本发明的较佳实施例， 并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员， 在不脱。
42、离本发明方法的前提下， 还将可以做出 若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。 凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更 动、 修饰与演变的等同变化， 均为本发明的等效实施例 ； 同时， 凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、 修饰与演变， 均仍属于本发明的技术方案的范围 内。 说 明 书 CN 105985414 A 8 1/8 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 105985414 A 9 2/8 页 10 0003 序 列 表 CN 105985414 A 10 3/8 。
43、页 11 0004 序 列 表 CN 105985414 A 11 4/8 页 12 0005 序 列 表 CN 105985414 A 12 5/8 页 13 0006 序 列 表 CN 105985414 A 13 6/8 页 14 0007 序 列 表 CN 105985414 A 14 7/8 页 15 0008 序 列 表 CN 105985414 A 15 8/8 页 16 序 列 表 CN 105985414 A 16 1/2 页 17 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 105985414 A 17 2/2 页 18 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 105985414 A 18 。