《防治植物青枯病和根肿病的生防制剂及其制备方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《防治植物青枯病和根肿病的生防制剂及其制备方法和应用.pdf（15页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102757917 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757917 A *CN102757917A* (21)申请号 201210254827.6 (22)申请日 2012.07.20 CCTCC NO:M209145 2009.07.13 201110446456.7 2011.12.28 CN C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 1/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市。
2、西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 周青 谢关林 苏婷 刘宝平 朱勃 李斌 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (54) 发明名称 防治植物青枯病和根肿病的生防制剂及其制 备方法和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种防治植物青枯病和根肿 病的生防制剂及其制备方法和应用。该生防制 剂的制备方法包括 ： 将经活化的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 接种到培养液中， 于 25-45发酵培养 6-120h ； 其中， 以体积 1L 计， 所述的培养液含有 以下组分 ： 蛋白胨 3-15g， 牛肉浸膏 0-3g， 葡萄糖 0-5g， 酵母粉 0-5g，。
3、 NaCl 0-8g， 余量为水 ； 培养液 的 pH 为 5.5-9.0。本发明利用解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 在适宜发酵培养基和培养条件下通过 微生物发酵制备生防制剂， 所制得的生防制剂对 不同生化型的青枯菌和根肿菌均有较好防效， 能 显著降低青枯病和根肿病的病害发生率和病情严 重度， 适合规模化生产。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种生防制剂的制备方法， 包括 。
4、： 将经活化的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)ZJUB2008 接种到培养液中， 于 25-45发酵培养 6-120h ； 其中， 所述解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 的保藏号为 CCTCCNO ： M209145 ； 以体积 1L 计， 所述的培养液含有以下组分 ： 蛋白胨 3-15g， 牛肉浸膏 0-3g， 葡萄糖 0-5g， 酵母粉 0-5g， NaCl 0-8g， 余量为水 ； 培养液的 pH 为 5.5-9.0。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 以体积1L计， 所述的培养液含有以下 组分 ： 蛋白胨 10-15g， 牛肉浸膏。
5、 1-3g， 葡萄糖 0-1g， 酵母粉 0-3g， NaCl 6-8g， 余量为水 ； 培 养液的 pH 为 7.5-8.0。 3. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 所述的接种为 ： 将解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 接种到种子培养液中， 培养获得浓度为 108-109CFU/ml 的种子液， 将种子液接种到 所述的培养液中， 接种量以体积百分比浓度计为 1-3。 4. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 所述的发酵培养温度为 35-40。 5. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 所述的发酵培养时间为 24-48h。 6. 一种采用如权利要求。
6、 1-5 任一所述的制备方法制得的生防制剂。 7. 如权利要求 6 所述的生防制剂在防治植物青枯病中的应用。 8. 根据权利要求 7 所述的应用， 其特征在于， 所述的植物为番茄、 茄子、 马铃薯或生姜。 9. 如权利要求 6 所述的生防制剂在防治植物根肿病中的应用。 10. 根据权利要求 9 所述的应用， 其特征在于， 所述的植物为十字花科植物。 权 利 要 求 书 CN 102757917 A 2 1/9 页 3 防治植物青枯病和根肿病的生防制剂及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及植物病害防治领域， 尤其涉及一种防治植物青枯病和根肿病的生防制 剂及其制备方法和应用。 背景技术。
7、 0002 作物细菌性青枯病是由青枯劳尔氏菌 (Ralstonia solanacearum) 引起的一种系 统侵染的毁灭性土传病害， 俗称 “植物瘟病” 。青枯劳尔氏菌寄主广泛， 可侵染 44 个科的数 百种植物。目前， 细菌性青枯病的防治是世界公认的一大难题， 它广泛分布于世界各地， 在 我国南方省市发生严重， 尤其在浙江， 近年来不但茄科、 瓜类受害， 大面积发生的桑青枯病 更对蚕业生产造成严重损失。 0003 我国从 20 世纪 90 年代开始进行青枯病的生物防治制剂研究， 何礼远和康耀卫等 利用青枯菌无毒菌株和荧光假单胞菌诱导花生产生抗病性 ( 何礼远， 康耀卫 . 利用青枯菌 无毒。
8、菌株和荧光假单胞菌诱导花生产生抗病性 . 植物保护学报， 1990， 17(2) ： 113-116)， 杨 合同等利用芽孢杆菌防治生姜青枯病取得了较好的效果(杨合同， 庞定远， 任欣正.姜瘟病 生物防治试验初报 . 山东科学， 1990， 3(4) ： 42-46)。但国内外现有生防制剂均为单一的活 菌体， 只针对某一生化型。而 Hayward 根据青枯菌对乳糖、 麦芽糖、 纤维二糖和甘露醇、 甜 醇、 山梨醇氧化能力的差异， 把青枯菌区分为 4 个生化型， 华静月和何礼远认为还存在生化 型 V( 华静月， 何礼远 . 我国植物青枯菌的生化型和其它生理差异 . 植物保护学报， 1984， 1。
9、1(1) ： 43-50)。青枯菌的生化型多样性给病害防治增加了很大的难度。 0004 十字花科作物是我国最重要的油料和蔬菜作物， 种植面积 3.75 亿亩， 其中油菜面 积 1.02 亿亩， 十字花科蔬菜 2.73 亿亩。根肿病是十字花科作物上重要的土传病害， 由芸苔 根肿菌 (Plasmodiophora brassicae) 侵染所致， 危害面积约 6000 万亩， 平均产量损失达 2030， 严重田块产量损失达60以上， 甚至绝收， 每年导致油菜经济损失约10亿元、 蔬菜经济损失约 200 亿， 极大地制约了油料和蔬菜产业的持续稳定发展及农民增收。但对 于根肿病的防治， 尚缺乏高效、 。
10、低毒、 低残留、 低成本的化学药剂 ； 在农业防治方面， 研究不 够全面系统， 存在不少弊端。 0005 苏婷等从不同生态环境的植物根际土壤中筛选获得一株能防治多个青枯病生化 型、 防效稳定、 具有商品竞争力的生防菌 ( 苏婷， 路梅， 周青， 等 . 抗不同生化型青枯菌的生 防菌筛选鉴定及其活性分析 . 植物保护学报， 2010， 37(5) ： 431-435)， 探讨进一步提高该菌 株对植物青枯病的生防效果， 对其规模化生产应用具有重要意义。 同时， 探讨该生防菌对其 它植物病害的防治有利于该菌株的推广应用。 发明内容 0006 本发明提供了一种生防制剂的制备方法， 利用解淀粉芽孢杆菌 。
11、ZJUB2008 在适宜 的发酵培养基和发酵培养条件下通过微生物发酵制备生防制剂， 工艺简单， 菌体生长代谢 旺盛， 产拮抗物质较多。 说 明 书 CN 102757917 A 3 2/9 页 4 0007 一种生防制剂的制备方法， 包括 ： 将经活化的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)ZJUB2008 接种到培养液中， 于 25-45发酵培养 6-120h。 0008 所述的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 已保藏， 保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的 中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏日期为 2009 年 7 月 13 日， 保藏编号为 CC。
12、TCC NO ： M209145。 苏婷等公开了该菌株的筛选和鉴定， 该菌株为从浙江省杭州市、 海南省儋州市、 云 南省思茅地区镇源县、 河南省南阳市卧龙区等不同生态环境的植物根际土壤中分离并筛选 得到的， 经鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌， 对不同生化型的青枯菌均具有一定的防治效果 (苏婷， 路梅， 周青， 等.抗不同生化型青枯菌的生防菌筛选鉴定及其活性分析.植物保护学 报， 2010， 37(5) ： 431-435)。 0009 以体积 1L 计， 所述的培养液含有以下组分 ： 蛋白胨 3-15g， 牛肉浸膏 0-3g， 葡萄糖 0-5g， 酵母粉 0-5g， NaCl 0-8g， 余量为水。
13、 ； 培养液的 pH 为 5.5-9.0。 0010 优选地， 以体积 1L 计， 所述的培养液含有以下组分 ： 蛋白胨 10-15g， 牛肉浸膏 1-3g， 葡萄糖 0-1g， 酵母粉 0-3g， NaCl 6-8g， 余量为水 ； 培养液的 pH 为 7.5-8.0。 0011 更优选地， 以体积1L计， 所述的培养液含有以下组分 ： 蛋白胨10g， 牛肉浸膏1g， 酵 母粉 1g， NaCl 8g， 余量为水 ； 培养液的 pH 为 7.5。不同配方的培养液对微生物的生长、 代谢 有较大影响， 使用常规 LB 培养基， 该菌株能生长， 但采用本发明提供的培养液用于解淀粉 芽孢杆菌 ZJU。
14、B2008 的发酵培养， 更有利于抑菌物质的产出。蛋白胨作为主要碳源已能满足 菌株生长所需， 葡萄糖作为培养基中的另一种碳源， 浓度过高反而会使微生物过度生长， 影 响代谢和次级代谢产物的生成 ； 芽孢杆菌生长时需要含氮物质， 特别是需要蛋白质原料和 游离氨基酸的参与代谢才能进行(林同香， 林益， 林尾妹.苏云金杆菌和培养基氨基酸的比 较分析 . 福建农业大学学报， 1995， 24(1) ： 45-48) ； 牛肉浸膏不仅是重要的氮源， 而且含有 多肽、 氨基酸、 有机酸、 糖类、 矿物质营养和维生素等， 其含量变化能大大影响发酵液的抑菌 活性 ； 酵母粉作为另一种氮源， 少量的酵母粉可以丰。
15、富氮源来源， 但过量的酵母粉会影响菌 株对蛋白胨和牛肉浸膏中氮元素的吸收利用 ； NaCl 作为无机盐， 高于常规 LB 培养基的浓度 能促进菌株产生更多的抑菌物质。 0012 所述的接种可以为 ： 将解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 接种到种子培养液中， 培养获得 浓度为 108-109CFU/ml 的种子液， 将种子液接种到所述的培养液中， 接种量以体积百分比浓 度计优选为 0.1-15， 更优选为 1-3， 最优选为 3。 0013 摇瓶中装液量不同会影响发酵时的通气量。为了提供充足的通气量， 同时保证一 定的菌体培养量， 以体积百分比浓度计， 所述的培养液在摇瓶中的装液量优选为 10-。
16、80 ； 更优选为 60-70 ； 最优选为 70。 0014 所述的发酵培养温度优选为35-40； 更优选为35， 该温度下最利于菌体的生长 和代谢。 0015 所述的发酵培养时间优选为24-48h ； 更优选为24h。 该培养时间下， 菌体生物量较 大， 且抑菌物质分泌较多 ； 发酵时间过长， 不但抑菌物质无显著增加， 而且还会影响生产效 益。 0016 所述的培养液接种后， 可以置于摇床中发酵培养， 摇床转速为 150-180r/min ； 优 选为 160r/min， 这样更有利于菌体的分散和生长。 0017 本发明提供了一种采用上述制备方法制得的生防制剂， 该生防制剂含有较高浓度 说。
17、 明 书 CN 102757917 A 4 3/9 页 5 的抑菌物质， 可以直接用于浇灌植物， 对不同生化型的青枯菌和根肿菌均有较好的防效。 0018 本发明还提供了所述的生防制剂在防治植物青枯病中的应用。试验证明， 该生防 制剂用于植物青枯病的防治， 取得了比已公开文献更好的效果， 防治效果达 88， 根茎鲜重 比也从 0.11 上升至 0.14， 且优于目前常用的青枯病防治药剂。 0019 优选地， 所述的植物为番茄、 茄子、 马铃薯或生姜， 青枯劳尔氏菌常常侵染这些植 物， 引发青枯病 ； 更优选地， 所述的植物为番茄。 0020 本发明还提供了所述的生防制剂在防治植物根肿病中的应用。。
18、试验证明， 该生防 制剂对十字花科植物的根肿病也有良好的防治效果， 用于根肿病的防治， 能显著降低根肿 病的病情严重度 ( 病情指数为 40 )， 促进植物的增产效果 ( 达到 92 )， 优于目前常用的 根肿病防治药剂。 0021 优选地， 所述的植物为十字花科植物 ； 更优选地， 所述的植物为大白菜、 小白菜、 甘 蓝、 萝卜、 荠菜、 花椰菜或油菜， 芸苔根肿菌常常侵染这些植物， 引发根肿病 ； 最优选地， 所述 的植物为大白菜。 0022 本发明利用解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 在适宜的发酵培养基和发酵培养条件下 制备获得防治植物青枯病、 根肿病的生防制剂， 具有如下有益效果 ： 。
19、(1) 培养基原料来源 广泛， 发酵培养工艺简单， 操作方便 ； (2) 所制得的生防制剂对青枯菌的抑菌圈直径达到 21.75mm， 抑菌效果优于使用常规 LB 培养基和常规细菌发酵培养条件所制得的生防制剂 ； 用于浇灌被青枯菌侵染的植株， 能显著降低植株青枯病的病害发生率和病情严重度 ； 对不 同生化型青枯病均有较好防效， 防效稳定， 适合规模化生产 ； (3) 用于浇灌被根肿菌侵染的 植株， 能显著降低植株根肿病的病情严重度， 延缓根肿病的发生， 显著促进植株的增产效 果 ； 防效稳定， 适合规模化生产。 附图说明 0023 图 1 为实施例 3 中不同初始 pH 对解淀粉芽孢杆菌 ZJU。
20、B2008 抑菌活性和菌体生长 量的影响 ； 0024 图 2 为实施例 4 中不同装液量对解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 抑菌活性和菌体生长 量的影响 ； 0025 图 3 为实施例 5 中不同接种量对解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 抑菌活性和菌体生长 量的影响 ； 0026 图 4 为实施例 6 中不同温度对解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 抑菌活性和菌体生长量 的影响 ； 0027 图 5 为实施例 7 中不同发酵时间对解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 抑菌活性和菌体生 长量的影响 ； 0028 图 6 为实施例 8 中不同处理下番茄青枯病的病害发生情况 ； 0029 图 7 为实施。
21、例 8 中不同处理下番茄青枯病的病情严重度。 具体实施方式 0030 实施例 1 制备种子液 0031 用 三 区 划 线 法 将 保 藏 的 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 说 明 书 CN 102757917 A 5 4/9 页 6 ZJUB2008( 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M209145) 在 NA 琼脂 平板上划线， 置于 30下培养 24h ； 将解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 单菌落接到 LB 液体培养 基中， 于 30， 160r/min 的摇床中振荡培养 12h， 制成种子液， 。
22、种子液中菌体浓度为 108CFU/ ml。 0032 实施例 2 发酵培养基的优化 0033 选择蛋白胨、 牛肉浸膏、 葡萄糖、 酵母粉、 NaCl 5 个培养基组分因素， 每个因素设定 4 个水平。采用 L16(45) 正交表， 随机安排因素和配比水平 ( 见表 1)。 0034 按正交试验设计表 ( 见表 3) 分别配置培养基， pH 7.0 左右 ； 灭菌后， 向培养基中 接入实施例 1 制得的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 种子液， 接种量为 0.5 (v/v) ； 于 30， 160r/min 摇床振荡培养 24h。每个处理设 3 个重复。 0035 采用琼脂扩散法测定抑菌活性 ：。
23、 将发酵液加入含有青枯菌的琼脂平板中， 于 30 温箱培养 48h 后， 测量各处理的抑菌圈直径。 0036 结果显示， 培养基各组成成分蛋白胨、 牛肉浸膏、 葡萄糖、 酵母粉、 NaCl 对解淀粉芽 孢杆菌 ZJUB2008 发酵液的抑菌活性都有影响， 影响大小主次排列为 ： 葡萄糖牛肉浸膏 蛋白胨 NaCl 酵母粉。当葡萄糖浓度较低， 牛肉浸膏、 蛋白胨或 NaCl 浓度较高时， 解淀 粉芽孢杆菌 ZJUB2008 发酵液的抑菌活性较强 ； 酵母粉浓度对解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 发 酵液的抑菌活性无显著影响 ( 见表 2)。 0037 解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 利用 10 。
24、号、 9 号、 14 号培养基发酵时， 其发酵液的抑菌 活性最强， 抑菌圈平均直径分别达到 20.67mm、 20.23mm、 20.13mm。10 号培养基为最佳配方， 其组成编号为 A3B2C4D3E1， 即每升培养液中蛋白胨 10g、 牛肉浸膏 1g、 葡萄糖 0g、 酵母粉 1g、 NaCl8g( 见表 3)。 0038 表 1L16(45) 正交试验因素水平表 0039 0040 表 2L16(45) 正交试验方差分析结果 0041 0042 表 3 培养基营养成分优化的 L16(45) 正交实验结果 说 明 书 CN 102757917 A 6 5/9 页 7 0043 0044 。
25、注 ： abcdefgh 代表各处理之间的显著性差异。 0045 实施例 3 培养基初始 pH 的优化 0046 培养基的初始 pH 设 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0 八个梯度， 在实施例 2 优 说 明 书 CN 102757917 A 7 6/9 页 8 化后的培养基中接种实施例 1 的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 种子液， 接种量为 0.5 (v/v) ； 于 30， 160r/min 摇床振荡培养 24h ； 测量抑菌圈大小和菌体数量。 0047 结果见图1， 当初始pH为7.5时， 解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008的抑菌活性最大 ； 。
26、当初 始pH为8.0时， 解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008的菌体数量最多。 从菌体的生长量和抑菌物质的 产生量两项指标来综合考虑， 并以抑菌活性为重点， 确定最适合解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 发酵的培养基初始 pH 为 7.5。 0048 实施例 4 装液量的优化 0049 将装液量设定为50ml摇瓶装液量5ml、 10ml、 15ml、 20ml、 25ml、 30ml、 35ml、 40ml八 个梯度， 在实施例 2 优化后的培养基中接种实施例 1 的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 种子液， 接种量为0.5(v/v) ； 于30， 160r/min摇床振荡培养24h ； 测量抑菌圈大。
27、小和菌体数量。 0050 结果见图2， 当装液量为35ml/50ml摇瓶时， 解淀粉芽孢杆菌ZJUB2008发酵液的抑 菌活性和菌体数量都达到最大值。 0051 实施例 5 接种量的优化 0052 接种量设 0.1、 0.5、 1、 3、 5、 7、 9、 15 (v/v) 八个梯度， 在实施例 2 优化后的培养基中按上述比例接种实施例 1 的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 种子液 ； 于 30， 160r/min 摇床振荡培养 24h ； 测量抑菌圈大小和菌体数量。 0053 结果见图 3， 当接种量为 3 (v/v) 时， 解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 发酵液的抑菌活 性和菌体数量都。
28、达到最大值。 0054 实施例 6 发酵温度的优化 0055 发酵温度设 25、 30、 35、 40、 45五个梯度， 在实施例 2 优化后的培养基中接种实施 例 1 的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 种子液， 接种量为 0.5 (v/v) ； 分别在 160r/min 摇床中 振荡培养 24h ； 测量各温度梯度条件下发酵液的抑菌圈大小和菌体数量。 0056 结果见图 4， 当培养温度为 35时， 解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 发酵液的抑菌活性 和菌体数量都达到最大值。 0057 实施例 7 最佳发酵时间的确定 0058 在优化后的培养条件下 ( 初始 pH 7.5 ； 装液量 35。
29、ml/50ml ； 接种量 3 (v/v) ； 培 养温度35)摇瓶培养， 分别在6、 12、 24、 48、 36、 72、 96、 120h取样测定其对青枯病原菌抑菌 圈的大小， 并测定菌体数。 0059 结果见图 5， 用最终得到的优化条件来培养解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008， 24h 后抑菌 圈平均直径达到21.75mm(培养条件未优化时抑菌圈平均直径20.67mm) ； 24h之后抑菌活性 无显著性差异。菌体数在 24h 达到最大值。综合菌量和抑菌物质分泌的结果， 且考虑到时 间越长对生产利益越不利， 培养时间以 24h 为宜。 0060 实施例 8 青枯病温室防效试验 0061 。
30、未经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 菌悬液的制备 ： 将经活化的解淀 粉芽孢杆菌 ZJUB2008 接种到未经优化的培养液中进行发酵培养 ； 其中， 以体积 1L 计， 未经 优化的培养液含有以下组分 ： 酵母粉 5g， 胰蛋白胨 10g， NaCl 5g， 余量为水 ； 培养液的 pH 为 7.0 ； 未经优化的常规培养条件为 ： 摇瓶中装液量 50， 接种量 0.5 (v/v)， 发酵培养温度 30， 发酵培养时间 12h。 0062 将已萌发的番茄种子播种在装有营养土和沙子 (1 2) 的盆子中， 每盆 1 粒。设 说 明 书 CN 102757917 A 8 7/9 页。
31、 9 4 个处理， 每个处理设 8 个重复 ： 0063 (1) 在种子表面浇灌 1ml 未经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 菌悬液 ； 0064 (2) 在种子表面浇灌 1ml 经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 菌悬液 ； 0065 (3) 在种子表面浇灌 1ml 无菌水， 作为发病对照 ； 0066 (4) 在种子表面浇灌 1ml 无菌水， 作为空白对照。 0067 浇灌处理后， 随机放在 16h 光照 8h 黑暗、 相对湿度 80、 28的温室中 ； 6 周以 后， 再次将相应的菌悬液或无菌水浇灌在番茄苗根系周围 ； 第 2 天用青枯菌 T91 菌悬液 (。
32、108CFU/ml) 在处理 1 至处理 3 的番茄苗上伤根接种， 各处理接种 5ml， 处理 4 用 5ml 无菌 水伤根接种作为空白对照 ； 再经 1 周左右统计番茄的病害发生率和病情严重度， 测定番茄 的植株生物量。 0068 图 6 和图 7 结果显示， 与发病对照 ( 处理 3) 相比， 经解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 菌 悬液处理后的番茄植株 ( 处理 1 和处理 2) 病害发生率和病情严重度都显著下降。与未优 化条件培养的处理 1 相比， 经优化后发酵培养的菌悬液处理番茄 ( 处理 2) 能进一步地降低 番茄植株的病害发生率和病情严重度， 且效果显著。 0069 生物量的评价。
33、以番茄植株根茎的鲜重和干重作为指标。根系越健壮， 说明该作物 的生长能力越旺盛 ； 其地下部分 / 地上部分， 即根茎比越大， 说明该作物抗土传病害能力越 强。表 4 结果显示， 与发病对照 ( 处理 3) 和未优化发酵培养处理 ( 处理 1) 相比， 经优化培 养的菌悬液处理 ( 处理 2) 之后， 番茄植株的鲜重和干重根茎比值有明显提高， 分别达 0.14 和 0.12。 0070 表 4 解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 对接种青枯菌后番茄植株生物量的影响 0071 0072 注 ： abcd 代表各处理之间的显著性差异。 0073 以本实施例经优化培养菌悬液处理组(处理2)与克菌康药剂。
34、处理的防效比较， 结 果显示， 用克菌康处理青枯病植物， 防治效果达85左右(黄瑛.克菌康防治番茄青枯病药 效试验 . 农业科技通报， 2006， 8 ： 24-25) ； 而本实施例提供的生防制剂用于青枯病的防治， 能显著降低青枯病的病情严重度(病情指数为12)， 增加植物的根茎比， 优于克菌康药剂 的防治效果。 0074 实施例 9 根肿病温室防效试验 0075 未经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 菌悬液的制备 ： 将经活化的解淀 粉芽孢杆菌 ZJUB2008 接种到未经优化的培养液中进行发酵培养 ； 其中， 以体积 1L 计， 未经 优化的培养液含有以下组分 ： 酵母粉 。
35、5g， 胰蛋白胨 10g， NaCl 5g， 余量为水 ； 培养液的 pH 为 说 明 书 CN 102757917 A 9 8/9 页 10 7.0 ； 未经优化的常规培养条件为 ： 摇瓶中装液量 50， 接种量 0.5 (v/v)， 发酵培养温度 30， 发酵培养时间 12h。 0076 将风干的甘蓝根肿病病根磨碎， 并与营养土混合 ( 病根营养土 1 20)， 得 到菌土混合物 ； 在纸杯中以珍珠岩为基质， 在珍珠岩中挖一个小穴， 并在穴中放大约 20g 菌 土， 空白对照只加营养土 ； 将已萌发的大白菜种子播种在菌土中， 每个杯子播种 4 棵， 每个 处理 8 杯。 0077 (1) 。
36、在播种时浇灌 5ml 未经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 菌悬液， 间 隔 10d 后， 再浇一次 ； 再间隔 15d 浇第三次 ； 0078 (2) 在播种时浇灌 5ml 经优化发酵培养的解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 菌悬液， 间隔 10d 后， 再浇一次 ； 再间隔 15d 浇第三次 ； 0079 (3) 在播种时浇灌 5ml 蒸馏水， 间隔 10d 后， 再浇一次 ； 再间隔 15d 浇第三次， 作为 病原对照 ； 0080 (4) 在播种时浇灌 5ml 蒸馏水， 间隔 10d 后， 再浇一次 ； 再间隔 15d 浇第三次， 作为 空白对照。 0081 浇灌处理后， 。
37、随机放在 16h 光照 8h 黑暗、 相对湿度 80、 30的温室中 ； 45-50 天 以后， 统计白菜根部根肿病的发病率和病情严重度以及植株生物量。病情严重度分级标准 如下 ： 0082 0 级 ： 无任何肿瘤 ； 0083 1 级 ： 主根肿大， 其直径小于二倍茎基部 ； 0084 3 级 ： 主根肿大， 其直径为茎基的 2-3 倍 ； 0085 5 级 ： 主根肿大， 其直径为茎基的 3-4 倍 ； 0086 7 级 ： 主根肿大， 其直径为茎基的 4 倍以上。 0087 死亡植株按 7 级计算。 0088 病情指数 ( 病级株数 代表级数 )/ 植株总数 最高代表级值 100。 00。
38、89 同时为了更好地评估解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 对土壤中根肿菌种群数量的影 响， 即其对根肿菌的抑制效果， 对不同处理土壤中根肿菌的含量进行了测定， 方法如下 ： 从 每组处理的不同重复中各称取 1g 土壤混合成 8g， 从中称取 1g 加入到 9ml 无菌蒸馏水中 ； 在摇床上震荡 30min， 稀释到 10-2， 血尔球计数根肿菌数量。 0090 表 5 解淀粉芽孢杆菌 ZJUB2008 对大白菜根肿病的防治和增产效果影响 0091 0092 注 ： abc 代表各处理之间的显著性差异。 说 明 书 CN 102757917 A 10 9/9 页 11 0093 以本实施例经优化。
39、培养菌悬液处理组 ( 处理 2) 与荣宝和棉隆药剂处理的防效比 较， 结果显示， 用荣宝和棉隆药剂处理根肿病植物， 药后 50 天平均病情指数分别达 65.00 和 64.58， 增产效果分别达 70.10和 50.62 ( 赵毓潮， 向祖焕， 张植敏 . 土壤处理药剂 对十字花科根肿病的防治效果试验 . 湖北植保， 2008， 1 ： 24-25) ； 而本实施例提供的生防制 剂用于根肿病的防治， 能显著降低根肿病的病情严重度(病情指数为40)， 促进植物的增 产效果 ( 达 92 )， 优于荣宝、 棉隆药剂的防治效果。 说 明 书 CN 102757917 A 11 1/4 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757917 A 12 2/4 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102757917 A 13 3/4 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102757917 A 14 4/4 页 15 图 7 说 明 书 附 图 CN 102757917 A 15 。