技术领域
本发明属于细胞活化技术领域，具体涉及一种高效刺激活化T细胞的方法。
背景技术
免疫治疗是继手术、放疗和化疗之外肿瘤临床治疗的重要手段，对清除肿瘤人体内残留和转移的肿瘤细胞，防止肿瘤的转移和复发及提高人的生存率和生存质量具有重要的作用和价值。目前肿瘤的免疫治疗手段主要有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NK)、以及最新的CAR-T、CAR-NK、TCR-T治疗技术，这些治疗技术最根本最基础的还是T细胞激活技术。
现有T细胞活化技术对于初始T细胞的数量要求多，而目前应用细胞治疗的大多数为肿瘤人，经过放化疗后，一些人身体状况差，外周血像差，能采集到的PBMC少；另外，现有激活方法效率低，细胞扩增倍数小，只有200倍左右，CD3+，CD56+双阳性比例低，只有20％左右。
公开号为CN 102352342 B的专利公开了一种T细胞活化方法，所描述的细胞活化方法细胞扩增倍数为150倍左右，第14天CD3+，CD56+双阳性T细胞比例35％左右，第21天CD3+，CD56+双阳性T细胞比例42％左右。比现有技术略有提高，但依然不能满足后续流程的需求。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种高效刺激活化T细胞的方法。使用所述刺激活化T细胞的方法，只需要20ml-80ml的外周血，或者2×107-5×107细胞即可，对人几乎无影响；另外，所述刺激活化T细胞的方法能够激活扩增T细胞500-1000倍，CD3+，CD56+双阳性的T细胞比例可 达40％-80％，明显高于现有技术。
本发明所采用的技术方案为：
一种高效刺激活化T细胞的方法，包括以下步骤：
A、采集人外周血作为标本；
B、将所述标本加入淋巴细胞分离液混合均匀，室温下离心，离心后标本分出单个核细胞层；
C、吸取单个核细胞层中的液体至离心管中，加入无血清培养基培养，然后离心、洗涤，洗涤后去除上清液，加入磁珠混合5-10min，混合后在分离柱中去除非T细胞；
D、使用含有300-1000U/mL IL-2、1-3wt％L-Glu、1-3wt％丙酮酸钠、1-3wt％非必须氨基酸、10-50mmol/L Hepes和2-5％人血白蛋白的无血清培养液重悬步骤C得到的细胞，得到细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞浓度为5×105-1×106cells/ml；
在本发明中，所述非必须氨基酸不含L-Glu。
E、在多孔板中，加入D-PBS、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28，混合均匀，并在3-5℃保存20-28小时，得到单抗稀释液；
F、将所述单抗稀释液加入所述细胞悬液中，并补加干扰素γ和IL-15，混合均匀后置于35-39℃、体积百分比为5-7.5％CO2培养箱中培养20-28小时，得到细胞培养液Ⅰ；
G、向细胞培养液Ⅰ中补加含有300-1000U/mL IL-2，1-3wt％L-Glu，1-3wt％丙酮酸钠，1-3wt％非必须氨基酸，10-50mmol/L Hepes和2-5wt％人血白蛋白的无血清培养液，并补加IL-1α、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28；得到细胞培养液Ⅱ；
H、从步骤F开始，每隔两天用培养液半量换液；
I、从步骤F开始，培养10-14天后，收集T细胞，经过离心、洗涤之后，即得到活化的T细胞。
所述高效刺激活化T细胞的方法，能够激活扩增T细胞500-1000倍，CD3+，CD56+双阳性的T细胞比例可达40％-80％，明显高于现有技术。
优选地，步骤A中，抽取人外周血20-80ml，在1500-2400rpm转速下离心8-20分钟，吸取上清血浆于55-57℃水浴中保存30-40min，然后在3000-4000rpm转速下离心6-10min，取上清液作为标本。
步骤B中，所述淋巴细胞分离液为Ficoll-Hypaque，所述标本加入淋巴细胞分离液前，先使用生理盐水稀释；所述离心的转速为2000-2400rpm，所述离心的时间为18-25min。
步骤C中，所述无血清培养基为1640无血清培养基；所述离心和洗涤操作依次交替进行两次，两次离心的转速的范围均为1200-1500rpm，两次离心的时间的范围均为6-10min。
另外，步骤C中，在分离柱中去除非T细胞后，依次交替进行两次离心和洗涤操作，两次离心的转速的范围均为1200-1500rpm，两次离心的时间的范围均为6-10min，两次洗涤操作均使用1640无血清培养基作为洗涤液。
也就是说，在步骤C中，要依次进行四次离心和洗涤的操作，以保证实验的顺利进行和最终成品的品质。
步骤F中，补加干扰素γ和IL-15后，所述干扰素γ的浓度为500-1000U/ml，所述IL-15的浓度为10-30ng/ml。
步骤G中，补加IL-1α、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28后，所述IL-1α的浓度为50-100U/ml，所述单克隆抗体OKT3的浓度为20-50ng/ml，所述单克隆抗体CD28的浓度为20-50ng/ml。
步骤H中，所述半量换液为：取一半含细胞的培养基，离心收集细胞后去除培养基，加入含有300-1000U/mL IL-2、1-3wt％L-Glu、1-3wt％丙酮酸钠、1-3wt％非必须氨基酸、10-50mmol/L Hepes和2-5wt％人血白蛋白的无血清培养液至细胞浓度为5×105-1×106cells/ml。
从步骤F开始，培养3天后，将细胞转移至T175培养瓶中继续培养。以保证细胞有充足的生长空间。
步骤I中，将T细胞离心后，使用生理盐水洗涤三次，即得到活化的T细胞。
本发明中的反应机理如下：
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cellantigen receptor,TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck,Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。
由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培 养中不可或缺的刺激因素。
此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行T细胞培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个人的T细胞均能被激活。
IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor,TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
干扰素γ具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入干扰素γ，可降低IL-2的用量。
IL-1α也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1α与IFN-和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高T细胞的细胞毒作用。
IL-15：生物学作用与IL-2相似。其细胞来源和靶细胞分布较IL-2广，故能在不表达IL-2的部位发挥类似IL-2的效应，和IL-2合用起协同作用。
L-Glu，谷氨酰胺具有重要的免疫调节作用，它是淋巴细胞分泌、增殖及其功能维持所必需的。作为核酸生物合成的前体和主要能源，谷氨酰胺可促使淋巴细胞、巨噬细胞的有丝分裂和分化增殖，增加细胞因子TNF、IL-1等的产生和磷脂的mRNA合成。
从以上论述可知，发明人对刺激活化T细胞的方法的机理做了深入的研究在理论研究的基础上，发明提供了一种高效刺激活化T细胞的方法，只需要20ml-80ml的外周血，或者2×107-5×107细胞即可，对人几乎无影响；另外，根据行业通用的流式细胞仪检测结果表明，所述刺激活化T细胞的方法能够激 活扩增T细胞500-1000倍，CD3+，CD56+双阳性的T细胞比例可达40％-80％，明显高于现有技术。
附图说明
图1是本发明中实施例3中培养3天后的T细胞于10倍显微镜下的电镜图，图中可见细胞密度大，细胞开始结团；
图2是本发明中实施例3中培养10天后的T细胞于20倍显微镜下的电镜图，图中可见细胞密度大，细胞处于分裂期的多。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种高效刺激活化T细胞的方法，包括以下步骤：
A、抽取人外周血20ml，在2400rpm转速下离心8分钟，吸取上清血浆于57℃水浴中保存30min，然后在4000rpm转速下离心6min，取上清液作为标本；
B、将所述标本加入淋巴细胞分离液在离心管中混和均匀，所述淋巴细胞分离液为Ficoll-Hypaque((密度1.077))，所述标本加入淋巴细胞分离液前，先使用生理盐水稀释一倍以上；将离心管倾斜45°，在Ficoll-Hypaque液面以上1cm处，缓慢注入稀释的标本，不要打乱液面界面，室温下离心，所述离心的转速为2000rpm，所述离心的时间为18min；离心后标本分出单个核细胞层；
C、使用平口巴氏滴管吸取单个核细胞层中的液体至离心管中，加入无血清 培养基培养，然后离心、洗涤，洗涤后去除上清液，加入磁珠混合10min，混合后在分离柱中去除非T细胞；
步骤C中，所述无血清培养基为1640无血清培养基；所述离心和洗涤操作依次交替进行两次，第一次离心的转速的为1200rpm，第二次离心的转速的为1500rpm，第一次离心的时间为6min，第二次离心的时间为10min；在分离柱中去除非T细胞后，依次交替进行两次离心和洗涤操作，第一次离心的转速的为1200rpm，第二次离心的转速的为1500rpm，第一次离心的时间为6min，第二次离心的时间为10min，两次洗涤操作均使用1640无血清培养基作为洗涤液。
也就是说，在步骤C中，要依次进行四次离心和洗涤的操作，以保证实验的顺利进行和最终成品的品质。
D、使用含有300U/mL IL-2、3wt％L-Glu、1wt％丙酮酸钠、3wt％非必须氨基酸、10mmol/L Hepes和5wt％人血白蛋白的无血清培养液重悬步骤C得到的细胞，得到细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞浓度为5×105cells/ml；
需要说明的是，所述人血白蛋白可以用10％～20％自体血清代替。
E、在多孔板中，加入D-PBS、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28，混合均匀，并在5℃保存20小时，得到单抗稀释液；
F、将所述单抗稀释液加入所述细胞悬液中，并补加干扰素γ和IL-15，混合均匀后置于39℃、体积百分比为5％CO2培养箱中培养28小时，得到细胞培养液Ⅰ；补加干扰素γ和IL-15后，所述干扰素γ的浓度为500U/ml，所述IL-15的浓度为30ng/ml；
G、向细胞培养液Ⅰ中补加含有300U/mL IL-2，3wt％L-Glu，1wt％丙酮酸钠，3wt％非必须氨基酸，10mmol/L Hepes和5wt％人血白蛋白的无血清培养液，并补加IL-1α、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28；得到细胞培养液Ⅱ；补加IL-1α、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28后，所述IL-1α的浓度为50U/ml，所述单克隆抗体OKT3的浓度为50ng/ml，所述单克隆抗体CD28的浓 度为20ng/ml；
需要说明的是，所述人血白蛋白可以用10％～20％自体血清代替。
H、从步骤F开始，每隔两天用培养液半量换液；所述半量换液为：取一半含细胞的培养基，离心收集细胞后去除培养基，加入含有1000U/mL IL-2，1wt％L-Glu，1wt％丙酮酸钠，3wt％非必须氨基酸，10mmol/L Hepes和5wt％人血白蛋白的无血清培养液至细胞浓度为5×105cells/ml；
需要说明的是，所述人血白蛋白可以用10％～20％自体血清代替。
从步骤F开始，培养3天后，将细胞转移至T175培养瓶中继续培养。以保证细胞有充足的生长空间。
I、从步骤F开始，培养14天后，收集T细胞，将T细胞离心后，使用生理盐水洗涤三次，即得到活化的T细胞。
经流式细胞仪检测结果表明，所述刺激活化T细胞的方法能够激活扩增T细胞500倍，CD3+，CD56+双阳性的T细胞比例可达60％，明显高于现有技术。
实施例2
一种高效刺激活化T细胞的方法，包括以下步骤：
A、抽取人外周血80ml，在1500rpm转速下离心20分钟，吸取上清血浆于55℃水浴中保存40min，然后在3000rpm转速下离心10min，取上清液作为标本；
B、将所述标本加入淋巴细胞分离液在离心管中混和均匀，所述淋巴细胞分离液为Ficoll-Hypaque((密度1.077))，所述标本加入淋巴细胞分离液前，先使用生理盐水稀释一倍以上；将离心管倾斜45°，在Ficoll-Hypaque液面以上1cm 处，缓慢注入稀释的标本，不要打乱液面界面，室温下离心，所述离心的转速为2000rpm，所述离心的时间为25min；离心后标本分出单个核细胞层；
C、使用平口巴氏滴管吸取单个核细胞层中的液体至离心管中，加入无血清培养基培养，然后离心、洗涤，洗涤后去除上清液，加入磁珠混合5min，混合后在分离柱中去除非T细胞；
步骤C中，所述无血清培养基为1640无血清培养基；所述离心和洗涤操作依次交替进行两次，第一次离心的转速的为1500rpm，第二次离心的转速的为1200rpm，第一次离心的时间为10min，第二次离心的时间为6min；在分离柱中去除非T细胞后，依次交替进行两次离心和洗涤操作，第一次离心的转速的为1500rpm，第二次离心的转速的为1200rpm，第一次离心的时间为10min，第二次离心的时间为6min，两次洗涤操作均使用1640无血清培养基作为洗涤液。
也就是说，在步骤C中，要依次进行四次离心和洗涤的操作，以保证实验的顺利进行和最终成品的品质。
D、使用含有1000U/mL IL-2、1wt％L-Glu、3wt％丙酮酸钠、1wt％非必须氨基酸、50mmol/L Hepes和2wt％人血白蛋白的无血清培养液重悬步骤C得到的细胞，得到细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞浓度为1×106cells/ml；
需要说明的是，所述人血白蛋白可以用10％～20％自体血清代替。
E、在多孔板中，加入D-PBS、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28，混合均匀，并在3℃保存28小时，得到单抗稀释液；
F、将所述单抗稀释液加入所述细胞悬液中，并补加干扰素γ和IL-15，混合均匀后置于35℃、体积百分比为7.5％CO2培养箱中培养20小时，得到细胞培养液Ⅰ；补加干扰素γ和IL-15后，所述干扰素γ的浓度为1000U/ml，所述IL-15的浓度为10ng/ml；
G、向细胞培养液Ⅰ中补加含有1000U/mL IL-2，1wt％L-Glu，3wt％丙酮酸 钠，1wt％非必须氨基酸，50mmol/L Hepes和2wt％人血白蛋白的无血清培养液，并补加IL-1α、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28；得到细胞培养液Ⅱ；补加IL-1α、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28后，所述IL-1α的浓度为100U/ml，所述单克隆抗体OKT3的浓度为20ng/ml，所述单克隆抗体CD28的浓度为50ng/ml；
需要说明的是，所述人血白蛋白可以用10％～20％自体血清代替。
H、从步骤F开始，每隔两天用培养液半量换液；所述半量换液为：取一半含细胞的培养基，离心收集细胞后去除培养基，加入含有300U/mL IL-2，3wt％L-Glu，3wt％丙酮酸钠，1wt％非必须氨基酸，50mmol/L Hepes和2wt％人血白蛋白的无血清培养液至细胞浓度为1×106cells/ml；
需要说明的是，所述人血白蛋白可以用10％～20％自体血清代替。
从步骤F开始，培养3天后，将细胞转移至T175培养瓶中继续培养。以保证细胞有充足的生长空间。
I、从步骤F开始，培养10天后，收集T细胞，将T细胞离心后，使用生理盐水洗涤三次，即得到活化的T细胞。
经流式细胞仪检测结果表明，所述刺激活化T细胞的方法能够激活扩增T细胞750倍，CD3+，CD56+双阳性的T细胞比例可达40％，明显高于现有技术。
实施例3
一种高效刺激活化T细胞的方法，包括以下步骤：
A、抽取人外周血50ml，在2000rpm转速下离心14分钟，吸取上清血浆于56℃水浴中保存35min，然后在3500rpm转速下离心8min，取上清液作为标本；
B、将所述标本加入淋巴细胞分离液在离心管中混和均匀，所述淋巴细胞分离液为Ficoll-Hypaque((密度1.077))，所述标本加入淋巴细胞分离液前，先使用生理盐水稀释一倍以上；将离心管倾斜45°，在Ficoll-Hypaque液面以上1cm处，缓慢注入稀释的标本，不要打乱液面界面，室温下离心，所述离心的转速为2200rpm，所述离心的时间为22min；离心后标本分出单个核细胞层；
C、使用平口巴氏滴管吸取单个核细胞层中的液体至离心管中，加入无血清培养基培养，然后离心、洗涤，洗涤后去除上清液，加入磁珠混合7min，混合后在分离柱中去除非T细胞；
步骤C中，所述无血清培养基为1640无血清培养基；所述离心和洗涤操作依次交替进行两次，两次离心的转速均为1350rpm，两次离心的时间均为8min；在分离柱中去除非T细胞后，依次交替进行两次离心和洗涤操作，两次离心的转速均为1350rpm，两次离心的时间均为8min；两次洗涤操作均使用1640无血清培养基作为洗涤液。
也就是说，在步骤C中，要依次进行四次离心和洗涤的操作，以保证实验的顺利进行和最终成品的品质。
D、使用含有650U/mL IL-2、2wt％L-Glu、2wt％丙酮酸钠、2wt％非必须氨基酸、30mmol/L Hepes和3wt％人血白蛋白的无血清培养液重悬细胞，得到细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞浓度为7.5×105cells/ml；
需要说明的是，所述人血白蛋白可以用10％～20％自体血清代替。
E、在多孔板中，加入D-PBS、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28，混合均匀，并在4℃保存24小时，得到单抗稀释液；
F、将所述单抗稀释液加入所述细胞悬液中，并补加干扰素γ和IL-15，混合均匀后置于37℃、体积百分比为6％CO2培养箱中培养24小时，得到细胞培养液Ⅰ；补加干扰素γ和IL-15后，所述干扰素γ的浓度为750U/ml，所述IL-15的浓度为10-30ng/ml；
G、向细胞培养液Ⅰ中补加含有650U/mL IL-2、2wt％L-Glu、2wt％丙酮酸钠、2wt％非必须氨基酸、30mmol/L Hepes和3wt％人血白蛋白的无血清培养液，并补加IL-1α、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28；得到细胞培养液Ⅱ；补加IL-1α、单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28后，所述IL-1α的浓度为75U/ml，所述单克隆抗体OKT3的浓度为45ng/ml，所述单克隆抗体CD28的浓度为35ng/ml；
需要说明的是，所述人血白蛋白可以用10％～20％自体血清代替。
H、从步骤F开始，每隔两天用培养液半量换液；所述半量换液为：取一半含细胞的培养基，离心收集细胞后去除培养基，加入含有650U/mL IL-2、2wt％L-Glu、2wt％丙酮酸钠、2wt％非必须氨基酸、30mmol/L Hepes和3wt％人血白蛋白的无血清培养液至细胞浓度为7.5×105cells/ml；
需要说明的是，所述人血白蛋白可以用10％～20％自体血清代替。
从步骤F开始，培养3天后，将细胞培养液转移至T175培养瓶中继续培养。以保证细胞有充足的生长空间。
I、从步骤F开始，培养12天后，收集T细胞，将T细胞离心后，使用生理盐水洗涤三次，即得到活化的T细胞。
经流式细胞仪检测结果表明，所述刺激活化T细胞的方法能够激活扩增T细胞1000倍，CD3+，CD56+双阳性的T细胞比例可达80％，明显高于现有技术。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的 精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。