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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610345524.3 (22)申请日 2016.05.22 (71)申请人 深圳中美基因研究院有限公司 地址 518115 广东省深圳市龙岗区横岗街 道坳背坳一路102号 (72)发明人 李则轩 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 一种近视风险评估的基因检测试剂盒及其 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种近视风险评估的基因检 测试剂盒及其检测方法， 包括盒体及盒体内单独 存放试剂， 单独存放试剂包括： (1)针对2个基因 S。
2、NP多态位点的PCR反应引物组； (2)PCR扩增试 剂； (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。 本发明通过 PCR引物的设计使多个PCR扩增反应在同一台PCR 仪上同步进行， 对受测者的相关基因进行检测， 并实现检测的高效性、 特异性， 分析得到受测者 发展成为高度近视的风险， 为其发现近视的遗传 与基因内在因素， 能够更好的为受测者提供科学 的参考， 帮助其改善、 调理生活工作习惯， 以预防 或降低近视的风险， 同时在日常生活中采取相应 的策略避免对其无效甚至是有害的方法。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 105861714 A 2016.08.17 CN 105861714 A 1。
3、.一种近视风险评估的基因检测试剂盒， 包括盒体及盒体内单独存放试剂， 其特征在 于， 所述单独存放试剂包括： (1)针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组， 引物序列方向均为5 端至3 端： 针对SNPrs189798的引物组： 1GTAGTGCTGGTGG 2CAGAGAGAGCACTTCAG 3GACAGAGACATTGAGGC 4GGAATACTGCAAGATCCGT 针对SNPrs10034228的引物组： 1GGTGCTCTCTCAAGCCTTTG 2CTTTTGTGCCTCCACTATTC 3GAAGAAGTCAGAGATGTGTAT 4GACTGCCACACTAACAAAT。
4、； (2)PCR扩增试剂： 10PCR缓冲液， 该PCR缓冲液由90110mMTris-HClpH8.3、 480 520mMKCl、 1317mMMgCl2组成； dNTPs混合物， 该dNTPs混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷 酸dGTP、 三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、 三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、 三磷酸胞嘧啶脱 氧核苷酸dCTP四种核苷酸组成， 各组分浓度为2.22.8mM； 46U/ l热启动Taq酶； 基因组 模板； (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂： 琼脂糖、 TAE缓冲液、 DNA分子量标准、 Goldview染色液和 DNA上样缓冲液， 该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1倍后。
5、使用。 2.根据权利要求1所述的近视风险评估的基因检测试剂盒， 其特征在于， 所述DNA无毒 染色液为BiotiumGelred无毒染料或Goldview染色液。 3.一种如权利要求1所述的近视风险评估的基因检测试剂盒的检测方法， 其特征在于， 步骤如下： (1)提取样本基因组DNA 采集测试者唾液， 向12ml唾液样品中加入480520 L提取缓冲溶液， 该提取缓冲溶 液溶剂为4852mM的Tris-HClpH7.4、 0.40.6mM的EDTA和4852mM的NaCl， 反复吹打混 匀后， 8000g离心46min， 弃去上清， 此步骤重复一次； 得到的沉淀中加入480520 L裂 解液，。
6、 该裂解液溶剂为4852mMTris-HClpH7.4， 4852mMTris-HClpH7.4， 145155mM NaCl， 0.91.1mMEDTA， 0.91.1Tritonx-100， 0.91.1Sodiumdeoxycholate， 0.090.11SDS， 蛋白酶K20mg/mL， 彻底悬浮沉淀并充分混匀后， 室温放置2832min， 期 间来回颠倒离心管数次； 得到的混合液中， 加入浓度为911mg/mLRNA酶的水溶液911 L， 3638下静置10min； 得到的上清液中， 加入等体积苯酚-氯仿混合溶液， 苯酚和氯仿体 积比为0.91.11， 充分混匀， 混合液35， 1。
7、2000g离心46min， 上清液移入干净离心 管内； 加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液， 苯酚、 氯仿和异戊醇体积比为242623 251， 充分混匀后， 35， 12000g离心46min， 上清液移入干净离心管内； 加入等体积 氯仿-异戊醇混合溶液， 充分混匀后， 35， 12000g离心46min， 上清液移入干净离心 管内； 加入0.50.7倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.090.11倍的2.83.2mol/L醋酸钠溶 液， -19-21静置5763min， 35， 12000g离心911min， 弃上清液； 得到的沉淀物 权利要求书 1/2 页 2 CN 105861714 A 2。
8、 中加入0.40.6mL70乙醇清洗沉淀物， 35， 12000g离心46min， 弃上清液， 此步 骤重复一次； 得到的沉淀物自然风干， 加入1822 L无菌超纯水回溶， 电泳检测， -20保 存； (2)PCR扩增 每个SNP的检测需要一对上下游引物、 两条多态引物共4条PCR引物， 共需要8条引物， 每 个SNP的检测需要做两管PCR扩增， 为防止出现假阳性之类的反应， 衡量PCR是否成功， 加设 一管阴性对照组， 共做5管PCR， 阴性对照组基因组模板没有引物存在； 根据不同的检测位点， 用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系： 2.32.7 L 10PCR缓冲液， 1.82.2。
9、 LdNTPs， 0.40.6 L引物组， 热启动Taq酶0.120.18 L， 基因 组模板7882mg， 添加超纯水至总体积为2426 L； 将装有反应溶液的Eppendorf试管放入PCR仪中， 设置反应条件如下： 预变性9496 2.53.5min； 热循环93952832s， 59612832s， 71732832s， 35个循环； 延 伸71732.53.5min， 反应结束后， 取出试管； (3)琼脂糖凝胶电泳检测 将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测， 过程如下： 2.73.3g琼脂糖， 加入95105mL去 离子水， 微波炉加热5565s， 冷却到5862， 加入4.85.2 L。
10、DNA无毒染色液， 制成2.9 3.1的琼脂糖凝胶， 用911 L的PCR产物与0.70.9 L的6TBE缓冲液混合上样， 在98 102V电压下电泳1416min， 紫外灯下读取结果并拍照。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105861714 A 3 一种近视风险评估的基因检测试剂盒及其检测方法 技术领域 0001 本发明涉及基因检测领域， 具体是一种近视风险评估的基因检测试剂盒及其检测 方法。 背景技术 0002 近视， 是指眼在调节松弛状态下， 平行光线经眼的屈光系统的折射后， 光线在视网 膜前聚焦而非在视网膜上聚焦， 这通常是因为晶状体的增厚和老化所导致， 近视受先天遗 传因素和后天。
11、环境因素的共同影响。 调查表明， 近视的产生受遗传的影响比较大。 如果父母 两人都是近视， 子女同样近视的几率高达33-60； 如果父母一方是近视， 子女近视的几率 降低到23-40； 如果父母两人都不近视， 则子女近视的几率只有6-15。 与近视眼有关联 的基因在眼睛发育以及视觉信号向大脑的传递过程中发挥着关键作用。 该类基因一旦出现 缺陷， 眼球就可能过度发育生长， 导致观看远处物体时发生视觉模糊， 近视形成。 0003 很显然， 近视的发生深受遗传因素的影响。 2001年英国研究者对226对同卵孪生成 年人和280对异卵孪生成年人的研究表明， 近视的遗传率高达0.89， 也就是说， 近视。
12、主要受 基因控制， 与后天因素的关系不大。 差不多同时丹麦研究者对53对同卵和61对异卵孪生成 年人的研究也得出了相同的结论。 0004 不过， 基因的表达离不开环境因素的作用， 某些环境因素(例如阅读)可能是近视 的诱因。 另外某些人在某些环境因素的刺激下， 天生就比较容易得近视。 总之， 对近视的基 因检测将会帮助我们更好的了解遗传因素的影响， 避免不利的环境因素诱发， 更好的保护 视力。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种近视风险评估的基因检测试剂盒及其检测方法， 该试 剂盒对受测者的相关基因进行检测， 分析得到受测者发展成为高度近视的风险， 为其发现 近视的遗传与基因内在因素。
13、， 能够更好的为受测者提供科学的参考， 帮助其改善、 调理生活 工作习惯， 以预防或降低近视的风险， 同时在日常生活中采取相应的策略避免对其无效甚 至是有害的方法。 且PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行并具备检测的高效性、 特异性， 以解决上述背景技术中提出的问题。 0006 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0007 本实施例对测试者采用近视风险评估基因检测试剂盒同时检测2个基因的SNP多 态位点， 并根据基因分型结果， 分析得到受测者发展成为高度近视的风险， 为其发现近视的 遗传与基因内在因素， 能够更好的为受测者提供科学的参考， 帮助其改善、 调理生活工作习 惯， 以预防。
14、或降低近视的风险， 同时在日常生活中采取相应的策略避免对其无效甚至是有 害的方法。 0008 一种近视风险评估的基因检测试剂盒， 包括盒体及盒体内单独存放试剂， 所述单 独存放试剂包括： 说明书 1/5 页 4 CN 105861714 A 4 0009 (1)针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组， 引物序列方向均为5 端至3 端： 0010 针对SNPrs189798的引物组： 0011 1GTAGTGCTGGTGG 0012 2CAGAGAGAGCACTTCAG 0013 3GACAGAGACATTGAGGC 0014 4GGAATACTGCAAGATCCGT 0015 针对SNP。
15、rs10034228的引物组： 0016 1GGTGCTCTCTCAAGCCTTTG 0017 2CTTTTGTGCCTCCACTATTC 0018 3GAAGAAGTCAGAGATGTGTAT 0019 4GACTGCCACACTAACAAAT； 0020 (2)PCR扩增试剂： 10PCR缓冲液， 该PCR缓冲液由90110mMTris-HClpH8.3、 480520mMKCl、 1317mMMgCl2组成； dNTPs混合物， 该dNTPs混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧 核苷酸dGTP、 三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、 三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、 三磷酸胞嘧 啶脱氧核苷酸dCTP四。
16、种核苷酸组成， 各组分浓度为2.22.8mM； 46U/ l热启动Taq酶； 基 因组模板； 0021 (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂： 琼脂糖、 TAE缓冲液、 DNA分子量标准、 Goldview染色 液和DNA上样缓冲液， 该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1倍后使用。 0022 作为本发明进一步的方案： 所述DNA无毒染色液为BiotiumGelred无毒染料或 Goldview染色液。 0023 一种所述的近视风险评估的基因检测试剂盒的检测方法， 步骤如下： 0024 (1)提取样本基因组DNA 0025 采集测试者唾液， 向12ml唾液样品中加入480520 L提取缓冲溶液， 该提取缓 。
17、冲溶液溶剂为4852mM的Tris-HClpH7.4、 0.40.6mM的EDTA和4852mM的NaCl， 反复吹 打混匀后， 8000g离心46min， 弃去上清， 此步骤重复一次； 得到的沉淀中加入480520 L裂解液， 该裂解液溶剂为4852mMTris-HClpH7.4， 4852mMTris-HClpH7.4， 145 155mMNaCl， 0 .91 .1mMEDTA， 0 .91 .1Tritonx-100， 0 .91 .1Sodium deoxycholate， 0.090.11SDS， 蛋白酶K20mg/mL， 彻底悬浮沉淀并充分混匀后， 室温放置 2832min， 期。
18、间来回颠倒离心管数次； 得到的混合液中， 加入浓度为911mg/mLRNA酶的 水溶液911 L， 3638下静置10min； 得到的上清液中， 加入等体积苯酚-氯仿混合溶液， 苯酚和氯仿体积比为0.91.11， 充分混匀， 混合液35， 12000g离心46min， 上清液 移入干净离心管内； 加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液， 苯酚、 氯仿和异戊醇体积比为 242623251， 充分混匀后， 35， 12000g离心46min， 上清液移入干净离心管内； 加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液， 充分混匀后， 35， 12000g离心46min， 上清液移 入干净离心管内； 加入0.50.7倍。
19、体积的冰浴异丙醇溶液及0.090.11倍的2.83.2mol/ L醋酸钠溶液， -19-21静置5763min， 35， 12000g离心911min， 弃上清液； 得到 的沉淀物中加入0.40.6mL70乙醇清洗沉淀物， 35， 12000g离心46min， 弃上清 液， 此步骤重复一次； 得到的沉淀物自然风干， 加入1822 L无菌超纯水回溶， 电泳检测， - 20保存； 说明书 2/5 页 5 CN 105861714 A 5 0026 (2)PCR扩增 0027 每个SNP的检测需要一对上下游引物、 两条多态引物共4条PCR引物， 共需要8条引 物， 每个SNP的检测需要做两管PCR扩。
20、增， 为防止出现假阳性之类的反应， 衡量PCR是否成功， 加设一管阴性对照组， 共做5管PCR， 阴性对照组基因组模板没有引物存在； 0028 根据不同的检测位点， 用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系： 2.32.7 L10PCR缓冲液， 1.82.2 LdNTPs， 0.40.6 L引物组， 热启动Taq酶0.120.18 L， 基 因组模板7882mg， 添加超纯水至总体积为2426 L； 0029 将装有反应溶液的Eppendorf试管放入PCR仪中， 设置反应条件如下： 预变性94 962.53.5min； 热循环93952832s， 59612832s， 71732832s。
21、， 35个循 环； 延伸71732.53.5min， 反应结束后， 取出试管； 0030 (3)琼脂糖凝胶电泳检测 0031 将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测， 过程如下： 2.73.3g琼脂糖， 加入95 105mL去离子水， 微波炉加热5565s， 冷却到5862， 加入4.85.2 LDNA无毒染色液， 制成2.93.1的琼脂糖凝胶， 用911 L的PCR产物与0.70.9 L的6TBE缓冲液混合上 样， 在98102V电压下电泳1416min， 紫外灯下读取结果并拍照。 0032 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩 增反应在同一台PCR仪上。
22、同步进行， 对受测者的相关基因进行检测， 并实现检测的高效性、 特异性， 分析得到受测者发展成为高度近视的风险， 为其发现近视的遗传与基因内在因素， 能够更好的为受测者提供科学的参考， 帮助其改善、 调理生活工作习惯， 以预防或降低近视 的风险， 同时在日常生活中采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。 附图说明 0033 图1为反应产物琼脂糖凝胶电泳图。 具体实施方式 0034 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做。
23、出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 0035 实施例 0036 (1)针对2个基因SNP多态位点的PCR反应引物组(以下引物序列方向均为5 端至3 端)： 0037 针对SNPrs189798的引物组： 0038 1GTAGTGCTGGTGG 0039 2CAGAGAGAGCACTTCAG 0040 3GACAGAGACATTGAGGC 0041 4GGAATACTGCAAGATCCGT 0042 针对SNPrs10034228的引物组： 0043 1GGTGCTCTCTCAAGCCTTTG 说明书 3/5 页 6 CN 105861714 A 6 0044。
24、 2CTTTTGTGCCTCCACTATTC 0045 3GAAGAAGTCAGAGATGTGTAT 0046 4GACTGCCACACTAACAAAT 0047 (2)PCR扩增试剂： 10PCR缓冲液， 该PCR缓冲液为100mMTris-HClpH8.3， 500mM KCl， 15mMMgCl2； dNTPs混合物， 该dNTPs混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP， 三磷酸腺 嘌呤脱氧核苷酸dATP， 三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP， 三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP四 种核苷酸， 各组分浓度为2.5mM； 5U/ l热启动Taq酶； 0048 (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂： 琼脂。
25、糖、 TAE缓冲液、 DNA分子量标准、 Goldview染色 液和DNA上样缓冲液， 该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1倍后使用。 0049 使用上述运动后体质恢复状况基因检测试剂盒按如下步骤进行检测： 0050 (1)提取样本基因组DNA 0051 采集该测试者唾液， 向1-2ml唾液样品中加入500 L提取缓冲溶液， 该DNA提取缓冲 溶液溶剂为50mM的Tris-HClpH7.4、 0.5mM的EDTA和50mM的NaCl， 反复吹打混匀后， 8000g 离心5min， 弃去上清， 此步骤重复一次； 得到的沉淀中加入500 L裂解液， 该裂解液溶剂为 50mMTris-HClpH7.4，。
26、 50mMTris-HClpH7.4， 150mMNaCl， 1mMEDTA， 1Tritonx-100， 1Sodiumdeoxycholate， 0.1SDS， 蛋白酶K20mg/mL， 彻底悬浮沉淀并充分混匀后， 室温 放置30min， 期间来回颠倒离心管数次； 得到的混合液中， 加入浓度为10mg/mLRNA酶的水溶 液10 L， 37下静置10min； 得到的上清液中， 加入等体积苯酚-氯仿混合溶液， 苯酚和氯仿 体积比为11， 充分混匀， 混合液4， 12000g离心5min， 上清液移入干净离心管内； 加入等 体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液， 苯酚、 氯仿和异戊醇体积比为2524。
27、1， 充分混匀后， 4， 12000g离心5min， 上清液移入干净离心管内； 加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液， 充分混 匀后， 4， 12000g离心5min， 上清液移入干净离心管内； 加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶 液及0.1倍的3mol/L醋酸钠溶液， -20静置60min后， 4， 12000g离心10min， 弃上清液； 得到的沉淀物中加入0.5mL70乙醇清洗沉淀物， 4， 12000g离心5min， 弃上清液， 此步 骤重复一次； 得到的沉淀物自然风干， 加入20 L无菌超纯水回溶， 电泳检测， -20保存。 0052 (2)PCR扩增 0053 本实施例同时检测rs18979。
28、8、 rs10034228， 每个SNP的检测需要一对上下游引物、 两条多态引物共4条PCR引物， 共需要8条引物。 每个SNP的检测需要做两管PCR扩增， 为防止 出现假阳性之类的反应， 衡量PCR是否成功， 加设一管阴性对照组， 共做5管PCR， 所述阴性对 照组基因组模板及反应体系是一样的， 但没有引物存在。 0054 根据不同的检测位点， 用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系： 2.5 L10 PCR缓冲液， 2 ldNTPs， 0.5 L引物组， 热启动Taq酶0.15 L， 基因组模板80mg， 添加超纯水 至总体积为25 L。 0055 将装有反应溶液的Eppendorf。
29、试管放入ABI9700PCR仪中， 设置反应条件如下： 预 变性953min； 热循环9430s， 6030s， 7230s， 35个循环； 延伸723min。 反应结束后， 取出试管。 0056 由于5管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的， 为了实现检测的高效性、 特 异性， 要求8条PCR引物的Tm值相近， 为此需要先进行大量的DNA序列软件分析来设计PCR引 物， 并通过大量的实验来进行Tm值的优化并确定设计的合理性， 本试剂盒各基因SNP多态性 说明书 4/5 页 7 CN 105861714 A 7 的检测是既相对独立又相互联系的， 不可分割。 0057 (3)琼脂糖凝胶电。
30、泳检测 0058 将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测， 过程如下： 3g琼脂糖， 加入100mL去离子水， 微波炉加热1min， 冷却到60时加入5 LGoldview染色液， 制成3的琼脂糖凝胶。 PCR产物 10 L与6TBE缓冲液0.8 L混合上样， 电压100V电泳15min。 紫外灯下读取结果并拍照， 所得 琼脂糖电泳检测图如图1所示。 0059 检测得到2个基因分型分析结果如下： 0060 SNP分型结果分析结果 rs189798CT高度近视的风险降低 rs10034228CT发展成高度近视的风险较低 0061 根据以上分析结果， 该测试者不容易患高度近视。 如在平常生活和学习中， 。
31、注意用 眼保护， 则更能保证眼睛的健康， 远离近视的苦恼。 0062 对于本领域技术人员而言， 显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下， 能够以其他的具体形式实现本发明。 因此， 无论 从哪一点来看， 均应将实施例看作是示范性的， 而且是非限制性的， 本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定， 因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。 不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。 说明书 5/5 页 8 CN 105861714 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 105861714 A 9 。