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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610290979.X (22)申请日 2016.05.04 (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38号 (72)发明人 殷学仁陈昆松谢秀兰刘晓芬 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 张法高赵杭丽 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) (54)发明名称 一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法 (57)摘要 本发明提供一种柑橘果皮的基因瞬时表达 方法， 通过柑橘不同组织器官RNA的提取和。
2、cDNA 的合成； 通过将外源目的基因搭载到pGreenII 002962-SK载体上电转到农杆菌GV3101:pSoup 中， 结合渗透液配方， 以及独特的注射手法和严 格的对照， 分析柑橘果皮瞬时表达。 本发明方法 设计合理， 操作方便简单， 能快速将多年生果树 柑橘的基因进行同源功能验证， 可以为多年生果 树的基因同源功能验证提供新思路和方法。 本方 法同样适用于其他果实的瞬时表达研究。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 105969798 A 2016.09.28 CN 105969798 A 1.一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法， 其特征在于， 通过以下步骤实现：。
3、 (1)RNA的提取和cDNA的合成： 柑橘不同组织器官混合样品总RNA的提取采用CTAB法进 行， 并使用TURBODNase去除基因组DNA污染， 再取1.0 gRNA用iScriptcDNASynthesis Kit逆转录成cDNA备用； (2)表达载体构建： 基于甜橙和克林曼丁柑橘基因组数据库， 获得SEQ： NO.1的CitERF13 全长序列， 以柑橘不同组织器官混合cDNA为模板， 结合全长扩增引物序列SEQ： NO.2和SEQ： NO.3， 参照FastStartHighFidelityPCRSystem说明书配制PCR体系， 按照其推荐的PCR 程序进行产物扩增， PCR产物。
4、经1琼脂糖凝胶电泳回收后连接于pGEM-Teasy载体上， 将重 组质粒导入大肠杆菌DH5 感受态细胞中， 在含100 gmL-1氨苄青霉素的固体LB培养基上初 步筛选， 用T载体通用引物序列SEQ： NO.4和SEQ： NO.5的菌液PCR后经测序获得序列正确的阳 性克隆， 再将其质粒采用相应限制内切酶酶切， 产物电泳回收， 然后连接到经相同限制性内 切酶处理的pGreen002962-SK表达载体上， 重组质粒转化入大肠杆菌DH5 感受态细胞后 经50 gmL-1卡那霉素筛选， 用pGreen002962-SK表达载体自带的检测引物序列SEQ： NO.6 和SEQ： NO.7对阳性克隆进行。
5、菌液PCR验证后测序再验证， 将最终确认正确构建的表达载体 电转化入GV3101:pSoup农杆菌感受态细胞中， 阳性克隆保存成甘油菌， 存放于-80备用； (3)柑橘果皮瞬时表达分析： 将保存于-80的甘油菌划线接种于含25 gmL-1庆大霉素 和50 gmL-1卡那霉素的固体LB培养基上， 28培养48h进行菌落活化， 随后挑取小部分活化 后的菌落涂布于新的含以上两种抗生素的固体LB培养基上继续28培养12h， 接着将活化 两次的农杆菌收集到渗透液中， 调整其浓度为OD6000.75备用， 挑选大小均匀、 色泽一致 且无机械伤病虫害的果实， 分别取1ml调整浓度后的含目的基因或对照的菌液，。
6、 分别注射同 一个果实的赤道面对立部位， 注射5天后， 与对照相比， 注射CitERF13的果皮叶绿素降解明 显增强， 收集农杆菌渗透区域果皮组织样品， 检测发现， 注射CitERF13的果皮叶绿素含量显 著低于阴性对照。 2.根据权利要求1所述的一种柑橘果皮瞬时表达方法， 其特征在于， 步骤(1)所述柑橘 不同组织器官混合样品是指茎、 叶、 花、 果实的混合样品， 去DNA后逆转录成cDNA。 3.根据权利要求1所述的一种柑橘果皮瞬时表达方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 表达载 体的构建是将CitERF13的开放阅读框采用高保真酶扩增最终搭载到pGreenII002962- SK载体上，。
7、 并通过电击法将其导入到农杆菌GV3101:pSoup中用于后续实验。 4.根据权利要求1所述的一种柑橘果皮瞬时表达方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 农杆菌 活化次数为两次， 收集菌体的渗透液配方为10mMMES， 10mMMgCl2， 150mM乙酰丁香酮， pH 5.6， 菌液浓度调整为OD6000.75。 5.根据权利要求1所述的一种柑橘果皮瞬时表达方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所挑选 的果实大小均匀、 色泽度一致且无机械伤病虫害， 用带针头的注射器分别注射到同一个果 实的赤道面对立部位进行严格的对照试验。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105969798 A 2 一种柑。
8、橘果皮的基因瞬时表达方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 涉及一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法， 可用于 多年生果树基因功能同源验证。 背景技术 0002 柑橘属于芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Aurantioideae)， 分为枳属(Poncirus Raf)、 金柑属(FortnoellaSwing)和柑桔属(CitrusL.)， 是世界第一大果树种类， 其种植 面积和产量均居首位， 也是我国原产水果之一。 柑橘果肉风味独特且具有抗癌和抗肿瘤等 营养功能， 并且柑橘果皮富含芳香物质和天然色素， 是研究挥发性物质和色素代谢及其调 控相关基因的良好材料。 0003 基因功。
9、能验证可以分为两种情况， 一种是通过增强其表达， 取得表达产物进行研 究； 另一种是减弱或者终止其表达， 观察整体功能的变化， 进而推测相应基因的功能。 目前， 柑橘主要是通过遗传转化的方法将外源基因过量导入柑橘体内。 植物遗传转化实际上是一 个组织培养和再分化的过程， 其操作复杂、 耗时较长、 对实验员技术要求高， 再加上柑橘属 于多年生木本植物， 具有童期长、 基因高度杂合、 多胚性和以及性器官败育等生物学特性， 其遗传转化的高效再生体系不完善， 转化效率及再生效率都很低， 这些都使柑橘遗传转化 受到极大的限制。 此外， 从获得转基因抗性芽到成苗的过程周期长、 难度大。 0004 植物瞬时。
10、表达系统是引入的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合， 这些 DNA随载体进入细胞后12h内就可以表达， 并持续约80h左右。 它具有简单快速、 表达水平高 和安全有效等优点。 多年生果树常采用此方法进行相关基因同源功能验证， 但是目前柑橘 相关基因研究较少用柑橘果实材料进行过量表达， 可能是因为表达载体、 农杆菌菌株、 以及 表达体系等原因导致。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法， 来克服现有柑橘遗传转 化方法存在的操作复杂、 周期长、 难以获得阳性转基因植株等方面的不足， 解决柑橘果皮相 关基因的同源功能验证， 为多年生果树的基因同源功能验证提供。
11、新思路和方法。 0006 本发明提供的一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法， 通过以下步骤实现： 0007 1.RNA的提取和cDNA的合成： 柑橘不同组织器官(茎、 叶、 花、 果实)总RNA的提取采 用CTAB法进行， 并使用TURBODNase(Ambion， 美国)去除基因组DNA污染， 再取1.0 gRNA用 iScriptcDNASynthesisKit(Bio-Rad， 美国)逆转录成cDNA备用， 其中柑橘RNA的提取采 用不同组织器官分别为茎、 叶、 花、 果实的混合样品， 去DNA后逆转录成cDNA。 0008 2 .表达载体构建 ： 基于甜橙 和克林曼丁柑 橘基因组数 据库( 。
12、http:/ www.citrusgenomedb.org)， 通过注释并利用已报道的拟南芥AP2/ERF家族基因序列进行 BLAST(TBLASTN和BLASTP)分析获得与叶绿素降解相关的CitERF13全长序列(SEQ： NO.1)。 利 用PCR技术， 结合引物对SEQ： NO.2和SEQ： NO.3扩增获得该基因， 并采用测序手段进一步验 说明书 1/4 页 3 CN 105969798 A 3 证。 根据已确认的CitERF13(SEQ： NO.1)660bp全长序列和全长扩增引物SEQ： NO.2和SEQ： NO.3扩增该基因的开放阅读框。 以柑橘混合cDNA为模板， 参照Roc。
13、he公司FastStartHigh FidelityPCRSystem进行PCR扩增， 其中30 lPCR体系为： 10Buffer3 l， dNTP2.4 l， 上/下游引物各0.6 l， 酶0.15 l， DEPC-H2O22.5 l， cDNA0.75 l； PCR程序为： 95预变性 5min； 95变性30sec， 58退火30sec， 72延伸1min， 35个热循环； 72延伸10min， 4保 存。 PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳回收后连接于Promega公司的pGEM-Teasy载体上， 10 l 连接体系为： 载体1 l， T4连接酶1 l， 缓冲液5 l， 回收产物3 l，。
14、 16过夜连接。 将重组质粒 采用热激法导入大肠杆菌DH5 感受态细胞中， 用不含任何抗生素的液体LB培养基(购自上 海生工生物工程股份有限公司， 配方为胰蛋白胨10.0g， 酵母粉5.0g， NaCl10.0g)于37 150rpm培养1h后， 均匀涂布于含100 gmL-1氨苄青霉素的固体LB培养基(配方为胰蛋白胨 10.0g， 酵母粉5.0g， NaCl10.0g， 琼脂糖15.0g)上初步筛选， 用T载体通用引物(SEQ： NO.4和 SEQ： NO.5)对阳性克隆采用Takara公司的exTaq酶进行菌液PCR验证后测序。 经测序获得序 列正确的阳性克隆再采用NEB公司限制性内切酶S。
15、peI和NotI进行双酶切， 产物再次电泳回 收， 然后连接到经相同限制性内切酶处理的pGreen002962-SK表达载体上， 重组质粒转 化入大肠杆菌DH5 感受态细胞后经50 gmL-1卡那霉素筛选， 用pGreen002962-SK表达载 体自带的检测引物(SEQ： NO.6和SEQ： NO.7)对阳性克隆菌液PCR后测序再验证。 将最终确认 正确构建的表达载体电转化入GV3101:pSoup农杆菌感受态细胞中， 涂布到含25 gmL-1庆 大霉素和50 gmL-1卡那霉素的固体LB培养基上， 28培养48h， 挑取阳性克隆菌液PCR验证。 将验证成功的阳性克隆在3ml含25 gmL-。
16、1庆大霉素和50 gmL-1卡那霉素的液体LB中， 200rpm， 28培养24h后， 用终浓度20灭菌甘油保存阳性克隆， 存放于-80备用。 0009 3.柑橘果皮瞬时表达分析： 将保存于-80的甘油菌划线接种于含25 gmL-1庆大 霉素和50 gmL-1卡那霉素的固体LB培养基上， 28培养48h进行菌落活化， 随后挑取小部分 活化后的菌落涂布于新的含以上两种抗生素的固体LB培养基上继续28培养12h， 接着将 活化两次的农杆菌收集到渗透液(10mMMES， 10mMMgCl2， 150mM乙酰丁香酮， pH5.6)中， 调 整其浓度为OD6000.75备用。 挑选一定数量大小均匀、 色。
17、泽一致且无机械伤病虫害的果实 进行基因瞬时表达实验。 先将注射器针头修剪到果皮厚度长度， 防止菌液注射不进或注射 进入果肉， 分别取1ml调整过浓度的含目的基因或对照的菌液用带针头的注射器分别注射 同一个果实的赤道面对立部位， 通过缓慢推动注射器来使菌液渗入果皮并使其扩散面积最 大化。 注射5d后， 与对照相比， 注射CitERF13的果皮叶绿素降解明显增强。 收集农杆菌渗透 区域果皮组织样品， 检测发现， 注射CitERF13的果皮叶绿素含量显著低于阴性对照 0010 本发明利用甜橙和克林曼丁柑橘基因组数据库得到CitERF13全长序列， 然后应用 普通PCR技术对电子克隆到的序列进行验证，。
18、 再利用pGreenII002962-SK表达载体， 结合 渗透液配方(10mMMES， 10mMMgCl2， 150mM乙酰丁香酮， pH5.6)， 以及独特的注射手法和严 格的对照(带针头的注射器分别注射到同一个果实的赤道面对立部位)， 得出一种柑橘果皮 相关基因瞬时表达方法。 本发明方法设计合理， 操作方便简单， 能快速将多年生果树柑橘的 基因进行同源功能验证， 可以为多年生果树的基因同源功能验证提供新思路和方法。 本方 法同样适用于其他果实的瞬时表达研究。 附图说明 说明书 2/4 页 4 CN 105969798 A 4 0011 附图1： 外源基因CitERF13(SEQ:NO.1。
19、)在甜橙果皮中的表达， 箭头所指方向为注射 口位置 0012 附图2： 外源基因CitERF13(SEQ:NO.1)在椪柑果皮中的表达， 箭头所指方向为注射 口位置。 具体实施方式 0013 下面结合附图和具体实施例， 以外源基因CitERF13在甜橙和椪柑果皮中的表达为 例， 对本发明做进一步阐述， 但实施例不限制本发明的保护范围。 0014 下述实施例中常规的基因操作方法参照 分子克隆实验指南 (第三版)。 0015 实施例1： 柑橘果皮CitERF13基因在甜橙果皮中瞬时表达 0016 1.RNA的提取和cDNA的合成： 柑橘不同组织器官(茎、 叶、 花、 果实)总RNA的提取采 用CT。
20、AB法进行， 并使用TURBODNase(Ambion， 美国)去除基因组DNA污染， 再取1.0 gRNA用 iScriptcDNASynthesisKit(Bio-Rad， 美国)逆转录成cDNA备用， 具体操纵按说明书进 行。 0017 2 .表达载体构建 ： 基于甜橙 和克林曼丁柑 橘基因组数 据库( http:/ www.citrusgenomedb.org)， 通过注释并利用已报道的拟南芥AP2/ERF家族基因序列进行 BLAST(TBLASTN和BLASTP)分析获得与叶绿素降解相关的CitERF13(SEQ： NO.1)。 利用PCR技 术， 结合引物对SEQ： NO.2和SE。
21、Q： NO.3扩增获得该基因， 并采用测序手段进一步验证。 根据已 确认的CitERF13(SEQ： NO.1)660bp全长序列和全长扩增引物SEQ： NO.2和SEQ： NO.3扩增该基 因的开放阅读框。 以柑橘不同组织器官(茎、 叶、 花、 果实)混合cDNA为模板， 参照Roche公司 FastStartHighFidelityPCRSystem进行PCR扩增， 其中30 lPCR体系为： 10Buffer3 l， dNTP2.4 l， 上/下游引物各0.6 l， 酶0.15 l， DEPC-H2O22.5 l， cDNA0.75 l； PCR程序 为： 95预变性5min； 95变性。
22、30sec， 58退火30sec， 72延伸1min， 35个热循环； 72延 伸10min， 4保存。 PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳回收后连接于Promega公司的pGEM-T easy载体上， 10 l连接体系为： 载体1 l， T4连接酶1 l， 缓冲液5 l， 回收产物3 l， 16过夜 连接。 将重组质粒采用热激法导入大肠杆菌DH5 感受态细胞中， 用不含任何抗生素的液体 LB培养基(购自上海生工生物工程股份有限公司， 配方为胰蛋白胨10.0g， 酵母粉5.0g， NaCl 10.0g)于37150rpm培养1h后， 均匀涂布于含100 gmL-1氨苄青霉素的固体LB培养基(配方 为。
23、胰蛋白胨10.0g， 酵母粉5.0g， NaCl10.0g， 琼脂糖15.0g)上初步筛选， 用T载体通用引物 (SEQ： NO.4和SEQ： NO.5)对阳性克隆采用Takara公司的exTaq酶进行菌液PCR验证后测序。 经 测序获得序列正确的阳性克隆再采用NEB公司限制性内切酶SpeI和NotI进行双酶切， 产物 再次电泳回收， 然后连接到经相同限制性内切酶处理的pGreen002962-SK表达载体上， 重组质粒转化入大肠杆菌DH5 感受态细胞后经50 gmL-1卡那霉素筛选， 用pGreen0029 62-SK表达载体自带的检测引物(SEQ： NO.6和SEQ： NO.7)对阳性克隆。
24、菌液PCR后测序再验证。 将最终确认正确构建的表达载体电转化入GV3101:pSoup农杆菌感受态细胞中， 涂布到含 25 gmL-1庆大霉素和50 gmL-1卡那霉素的固体LB培养基上， 28培养48h， 挑取阳性克隆 菌液PCR验证。 将验证成功的阳性克隆在3ml含25 gmL-1庆大霉素和50 gmL-1卡那霉素的 液体LB中， 200rpm， 28培养24h后， 用终浓度20灭菌甘油保存阳性克隆， 存放于-80备 用。 说明书 3/4 页 5 CN 105969798 A 5 0018 3.柑橘果皮瞬时表达分析： 将保存于-80的甘油菌划线接种于含25 gmL-1庆大 霉素和50 gm。
25、L-1卡那霉素的固体LB培养基上， 28培养48h进行菌落活化， 随后挑取小部分 活化后的菌落涂布于新的含以上两种抗生素的固体LB培养基上继续28培养12h， 接着将 活化两次的农杆菌收集到渗透液(10mMMES， 10mMMgCl2， 150mM乙酰丁香酮， pH5.6)中， 调 整其浓度为OD6000.75备用。 0019 盛花期后150d的甜橙果实于采后当天抵运实验室， 挑选一定数量大小均匀、 色泽 一致且无机械伤病虫害的果实进行后续实验。 先将注射器针头修剪到果皮厚度长度， 防止 菌液注射不进或注射进入果肉， 将盛有1ml菌液的注射器针头插入果皮， 缓慢推动注射器使 菌液渗入果皮并使扩。
26、散最大化。 每次实验中， 都要设计严格的阴性对照， 即注入含pGreen II002962-SK对照的农杆菌菌株渗透液， 目的基因和阴性对照注射部位为同一个果实的 赤道面对立部位。 注射5d后， 果皮表型和叶绿素含量如附图1， 与对照相比， 注射CitERF13的 果皮叶绿素降解明显增强。 收集农杆菌渗透区域果皮组织样品， 检测发现， 注射CitERF13的 果皮叶绿素含量显著低于阴性对照。 0020 实施例2： 柑橘果皮CitERF13基因在椪柑果皮中瞬时表达 0021 整个步骤同实施例1， 注射果实为椪柑果皮。 0022 采取盛花期后160d的椪柑果实进行瞬时表达实验。 注射5d后， 果皮。
27、表型和叶绿素 含量如附图2， 与对照相比， 注射CitERF13的果皮叶绿素降解明显增强。 收集农杆菌渗透区 域果皮组织样品， 检测发现， 注射CitERF13的果皮叶绿素含量显著低于阴性对照 0023 本发明利用柑橘基因组数据库分离得到与叶绿素降解相关的CitERF13， 将其搭载 到pGreenII002962-SK表达载体上， 并导入农杆菌GV3101:pSoup中， 结合渗透液配方 (10mMMES， 10mMMgCl2， 150mM乙酰丁香酮， pH5.6)， 以及独特的注射手法和严格的对照 (带针头的注射器分别注射到同一个果实的赤道面对立部位)， 得出一种柑橘果皮相关基因 瞬时表达方法， 为多年生果树的基因同源功能验证提供新思路和方法。 说明书 4/4 页 6 CN 105969798 A 6 0001 序列表 1/2 页 7 CN 105969798 A 7 0002 序列表 2/2 页 8 CN 105969798 A 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 105969798 A 9 。