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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610578875.9 (22)申请日 2016.07.21 (71)申请人 中国人民解放军第四军医大学 地址 710032 陕西省西安市长乐西路169号 (72)发明人 何丽洁景蕊张晓敏胡晋平 车明文石田田赵丽娟娄未娟 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 岳培华 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 一种基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能 诊断试剂盒及lncRNA-H19的应用 (57。
2、)摘要 本发明提供了一种基于lncRNA-H19的慢性 肾脏病肾功能诊断试剂盒及lncRNA-H19的应用。 该试剂盒包括RNA提取试剂、 lncRNA-H19引物、 反 转录体系和标准PCR反应体系。 本发明通过实验 发现lncRNA-H19在患者血清中的表达情况与慢 性肾脏病肾功能进展成正相关， lncRNA-H19的表 达越高， 患者的肾功能越好， 治疗后效果越好， 患 者预后越好， 提示lncRNA-H19可作为一种检查标 的来辅助对慢性肾脏病肾功能的诊断， 因此 lncRNA-H19能够作为慢性肾脏病患者肾功能的 诊断的相关指标， 可用于制作慢性肾脏病肾功能 诊断试剂和诊断试剂盒。 。
3、权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 105969897 A 2016.09.28 CN 105969897 A 1.lncRNA-H19作为检测标的物在制备慢性肾脏病肾功能诊断试剂方面的应用。 2.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的慢性肾脏病肾功能诊断试剂为肾小球 肾炎的诊断试剂。 3.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的慢性肾脏病肾功能诊断试剂为肾小球 纤维化程度的诊断试剂。 4.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的慢性肾脏病肾功能诊断试剂为肾小球 滤过率的诊断试剂。 5.lncRNA-H19作为检测标的物在制备慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒方。
4、面的应用。 6.一种基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒， 其特征在于： 包括RNA提取试 剂、 lncRNA-H19引物、 反转录体系和标准PCR反应体系， 其中lncRNA-H19引物包括LincRNA- H19-F和LincRNA-H19-R， LincRNA-H19-F的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示， LincRNA-H19-R 的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。 7.根据权利要求6所述的基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒， 其特征在 于： 所述的反转录体系包括5PrimeScriptRTMasterMix2 L， 所述的标准PCR反。
5、应体系 包括SYBR10 L、 无RNA酶水6 L和反转录的cDNA2 L， 所述的lncRNA-H19引物的含量为 LincRNA-H19-F1 L、 LincRNA-H19-R1 L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105969897 A 2 一种基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒及 lncRNA-H19的应用 技术领域 0001 本发明属于慢性肾脏病诊断试剂领域， 具体涉及一种基于lncRNA-H19的慢性肾脏 病肾功能诊断试剂盒及lncRNA-H19的应用。 背景技术 0002 慢性肾脏病是指各种超过三个月的慢性损害引起的肾脏结构和功能障碍， 包括肾 小球滤过率的。
6、下降、 肾脏病理的损伤， 患者血液、 尿液成分的异常以及肾脏影像学的异常。 引起慢性肾脏病的疾病主要包括各种原发的、 继发的肾小球肾炎， 还有一些肾小管的损伤 和肾血管的病变。 其中原发性肾小球肾炎是造成慢性肾功能不全甚至尿毒症的最重要的病 因之一。 在我国乃至世界范围内， IgA肾病是最常见的原发肾小球疾病之一， 以血尿为主要 临床表现， 超过30以上的患者在发病1020年后进展至终末期肾病(尿毒症)， 是引起我 国青年患者尿毒症的常见原因。 慢性肾脏病的诊断主要依靠肾活检， 并无其他替代方法， 但 是肾活检手术风险大、 花费高， 而且一般只允许做一次， 这很大程度上限制了后期对患者病 情的。
7、检测以及对疗效反应、 预后的评估。 因此探索适合的非侵入性肾小球肾炎诊断方法、 评 价治疗效果及预后一直是肾脏疾病领域中最紧迫的课题之一。 0003 LncRNA是一种长链非编码RNA(LongnoncodingRNAs， LncRNA， lincRNA)， 具有 mRNA样结构， 该分子不编码蛋白， 却参与细胞内多种过程的调控， 如参与了X染色体沉默， 基 因组印记以及染色质修饰， 转录激活， 转录干扰， 核内运输等多种重要的调控过程。 lncRNA- H19是在肝脏中被首次分离， 并且研究发现其为母系遗传。 随后， 关于lncRNA-H19的研究逐 渐增多。 通过查阅文献发现， lncRN。
8、A-H19可参与肿瘤的发生发展， 2015年TumourBiol上一 篇文章指出lncRNA-H19可以促进膀胱癌细胞的增生及代谢， 同年OncolLett也表明 lncRNA-H19的上调能促进EMT， 进而加速食管癌的侵袭。 南京医科大学第一附属医院2015年 发表在ScientificReports上的文章直接指出lncRNA-H19可以作为消化道肿瘤的新型分 子标记物。 同时也发现有文献报道出lncRNA-H19的缺失表达与肾脏Wilms瘤和横纹肌肉瘤 的发展密切相关。 但目前尚无有关lncRNA-H19与肾炎的相关性的相关报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种基于lnc。
9、RNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒及 lncRNA-H19的应用， 能够有助于慢性肾脏病肾功能的诊断。 0005 为达到上述目的， 本发明采用的技术方案为： 0006 lncRNA-H19作为检测标的物在制备慢性肾脏病肾功能诊断试剂方面的应用。 0007 所述的慢性肾脏病肾功能诊断试剂为肾小球肾炎的诊断试剂。 0008 所述的慢性肾脏病肾功能诊断试剂为肾小球纤维化程度的诊断试剂。 0009 所述的慢性肾脏病肾功能诊断试剂为肾小球滤过率的诊断试剂。 0010 lncRNA-H19作为检测标的物在制备慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒方面的应用。 说明书 1/5 页 3 CN 105969897 。
10、A 3 0011 一种基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒， 包括RNA提取试剂、 lncRNA-H19引物、 反转录体系和标准PCR反应体系， 其中lncRNA-H19引物包括LincRNA-H19- F和LincRNA-H19-R， LincRNA-H19-F的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示， LincRNA-H19-R的核 苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。 0012 所述的反转录体系包括5PrimeScriptRTMasterMix2 L， 所述的标准PCR反 应体系包括SYBR10 L、 无RNA酶水6 L和反转录的cDNA2 L， 所述的lncRNA-H。
11、19引物的含量为 LincRNA-H19-F1 L、 LincRNA-H19-R1 L。 0013 相对于现有技术， 本发明的有益效果为： 0014 本发明通过实验发现lncRNA-H19在患者血清中的表达情况与慢性肾脏病肾功能 进展成正相关， lncRNA-H19的表达越高， 患者的肾功能越好， 治疗后效果越好， 患者预后越 好， 提示lncRNA-H19可作为一种检查标的来辅助对慢性肾脏病肾功能的诊断， 因此lncRNA- H19能够作为慢性肾脏病患者肾功能的诊断的相关指标， 可用于制作慢性肾脏病肾功能诊 断试剂和诊断试剂盒。 0015 进一步的， 本发明通过体外实验结果证实， 肾小管上皮。
12、细胞低氧损伤后， lncRNA- H19显著降低， 提示lncRNA-H19可能与低氧保护相关。 动物体内实验结果提示： 用腺相关病 毒上调lncRNA-H19的表达进行肾脏的原位注射可减轻肾脏的间质纤维化。 提示lncRNA-H19 可作为一种检查标的来辅助对肾小球肾炎， 尤其是IgA肾病的诊断。 0016 本发明提供的基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒中包含检测 lncRNA-H19的相关引物及realtimePCR反应体系， 使用该试剂盒即可通过realtimePCR 技术检查患者血清中lncRNA-H19的表达情况， 有助于对慢性肾脏病患者肾功能的评估。 使 用该试剂。
13、盒诊断评估慢性肾脏病肾功能情况， 具有创伤性小、 检验方便、 灵敏度及特异度良 好的优点， 与传统的肾活检相比， 风险及费用均明显降低。 附图说明 0017 图1是病例组与对照组的组织中lncRNA-H19表达结果对比图(a)和ROC曲线(b)。 0018 图2是病例组与对照组血清中lincRNA-H19的表达结果对比图(a)和ROC曲线(b)。 0019 图3是血清中lncRNA-H19不同程度表达的患者的肾脏存活率。 0020 图4是IgA患者血清中lncRNA-H19的表达以及肾小球滤过率相关性分析结果。 0021 图5是IgA患者治疗前后血清中lncRNA-H19的表达(a)和肾小球滤。
14、过率的变化结果 (b)。 具体实施方式 0022 下面结合具体实验和附图对本发明做进一步详细说明。 0023 本发明通过qRT-PCR定量不同Lee氏分级的单纯IgA肾病、 膜性肾病、 轻度系膜增生 性肾小球肾炎等慢性肾脏病患者和正常健康人的血清中lncRNA-H19的表达， 并进行统计学 比较， 登记治疗效果、 建立随访系统， 判断lncRNA-H19在IgA肾病等CKD患者诊断、 治疗及评 价预后中的作用。 0024 为了检测血清中lncRNA-H19的表达， 本发明提供了一种基于lncRNA-H19的慢性肾 脏病肾功能诊断试剂盒， 该试剂盒能够针对肾病患者外周血中lncRNA-H19的表。
15、达情况进行 说明书 2/5 页 4 CN 105969897 A 4 检测， 能够快速、 准确的得出肾病患者外周血中lncRNA-H19的表达水平， 从而有助于医生对 患者病情的诊断。 0025 本发明提供的基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒具体包括以下内 容： RNA提取试剂、 lncRNA-H19引物(引物由合成， 未包含酶切位点， 未进行修饰， 具体 的核苷酸引物见表1)、 反转录体系(5PrimeScriptRTMasterMix和RNaseFreedH2O) 和标准PCR反应体系(SYBR:10 L； 无RNA酶水： 6 L； 引物R链及F链各1 L； 反转录的cD。
16、NA： 2 L)。 0026 表1引物核苷酸序列 0027 0028 注： -actin： -肌动蛋白， 内参。 0029先进行反转录， 反转录试剂盒购买自反转录体系中5PrimeScriptRT MasterMix2 L， 其中含有定量RT-PCR的反转录反应所需的所有试剂： PrimeScriptRTase、 RNaseInhibitor、 Random6mers、 OligodTPrimer、 dNTPMixture、 反应Buffer(含有Mg2 +)； PCR反应体系中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶， 染料为SYBRGreen， S。
17、YBRPremixExTaqII(TliRNaseHPlus2)的量为10 L。 0030 本发明提供的基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒的具体使用方法 为： 抽取全血3mL， 2500rpm离心15min取上清， 利用RNA提取试剂提取血清中的总RNA， 之后利 用反转录试剂进行反转录成cDNA， 利用PCR反应体系以及lncRNA-H19引物进行扩增， 根据 PCR结果进行病情分析。 0031 本发明提供的基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒具有以下优点： 引 物具有特异性， 反转录体系中含有预先混好的Premix形式， 只需加入模板RNA和水即可反 应，。
18、 含有Random6mers和OligodTPrimer2种反转录引物， 可在较短时间内高效合成 cDNA。 0032 使用本发明提供的基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒来检测血清 中lincRNA-H19的表达情况的具体步骤为： 0033 1)血液标本： 抽取全血3mL后， 2小时内2500rpm离心15min， 并取上层血清， 加入有 1mL的Trizol液的EP管中， 充分混合均匀。 0034 2)室温放置5min， 待其裂解完全。 然后加入200 L的氯仿， 盖紧EP管并剧烈摇荡15 秒钟。 0035 3)4下12000rpm离心20min(4离心机)， 取上层水相于。
19、一新的EP管中(千万不要 说明书 3/5 页 5 CN 105969897 A 5 将中间的沉淀层和下层液混入， 否则重新离心分离)， 加入等体积异丙醇， 温和颠倒混匀。 然 后同样4下12000rpm离心15min。 0036 4)小心地弃去上清液(此时EP管底部已有少量RNA析出)， 加入1mL的75乙醇， 涡 旋混匀， 4下12000rpm离心10min。 重复操作一次。 0037 5)弃去上清液(底部则为全部析出的RNA)， 室温或真空干燥510min(注意不要干 燥过分， 否则会降低RNA的溶解度)。 用30 LDEPC处理过的水将RNA溶解。 RNA可进行mRNA分 离， 或贮存于。
20、70乙醇并保存于-70。 0038 6)测定提取的RNA浓度及分光光度： 取0.2mLEP管， 加入1 L的RNA和99 L的DEPC 水， 在机子上(BIO-RAD核酸蛋白测定仪SmartSpecplus)测定所提取的血清RNA浓度。 0039 7)根据相应浓度配制20 L体系的lncRNA-H19反转录反应液(TAKARA试剂盒)， 并按 照3760min， 955min条件在反转录机子上进行反转录。 0040 8)制定相应的lincRNA-H19引物(通过生工公司合成)， 并配制标准PCR反应体系 (SYBR:10 L； 无RNA酶水： 6 L； 引物R链及F链各1 L； 反转录的cDN。
21、A： 2 L)在PCR机子上(Bio- RadC1000TouchTMPCR仪)按照9510min热启动， 9515s， 601min扩增40个循环的条件 进行， 每次均设去离子水为模板的阴性。 PCR扩增结果即可体现血清中lincRNA-H19的表达 情况。 0041 本发明进行了下列实验来判定lncRNA-H19与慢性肾小球肾炎的相关性。 0042 收集50例慢性肾小球肾炎患者血液标本发现： 同正常对照相比， lncRNA-H19在IgA 肾病患者血液中表达降低， 同时， 与IgA肾病患者已做的病理结果对比， 血清中lncRNA-H19 的表达与肾小球纤维化程度呈负相关， 与肾小球滤过率呈。
22、正相关， 可用以检测肾功能。 结果 如图1-图5所示。 0043 图1为病例组与对照组的组织中lncRNA-H19表达结果对比图(a)和ROC曲线(b)。 采 用realtimePCR方法检测正常对照组和IgA患者肾脏组织中lncRNA-H19的表达情况。 (NT： 正常组织； IgAN： IgA患者组织； 每一个代表一个样本。 )从图1中可以看出IgA患者肾脏组 织中lncRNA-H19的表达量降低。 0044 图2为病例组与对照组Serum(血清)中lincRNA-H19的表达结果对比图(a)和ROC曲 线(b)。 采用realtimePCR方法检测正常对照组和IgA患者血清中lncRNA。
23、-H19的表达情况。 图中Scr(血肌酐)、 BUN(尿素氮)、 CysC(胱抑素)是临床上肾病检测指标。 ROC曲线是受试者 工作特征曲线， 也称感受性曲线， 以敏感性为纵坐标代表真阳性率， (1-特异性)为横坐标， 代表假阳性率， ROC曲线下的面积AUC最大则诊断价值最好。 从表2中可以看出lncRNA-19测 试下的AUC低于临床上肾病指标Scr检测下的AUC， 高于BUN、 CysC。 (图2中NT表示正常组血 清； IgAN表示IgA患者血清； 每一个代表一个样本。 )从图2中可以看出IgA患者血清中 lncRNA-H19的表达量降低。 0045 表2图2中ROC曲线中的相关指标 。
24、说明书 4/5 页 6 CN 105969897 A 6 0046 0047 图3为血清中lncRNA-H19不同程度表达的患者的肾脏存活率。 经Kaplan-Meier method计算， 血清lncRNA-H19高表达组患者1年肾脏生存率为63.9、 中位生存时间为12 0.487个月， P0.001； 低表达组患者1年肾脏生存率为20.5、 中位生存时间为101.242个 月， P0.001。 0048 图4为IgA患者血清中lncRNA-H19的表达以及eGFR(肾小球滤过率)相关性分析结 果。 每一个代表一个样本。 肾小球滤过率是指单位时间内两肾生成滤液的量。 从图4中可 以看出Ig。
25、A患者血清中lncRNA-H19的表达与eGFR(肾小球滤过率)呈线性相关。 0049 图5为IgA患者治疗前后血清中lncRNA-H19的表达(a)和eGFR的变化结果(b)。 pre- treat表示治疗前、 post-treat表示治疗后， 每一个、 代表一个样本。 从图5中可以看出， IgA患者在治疗前后血清中lncRNA-H19的表达情况和肾小球滤过率的变化基本一致。 0050 上述结果充分肯定了lncRNA-H19与慢性肾脏病尤其是IgA肾病之间的关系。 因此 可以通过对可疑肾病患者外周血中lncRNA-H19的检测来为诊断肾脏疾病提供更加可靠的 临床实验证据。 说明书 5/5 页 7 CN 105969897 A 7 0001 序列表 1/2 页 8 CN 105969897 A 8 0002 序列表 2/2 页 9 CN 105969897 A 9 图1 图2 说明书附图 1/3 页 10 CN 105969897 A 10 图3 图4 说明书附图 2/3 页 11 CN 105969897 A 11 图5 说明书附图 3/3 页 12 CN 105969897 A 12 。