技术领域
本发明属于生物治疗技术领域，具体涉及一种抗人mCRP蛋白的单链抗体及其制备方法。
背景技术
C-反应蛋白单体（mCRP）是C-反应蛋白(CRP）的单体形式。它是炎症反应的一个重要标志，它还参与并加重了动脉粥样硬化形成、粥样斑块破裂及心肌梗死等炎症反应的过程。它出现在急性心梗、不稳定心绞痛等一些局部缺血缺氧导致的低pH和氧自由基富集或血小板活化等情况，其N端35～47位氨基酸（与公认的胆固醇结合序列一致）和C端199～206位氨基酸暴露形成新的抗原识别位点是其特征性标志。mCRP可以作用于中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞，促进IL-8，MCP-1及细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1以及E-选择素等的表达升高，进而加重局部细胞和组织的炎症状态。因此，mCRP不但可以作为炎症反应的标志，它也作为重要参与者参与了炎症反应过程及血小板的活化。mCRP可以在急性心肌梗死患者急性期外周血循环中通过ELISA或流式细胞分析方法被检测到，它对心肌梗死的诊断具有重要意义，并且急性心肌梗死患者外周血循环的mCRP水平可以反映急性心肌梗死患者的预后，因此mCRP可以作为急性心肌梗死的治疗靶点应用于临床。
发明人在前期专利基础上成功制备得到针对mCRP特征性C端199～206氨基酸表位并且具有中和mCRP不良生物学作用的功能性抗人mCRP单克隆抗体，但是完整的鼠源抗体具有免疫原性强易引起机体免疫损伤，并且相对分子量较大，体内应用时难以穿越血管进入靶部位。对抗体采用基因工程方法重组，表达由抗体重链可变区和轻链可变区通过人工合成的连接肽连接而成的抗体称为单链抗体（Single Chain Fragment Variable scFv），其相对分子质量小，容易穿过血管壁，是导向药物的首选载体，单链抗体无可结晶区域片段（Fc），免疫原性弱，不易引起超敏反应和排斥反应。单链抗体可以通过基因工程方法进行表达，尤其易于构建融合蛋白，是目前研究最多的小分子抗体。因此成功构建抗人mCRP单链抗体不仅可以更好的研究mCRP的生物学功能及其具体致病机制，还可以为急性心肌梗死的临床治疗提供便利。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种分子量小，对组织穿透力强，免疫原性弱的抗人mCRP单链抗体及其制备方法，本抗体识别序列为mCRP的C末端199~206八肽氨基酸表位。它是一种具有中和活性的功能性抗人mCRP单链抗体。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：
采用逆转录聚合酶链式反应技术，从中国专利 CN201210120262.2中制备的抗人mCRP杂交瘤细胞株基因组中扩增获得抗体的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH，然后用一段连接序列Linker连接而成的单链抗体，其氨基酸序列见SEQID NO：2。
所述的单链抗体基因序列为：
其中第1~369为抗人mCRP的轻链可变区，全长为369bp，第370~390为连接肽linker，全长21bp；391~804为抗人mCRP的重链可变区，全长为414bp。
所述抗人mCRP单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
1）克隆抗人mCRP单链抗体基因重链及轻链可变区，采用linker将其连接，并将其导入载体，构建重组载体；所述克隆抗人mCRP单链抗体基因的模板来自抗人mCRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C7；所述克隆抗人mCRP单链抗体基因是分别克隆抗人mCRP单克隆抗体重链可变区和抗人mCRP单克隆抗体轻链可变区基因，再通过重叠PCR技术通过连接获得scFv基因；
所述克隆抗人mCRP单链抗体重链可变区基因引物为：
F1 5’- GGGGATATCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT -3’ （SEQID NO：3）；
F2 5’- GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT -3’ （SEQID NO：4）；
F3 5’- GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT -3’ （SEQID NO：5）；
F4 5’- GGGGATATCCACCATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG -3’ （SEQID NO：6）；
R5’- GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGMRGAGACDGTGA -3’ （SEQID NO：7）；
所述克隆抗人mCRP单链抗体轻链可变区基因引物为：
F1 5’- GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT -3’ （SEQID NO：8）；
F2 5’- GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG -3’ （SEQID NO：9）；
F3 5’-GGGGATATCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA-3’ （SEQID NO：10）；
F4 5’- GGGGATATCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT -3’ （SEQID NO：11）；
F5 5’- GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG -3’ （SEQID NO：12）；
R 5’- GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG -3’ （SEQID NO：13）；
所述克隆抗人mCRP单链抗体轻链可变区基因引物为：
VKF 5’- GGGCCCAGGCGGCCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTG -3’ （SEQID NO：14）；
VKR5’-CCCGAAGTCCATGGAAGATCTAGAGGAACCACCCTTACGTTTTATTTCCAGCTT -3’ （SEQID NO：15）；
所述克隆抗人mCRP单链抗体重链可变区基因引物为：
VHF5’-ATAAAACGTAAGGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCATGGACTTCGGGTTGAGCTTG -3’ （SEQID NO：16）；
VHR5’- CCTGGCCGGCCTGGCCACCCGAAGTCCATGGTGGATC -3’ （SEQID NO：17）；
所述克隆抗人mCRP单链抗体表达载体引物为：
scFvF5’-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCATGAAGTTG -3’ （SEQID NO：18）；
scFvR5’-GAGGAGGAGGAGGAGGAGCCTGGCCGGCCTGGCCACCCGAAGT -3’ （SEQID NO：19）；
所述载体为pCom3XSS。
2）将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗人mCRP单链抗体的重组工程菌；所述宿主菌为E. coli BL21(DE3)；
3）将重组工程菌发酵培养，分离并纯化发酵液，即得到抗人mCRP单链抗体。
本发明的又一目的在于提供一种治疗或预防mCRP升高所导致疾病的药物，所述药物包含药学上有效量的所述的抗人mCRP蛋白的单链抗体。
本发明的有益效果：本发明利用抗人mCRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C7，通过RT-PCR技术获得了该抗体的重链、轻链可变区序列，进一步通过基因工程抗体技术获得抗人mCRP单链抗体基因，并构建包含该单链抗体基因的重组表达载体，进行抗人mCRP单链抗体的表达、纯化和鉴定。该反应蛋白单体单链抗体具有制备抗心血管栓塞、心肌梗死、脑血管栓塞或炎症治疗药物的应用前景。
附图说明
图1为抗mCRP轻链、重链和重组scFV DNA片段扩增琼脂糖凝胶电泳，图中泳道1,2和3分别为重组scFV、重链和轻链基因扩增产物。
图2为镍亲和柱与离子交换Q 柱纯化抗mCRP单链抗体蛋白SDS-PAGE 鉴定；
图中M为蛋白分子量标准，泳道1为pComb3XSS空载体表达上清，2为pComb3XSS空载体表达沉淀产物，3为pComb3XSS-scFv表达上清，4为pComb3XSS-scFv沉淀产物，5为pComb3XSS-scFv表达上清采用20mmol/l咪唑洗脱后纯化产物，6为pComb3XSS-scFv表达上清采用50mmol/l咪唑洗脱后纯化产物，7为pComb3XSS-scFv表达上清采用100mmol/l咪唑洗脱后纯化产物，8pComb3XSS-scFv表达上清采用200mmol/l咪唑洗脱后纯化产物，9为pComb3XSS-scFv表达上清采用300mmol/l咪唑洗脱后纯化产物。
图3为抗mCRP单链抗体蛋白的Western blot鉴定。
图4为采用Annexin V/PI法检测缺氧组（A）、缺氧+mCRP组（B）及缺氧+mCRP +mCRP单抗组（C）细胞凋亡情况；
图中，A、B和C分别表示单纯缺氧组、缺氧+mCRP组和缺氧+mCRP+抗mCRP单抗组，绿色为Annexin V标记反映细胞凋亡情况，红色为PI染色反映细胞死亡情况。图中可见mCRP可导致心肌细胞凋亡明显增加（B组），而加入抗mCRP单链抗体后（C组）细胞凋亡明显减少。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例 1 ：抗人 mCRP 单链抗体重链可变区基因（ VH ）和轻链可变区基因（ VL ）的克隆及拼接
其制备方法如下：
(1)总RNA的提取及cDNA第一链的合成
选择专利CN201210120262.2制备的抗人mCRP单克隆抗体(anti-mCRP mouse MAb)杂交瘤细胞株，采用含10% FBS的DMEM常规培养，待细胞对数期生长旺盛时，离心收集细胞约5×106个/ml，TRIZOL试剂提取细胞总RNA。参照SuperScript II 逆转录酶说明书，以总RNA 中的mRNA 为模板，逆转录合成mCRP单抗cDNA第一链。
(2)抗人mCRP单链抗体VH和VL基因克隆
以上步逆转录反应产物cDNA为模板，VH-F、VH-R为引物，扩增重链可变区基因。反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸2 min，反应循环27次，72℃再延伸10 min。同样以cDNA为模板，VL-F、VL-R为引物，扩增重链可变区基因。反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，反应循环27次，72℃再延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定抗人mCRP单链抗体VH基因约为350bp，而VL基因约为320bp（见图1）。胶回收试剂盒纯化目的DNA 片段，TE 洗脱。
(3) VH与VL的测序
纯化的VH PCR 产物与纯化的VL 产物，分别与pGEM-T Easy 载体连接，进行T-A 克隆后挑取单克隆进行测序。连接体系如下：5× Ligase Buffer 2μl，VH 或VL (50 ng/μl) 1μl，pGEM-T Easy (50 ng/μl) 1μl，T4 Ligase (1 U/μl)1μl，ddH2O 5μl，总计10μl。16 ℃连接过夜。过夜连接产物，与50 μl 感受态大肠杆菌Top 10 混匀转化。冰上30 min；4 ℃ 90 s；冰上3 min；加入200 μl LB 培养基37 ℃，170 rpm 震荡培养45 min；取100 μl 培养物涂于含有羧苄青霉素（终浓度100 μg/ml）的LB 平板；培养板正置培养30 min 后倒置培养过夜。挑取单克隆，接种于1 ml 含有羧苄青霉素（终浓度100 μg/ml）LB培养基中，37 ℃、270 rmp震荡培养6 h。菌液PCR 鉴定单克隆，挑取阳性克隆，1︰100接种于3 ml 含有羧苄青霉素（终浓度100 μg/ml）LB培养基中，37 ℃、220 rmp震荡培养过夜。提取质粒，直接测序，使用通用引物测序。分析测序结果，并在IMGT 数据库（http://imgt.cines.fr/）和VBASE2数据库（http://www. vbase2.org/）进行比对。经验证正确的序列，重新设计引物，并在VL的上游引物和VH的下游引物序列中引入SfiI酶的酶切位点，同时在VL的下游引物和VH的上游引物序列中加入了7个氨基酸的linker： GGTGGTTCCTCTAGATCTTCC（氨基酸为GGSSRSS）。以（1）步逆转录反应产物cDNA为模板，VH-F、VH-R为引物，扩增重链可变区基因。反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸2 min，反应循环27次，72℃再延伸10 min。同样以cDNA为模板，VK-F、VK-R为引物，扩增重链可变区基因。反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，反应循环27次，72℃再延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定抗人mCRP单链抗体VH基因和VL基因。胶回收试剂盒纯化目的DNA 片段，TE 洗脱。
VH、VL的拼接
以上步获得的VH、VK为模板，scFv-F、scFv-R为引物，采用重叠PCR法将轻链和重链通过7个氨基酸的linker（GGSSRSS）连接,获得VL-Linker-VH基因片段并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，VH-Linker-VL扩增产物为804bp（见图1）。
各步PCR扩增引物序列如下：
VH引物：
F15’- GGGGATATCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT -3’ （SEQID NO：3）；
F2 5’- GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT -3’ （SEQID NO：4）；
F3 5’- GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT -3’ （SEQID NO：5）；
F4 5’- GGGGATATCCACCATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG -3’ （SEQID NO：6）；
R5’- GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGMRGAGACDGTGA -3’ （SEQID NO：7）；
VL 引物：
F1 5’- GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT -3’ （SEQID NO：8）；
F2 5’- GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG -3’ （SEQID NO：9）；
F3 5’-GGGGATATCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA-3’ （SEQID NO：10）；
F4 5’- GGGGATATCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT -3’ （SEQID NO：11）；
F5 5’- GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG -3’ （SEQID NO：12）；
R 5’- GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG -3’ （SEQID NO：13）；
VK引物(含SfiI酶切位点或linker)：
VKF5’- GGGCCCAGGCGGCCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTG -3’ （SEQID NO：14）；
SfiI
VKR5’-CCCGAAGTCCATGGAAGATCTAGAGGAACCACCCTTACGTTTTATTTCCAGCTT -3’ （SEQID NO：15）； linker
VH引物(含SfiI酶切位点或linker)：
VHF5’-ATAAAACGTAAGGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCATGGACTTCGGGTTGAGCTTG -3’ （SEQID NO：16）；linker
VHR5’- CCTGGCCGGCCTGGCCACCCGAAGTCCATGGTGGATC -3’ （SEQID NO：17）；
SfiI
单链抗体scFv引物：
scFvF 5’-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCATGAAGTTG -3’ （SEQID NO：18）；
scFvR 5’-GAGGAGGAGGAGGAGGAGCCTGGCCGGCCTGGCCACCCGAAGT -3’ （SEQID NO：19）。
实施例 2 ：抗人 mCRP 单链抗体原核可溶表达载体的构建
利用克隆的抗人mCRP单链抗体基因，连接至原核表达载体pComb3XSS载体质粒(3076bp，含His标签)，构建了重组表达质粒pComb3XSS-VL-Linker-VH-His。该重组质粒具有氨苄青霉抗性，诱导下可分泌表达可溶性抗人mCRP单链抗体。
其制备方法如下：
表达载体pComb 3XSS 与VL-Linker-VH片段，分别进行Sfi I单酶切后回收相应片段，进行连接后转化大肠杆菌大肠杆菌DH5α接种于LB培养基，37°C，220rpm震荡6h。在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选单菌落，扩增后小量抽提质粒，并Sfi I酶切鉴定并测定序列。结果显示： VL-Linker-VH-His重组质粒经测序其基因序列如SEQID NO：1。
实施例 3 ：抗人 mCRP 单链抗体的表达及纯化
抗人mCRP单链抗体原核可溶表达载体经转化大肠杆菌、诱导表达和纯化后，可获得含268个氨基酸的抗人mCRP单链抗体蛋白。该蛋白含抗人mCRP单克隆抗体重链可变区编码的138个氨基酸、轻链可变区编码的123个氨基酸、连接Linker编码的7个氨基酸，其分子量约为29KD。
其制备方法如下：
(1)重组工程菌的构建
表达载体转化于感受态E. coli BL21(DE3)大肠杆菌中，置于摇床中，以220 g速度37°C条件下将感受态细胞在含100ug/mL氨苄西林的2×YT 培养基中孵育培养至OD600值至0.8-1.0之间。随后加入0.067% IPTG (Sigma, 美国)在25°C条件下诱导20小时后收集细胞，4°C条件下10,000 g离心10min，沉淀重悬于原培养液提及1/10的PBS缓冲液中，置于冰上超声破碎30min后再次在4°C条件下12,000 g离心10min，收集上清可溶性蛋白用于后续SDS-PAGE和Western免疫印迹分析。
(2)抗人单链抗体纯化
可溶性抗mCRPScFv蛋白上清采用His-trap Ni亲和层析柱在AKTA纯化系统进行纯化。首先采用10倍柱床体积的结合缓冲液（含50 mmol/LPBS, 0.5 mol/L氯化钠和20 mmol/L咪唑）平衡纯化柱，随后逐渐增加浓度至20、50、100、200、300 mmol/L洗脱目的蛋白。SDS-PAGE表明100 mmol/L浓度的咪唑可以有效洗脱目的蛋白。合并含目的蛋白的洗脱液后采用分子截留为10 kD超速离心管（Millipore，美国）浓缩目的蛋白至1 mg/mL。纯化样经12% SDS-PAGE凝胶电泳分析，其分子量约为29KD（见图2），与理论值一致。
实施例 4 ：抗人单链抗体的活性鉴定
制备的抗人mCRP单链抗体是否与mCRP的特异性结合，是其发挥作用的关键。
免疫印迹（Western-blot）检测单链抗体的特异性
其检测方法如下：
以mCRP蛋白为电泳样品进行SDS-PAGE电泳，按常规方法将蛋白转印于NC膜上。转印结束后，取出硝酸纤维素膜，作好标记，放入平皿中，用PBST（含5%脱脂奶粉）室温封闭过夜，将硝酸纤维素膜转移到封闭液稀释的抗人mCRP单链抗体中，室温作用2小时之后，用PBS洗膜3次，每次10分钟。再分别将膜转移入用封闭液1：1000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗His抗体中，室温作用2小时后，再用PBS洗3遍，每次10分钟，将新鲜配置的ECL显色液滴在NC膜上，涂布均匀后置于成像仪中显示Western-blot，分析结果。
免疫印迹结果表明此抗人mCRP单链抗体能与mCRP反应，见图3。
实施例 5 抗人 mCRP 单克隆抗体对心肌细胞凋亡的影响
具体实验方法如下：①心肌细胞的分离培养：取SD乳大鼠（1-3天）心尖部，0.125%胰酶分步消化收集细胞，差速贴壁法除去心肌成纤维细胞，在含10%胎牛血清DMEM培养液（热灭活血清以排除血清补体对实验干扰）中培养48～72h（采用细胞爬片方法时，取一块清净载玻片置于六孔板底部，让细胞自然生长于载玻片表面，用于Annexin V/PI实验），至细胞成片搏动，融合至培养皿70～85％时进行干预。②细胞分组：更换细胞培养液8h，细胞分为（1）对照组，缺氧6h；（2）缺氧+ mCRP干预组；（3）缺氧+ mCRP+抗mCRP单链抗体组；③细胞干预：无血清培养8小时后按实验分组情况：（1）组为缺氧组；（2）组细胞中加入mCRP至终浓度为50µg/ml；（3）组中同时加入终浓度为50µg/ml的mCRP和2C7细胞株来源抗mCRP单克隆抗体，各组细胞干预后均在充氮环境中培养8小时，收集细胞进行下述实验。细胞凋亡情况检测：采用Tunel法检测各组细胞凋亡情况，具体如下：吸尽培养液，加入1ml多聚甲醛固定， 4℃过夜。PBS洗两遍，每次3分钟，Proteinase K工作液通透处理细胞30 min，PBS漂洗3次×5min； 500μl的Binding Buffer中加入2μlAnnexin V-FITC， 5μlPropidium Iodide，随后加入样本，加盖玻片在暗湿盒中反应37℃×1h； PBS漂洗3次×5min；滴加一滴荧光淬灭封片液于覆盖有细胞的载玻片表面，立即在荧光显微镜下观察样本荧光情况，细胞发生凋亡时可见绿色团块状染色浓聚。
凋亡检测结果表明：心肌细胞加入人mCRP干预后细胞凋亡显著增加，而当加入抗人mCRP单抗保护后细胞凋亡得到明显抑制，见图4。
统计：以上实施例中的统计学方法为：利用SPSS 13.0统计软件，采用t检验及单因素方差分析方法进行统计学分析，数据以均数±标准差（X±SD）或中位数（25%~75%四分位数）表示。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京伯恩立施生物科技有限公司
<120> 一种抗人mCRP单链抗体及其应用
<130> 1111
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 804
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgttctgga ttcctgcttc cagcgatagt attttgatga cccagactcc actcccccct 60
ctggtcagtc ttggagatca agcctccaga tctagtatct cttgccagac cattgtacat 120
ggtaattatt tagaaggaaa cacctggtac ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc 180
ctgatcgtta aatactccaa ccggttttct ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga 240
ttcacaacat actcagggct caagatcagt agagtggagg ctgaggatct gggagtttat 300
tactgctttc agggttcact tgttccgtgg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaata 360
ggttccaagg gtaaacgttc tagatcttcc atggacttcg ggttgagctt ggttttcctt 420
gcccttattt taaaaggtgt ccagtgtgag gtgcaactgg tggagtctgg gggaggctta 480
gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc tgtgcagcct ctggattcag tttcagtacc 540
tatggcatgt cttgggttcg ccagactcca gacaagaggc tggaattggt cgctaccatt 600
gatactaatg gtggtagaac ctcttatcca gacagtgtga agggccgatt caccatctcc 660
agagacaatg ccaagagcac cctgtacctg caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca 720
gccatgtatt actgtgcaag agggaatgat ggttacaact ggtttgctta ctggggccaa 780
gggactctgg tcactgtctc ctca 804
<210> 2
<211> 268
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Ser Asp Ser Ile Leu Met Thr Gln Thr
1 5 10 15
Pro Leu Pro Pro Leu Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Arg Ser Ser
20 25 30
Ile Ser Cys Gln Thr Ile Val His Gly Asn Tyr Leu Glu Gly Asn Thr
35 40 45
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Val Lys
50 55 60
Tyr Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
65 70 75 80
Phe Thr Thr Tyr Ser Gly Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
85 90 95
Leu Gly Val Tyr Gly Ser Phe Gln Tyr Cys Leu Val Pro Trp Thr Phe
100 105 110
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Gly Gly Ser Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu
130 135 140
Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Ser Phe Ser Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys
180 185 190
Arg Leu Glu Leu Val Ala Thr Ile Asp Thr Asn Gly Gly Arg Thr Ser
195 200 205
Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
210 215 220
Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Asp Gly Tyr Asn Trp Phe Ala
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F1
<400> 3
ggggatatcc accatggrat gsagctgkgt matsctctt 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2
<400> 4
ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt 39
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3
<400> 5
ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct 38
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F4
<400> 6
ggggatatcc accatgatrg tgttragtct tytgtrcctg 40
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R5
<400> 7
gachgatggg gstgtygtgc tagctgmrga gacdgtga 38
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F1轻链
<400> 8
ggggatatcc accatggaga cagacacact cctgctat 38
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2轻链
<400> 9
ggggatatcc accatggatt ttcaagtgca gattttcag 39
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3轻链
<400> 10
ggggatatcc accatggagw cacakwctca ggtctttrta 40
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F4轻链
<400> 11
ggggatatcc accatgkccc cwrctcagyt yctkgt 36
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F5
<400> 12
ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg 37
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R
<400> 13
ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg 37
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VKF
<400> 14
gggcccaggc ggccatgaag ttgcctgtta ggctg 35
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VKR
<400> 15
cccgaagtcc atggaagatc tagaggaacc acccttacgt tttatttcca gctt 54
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHF
<400> 16
ataaaacgta agggtggttc ctctagatct tccatggact tcgggttgag cttg 54
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHR
<400> 17
cctggccggc ctggccaccc gaagtccatg gtggatc 37
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFvF
<400> 18
gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccatgaa gttg 44
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFvR
<400> 19
gaggaggagg aggaggagcc tggccggcct ggccacccga agt 43