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1、(10)授权公告号 CN 101709083 B (45)授权公告日 2012.02.01 CN 101709083 B *CN101709083B* (21)申请号 200910194210.8 (22)申请日 2009.11.27 C07K 14/435(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/18(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 广东工业大学 地址 510006 广东省广州市番禺区广州大学 城外环西路。
2、 100 号 (72)发明人 谭竹钧 黄锦兵 韩雅莉 陈雅雄 丁鸿 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 (54) 发明名称 一种来自蝎尾的纤溶活性蛋白及其制备方法 和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种来自蝎尾的纤溶活性蛋白 及其制备方法和应用， 本发明的一种来自蝎尾的 分子量为 37.69kD 纤溶活性蛋白其制备方法是 ： 将蝎尾洗净， 磨碎， 加入磷酸钠缓冲液， 4浸提过 夜 ； 离心去沉淀， 分段盐析， 取40-70部分 ； 最 后进行二乙氨基乙基 -32 纤维素离子交换层析柱 纯化， 用 Tris-HCl 缓冲液洗脱， 收集活性蛋白峰， 。
3、浓缩， 冻干 ； 本发明的纤溶活性蛋白在制备抗肿 瘤药物中的应用 ； 发明涉及的纤溶活性蛋白是蝎 尾中的一种单组分蛋白， 易于纯化和批量制备， 并 且纤溶活性强， 比活高， 无毒性 ； 分子量小、 抗原 反应低， 是理想的抗肿瘤药物。 (51)Int.Cl. 审查员 奚静 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 101709083 B1/1 页 2 1. 一种来自蝎尾的纤溶活性蛋白的制备方法， 其特征在于如下步骤 ： 1) 将蝎尾洗净， 磨碎， 加入磷酸钠缓冲液， 4浸提过夜 ； 2) 离心去沉淀， 分段盐析， 取 40 。
4、-70部分 ； 3) 最后进行二乙氨基乙基 -32 纤维素离子交换层析柱纯化， 用 Tris-HCl 缓冲液洗脱， 收集活性蛋白峰， 浓缩， 冻干 ； 所述步骤 1) 中缓冲液是 pH7.2 浓度为 0.02mol/L 的磷酸钠溶液， 蝎尾重量与磷酸钠缓 冲液体积之比为 1 5 ； 所述步骤 2) 中分段盐析是， 在上清液中加固体硫酸铵达 40饱和度， 8500 转 / 分， 4 离心泵中离心， 收集上清液 ； 再加入固体硫酸铵达70饱和度， 8500转/分， 4离心泵中离 心， 收集沉淀 ； 所述步骤 3) 中洗脱缓冲液是含有 1mol/L 氯化钠的 0.02mol/L pH8.0 的三羟甲。
5、基氨基 甲烷 - 盐酸。 2. 根据权利要求 1 所述的纤溶活性蛋白的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3) 中对纤 溶组分浓缩是指超滤浓缩而且浓缩之前要用透析袋进行除盐， 冻干是指冷风吹干或冷冻干 燥。 3. 含有权利要求 1 所述纤溶活性蛋白的抗肿瘤药物组合物。 4. 权利要求 1 所述的纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101709083 B1/5 页 3 一种来自蝎尾的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物领域， 尤其是蝎尾中纤溶活性蛋白的提取。本发明从蝎尾中提取 一种纤溶活性蛋白， 并且涉及这种纤溶活性蛋白的制备方法， 。
6、以及这种纤溶活性蛋白在制 备抗肿瘤药物中的应用。 背景技术 0002 蝎子为进化上最古老的物种之一， 距今已经有 4 亿年的历史， 在漫长的进化过程 中， 其形态几乎没有改变。世界各地大约有 1500 多种蝎， 分为 6 个科， 蝎之所以引起科学家 的极大兴趣， 不仅是因为蝎经历了漫长的进化历程， 更重要的是由于蝎尾腺分泌的蝎毒具 有极大的医学价值。 蝎毒含有多种生物活性组分， 包括酶、 多肽、 核苷、 脂类、 粘蛋白、 生物胺 及其他未知成分。蝎毒的主要活性成分是一类由 28-76 个氨基酸残基组成的小分子多肽。 它们绝大多数含 3-4 对二硫键， 可选择性地与动物可兴奋细胞膜上的钠钾钙氯离。
7、子通道结 合， 改变细胞对离子的通透能力 ； 少数不含二硫键， 具有舒缓激肽增效肽或抗菌等功能及功 能有待确定的新的蝎毒液多肽。 0003 蝎作为一种传统的药物应用于临床已于人有悠久的历史， 蝎是一种传统的中药 材， 其药性味成、 辛、 平， 有毒， 归肝经 ； 具有熄风镇痉、 攻毒散结、 通络止疼的功效 ； 传统验 方中主要用于治疗小儿惊风、 抽搐痉挛、 中风、 半身不遂、 破伤风、 风湿顽痹、 疮疡、 瘰疬和癫 痫。但用蝎毒制成注射剂或口服胶囊用来治病历史却不长。蝎毒临床应用方面的研究在国 外几乎是空白， 多以理论研究为主， 没有成型的蝎毒药品， 临床应用只是用抗蝎毒血清治疗 被蝎蛰伤患者。
8、。 中国对蝎毒的理论研究比国外晚， 但蝎毒制药进展较快， 目前中国的蝎毒药 品按剂型有 3 种 ： 第 1 种为注射粉剂 ； 第 2 种为口服胶囊 ； 第 3 种为药膏。 0004 1 蝎毒注射粉剂 0005 蝎毒千粉经过生化分离， 除去致痛物质和其他不需要组分， 经常规制药而成。 这种 制剂的主要成分是蝎毒神经毒素。 由于蝎毒成分复杂， 因此从中纯化特异的成分比较困难。 蝎毒药品注射粉刻工艺较复杂， 一般有以下3大步骤 ： 第1步， 蝎毒中药用成分的分离纯化。 本步骤的技术含量最高， 为制药过程的关键。因为蝎毒中含有十几种至几十种蛋白质， 许 多蛋白质是有毒的或不需要的成分， 该步的任务是将。
9、蝎毒通过生化方法分离， 取出药用蛋 白。不同厂家 ( 有些尚处于试验阶段 ) 使用的方法不同， 但都通过离子交换凝胶柱和分子 筛层析进行分离、 纯化。常用的离子交换凝胶有 CM-Sephadex C-50， CM-Sephadex C-25 和 DEAE-SephadexA-50 ； 常用的分子筛凝胶为 Sephadex C-75 和 Sephadex C-50。一般先进行 离子交换层析， 用含 NaCl 的缓冲液进行梯度洗脱 ； 然后进行分子筛层析。为获得高纯度蛋 白质， 往往需要反复使用离子交换层析和分子筛层析。目前利用基因工程制备蝎毒特异蛋 白质的研究正在进行之中， 但成本过高， 数量有。
10、限， 蝎毒仍是获得蝎毒蛋白质的主要来源。 第 2 步， 蝎毒有效成分浓度的测检。该步骤的目的有 2 个， 一是检测蝎毒是否分离合格， 是 否还有其他毒性物质存在。这些毒性物质包括出血毒素、 细胞毒素和其他神经毒素等。该 步骤第 2 个目的是为第 3 步做准备， 因为第 3 步是分装阶段， 如果不知道蛋白质的浓度， 就 说 明 书 CN 101709083 B2/5 页 4 不知道要加多少稀释液。目前定量测定蝎毒的方法有免疫扩散、 蛋白质含量的定量测定和 半数致死量测定。第 3 步， 一般制药过程。包括稀释、 过滤灭菌、 分装、 冷冻干燥， 封口和包 装。 由北京医科大学中国药物依赖性研究所和温。
11、州复旦生物工程有限公司研制的蝎毒注射 液 (scorpion venominjection) 已经获得生产批号， 新药批准号为 (96) 卫制申体第 11 号， 商品名为 “施康宁注射液” ， 临床多用于镇痛。尹燕东等， 报道了蝎毒肤对动物具有抗栓及 纤溶作用之后， 又对大鼠脑血栓模型进行了实验研究， 旨在开发适宜消化系统用药， 而且简 便、 安全和有效的溶栓制剂。 0006 2 胶囊类药品 0007 胶囊类药品的工艺包括原料的粉碎、 各种原料的配比和胶囊制备。蝎毒制剂一痹 痛灵胶囊是以蝎毒为主要原料的蝎毒胶囊类药品， 批号为粤湛卫药制剂 98DA10-01-121 号， 临床用于镇痛、 风湿。
12、性关节炎和类风湿性关节炎的治疗。 0008 3 蝎毒药膏 0009 国内蝎毒药膏一般停留在自制自用的状态， 没有批号和形成批量生产。 0010 至今仍未见到有关于蝎毒纤溶活性蛋白的相关报道。 发明内容 0011 本发明旨在提供一种来自蝎尾的分子量为 37.69 千道尔顿 kD 的单一组分的纤溶 活性蛋白。 0012 本发明的另一个目的是提供一种上述纤溶活性蛋白的制备方法。 0013 本发明的另一个目的是提供含有所述纤溶活性蛋白的抗肿瘤药物组合物。 0014 本发明的再一个目的是提供所述纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。 0015 本发明的目的是这样实现的 ： 0016 1) 将蝎尾洗净， 。
13、磨碎， 加入磷酸钠缓冲液， 4浸提过夜 ； 0017 2) 离心去沉淀， 分段盐析， 取 40 -70部分 ； 0018 3)最后进行二乙氨基乙基-32纤维素离子交换层析柱纯化， 用Tris-HCl缓冲液洗 脱， 收集活性蛋白峰， 浓缩， 冻干。 0019 所述步骤 1) 中缓冲液是 pH7.2 浓度为 0.02mol/L 的磷酸钠溶液， 蝎尾重量与磷酸 钠缓冲液体积之比为 1 5。 0020 所述步骤 2) 中分段盐析是， 在上清液中加固体硫酸铵达 40饱和度， 8500 转 / 分， 4离心泵中离心， 收集上清液 ； 再加入固体硫酸铵达70饱和度， 8500转/分， 4离心 泵中离心， 收。
14、集沉淀。 0021 所述步骤 3) 中洗脱缓冲液是含有 1mol/L 氯化钠的 0.02mol/L pH8.0 的三羟甲基 氨基甲烷 - 盐酸。 0022 所述步骤 3) 中对纤溶组分浓缩是指超滤浓缩而且浓缩之前要用透析袋进行除 盐， 冻干是指冷风吹干或冷冻干燥。 0023 含有所述纤溶活性蛋白的抗肿瘤药物组合物。 0024 所述纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。 0025 本发明的有益效果是 ： 0026 发明涉及的纤溶活性蛋白是蝎尾中的一种单组分蛋白， 分子量在 37.69KD 的一种 说 明 书 CN 101709083 B3/5 页 5 纯的纤溶活性蛋白， 易于纯化和批量制备， 并。
15、且纤溶活性强， 比活高， 无毒性 ； 分子量小、 抗 原反应低， 是理想的抗肿瘤药物。 附图说明 0027 图 1， SDS-PAGE 测定蝎毒纤溶活性蛋白的分子量。 具体实施方式 0028 下面能过实施例详细说明本发明， 但是这些实施例不在任何方面限制本发明的范 围。 0029 实施例 1 ： 0030 蝎毒纤溶活性蛋白的制备。 0031 材料 ： 东亚钳蝎 ( 产地 ： 中国 ) 0032 制备 ： 1、 粗提液的制备 0033 取蝎子， 剪蝎尾， 称重， 剪碎， 按 1 5( 重量体积 ) 的比例加入预冷的 0.02mol/ L 磷酸钠缓冲液 pH7.2， 研磨至糜状， 4浸提过夜。将浸。
16、提液在 8500 转 / 分， 4的离心泵 中离心 15min， 收集上清液， 在上清液中加固体硫酸铵达 40饱和度， 8500 转 / 分， 4离心 泵中离心， 收集上清液 ； 再加入固体硫酸铵达 70饱和度， 8500 转 / 分， 4离心泵中离心， 收集沉淀进行透析浓缩， 得到粗提液。 0034 2、 离子交换层析 0035 预先用 0.02mol/L pH8.0 的 Tris-HCl 缓冲液平衡 DEAE-32 纤维素柱， 用含 1mol/ LNaCl的0.02mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱， 分部收集器收集， 流速为1ml/min， 收集各个峰， 透析除 Na。
17、Cl， 浓缩， 冻干。 0036 3、 电泳 0037 将纯品用使用十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 用 5的浓缩胶和 12的 分离胶进行电泳， 考马斯亮兰 R-250 染色， 测定蛋白质纯品的分子量为 37.69KD( 如图 1 所 示 )， 具有纤溶活性。此为本发明的纤溶活性蛋白。 0038 实施例 2 ： 0039 本发明纤溶酶生物活性的测定。 0040 试剂 ： 0041 牛血纤维蛋白原溶液 ： 浓度 10mg/mL。牛血纤维蛋白原为 Sigma 公司产品。 0042 牛凝血酶 ： 浓度 100U/mL。牛凝血酶为 Sigma 公司产品。 0043 操作 ： 0044 配制0.。
18、8的琼脂糖， 煮沸冷却至45-55， 加入7mg/ml的牛血纤维蛋白原0.8ml， 6U/ml 的凝血酶 0.5ml， 迅速摇匀倒入直径 9cm 的培养皿中， 盖上玻璃盖， 冷却凝固后移到 4冰箱中保存半小时， 用 0.2ml 枪头在制备好的纤维蛋白凝胶板上打孔， 每孔加样 20L， 置37培养箱中培养24小时， 考马斯亮兰R-250染色30min， 脱色2h， 测定溶圈两垂直直径 的大小算出溶解圈的面积， 对照尿激酶标准曲线得出酶活力。 0045 实施例 3 ： 0046 含有本发明纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。 说 明 书 CN 101709083 B4/5 页 6 0047 分别。
19、测定此纤溶活性蛋白对小鼠腹水瘤细胞 S180 的抑制作用， 设计腹腔注射、 腋 下注射实体瘤相关实验， 以及运用 MTT 检测法检测此纤溶活性蛋白对 S180 细胞的直接作 用。 0048 1) 小鼠腹腔注射 S180 实验模型的建立及结果 0049 接种老鼠(202g)细胞密度8107， 腹腔注射， 每组设定8只重复组， 阳性对照环 磷酰胺组浓度为 20mg/ml， 阴性对照组为等体积生理盐水， 药物浓度组为上述蝎尾纤溶活性 蛋白浓度组 25mg/ml、 100mg/ml， 腹腔注药 7 天， 每次 20L， 7 天后测腹水细胞浓度， 计算各 组平均值， 记录数据， 结果如下表 ： 0050。
20、 0051 根据抑瘤率计算公式 ： 0052 抑瘤率 ( 对照组平均值 - 治疗组平均值 )/ 对照组平均值 100 0053 得出抑瘤率见下表 ： 0054 0055 由表可以看出蝎尾纤溶活性蛋白的抑瘤率在高浓度组时接近于阳性对照组环磷 酰胺。 0056 2) 小鼠 S180 实体瘤模型的建立及结果 0057 接种老鼠(202g)细胞密度7.6107， 每组设定8只重复组， 腋下注射， 阳性对照 环磷酰胺组浓度 20mg/ml， 阴性对照组为等体积生理盐水， 药物浓度组为上述蝎尾纤溶活性 蛋白浓度组， 设定低中高浓度三个浓度组。 浓度分别为25mg/ml、 50mg/ml、 100mg/ml。
21、， 腹腔注 药 7 天， 每次 20L， 7 天后测实体瘤体积和脾重， 计算平均值， 记录数据， 结果如下表 ： 0058 0059 由上表可知， 蝎尾纤溶活性蛋白的脾重指数都高于阳性对照组和阴性对照组， 说 明其对小鼠的生长具有很小的毒害作用， 同时在中浓度组和高浓度组的抑瘤率明显高于阳 性对照组环磷酰胺， 但在低浓度组时效果不明显。 0060 3)MTT 检测蝎毒纤溶活性蛋白对的 S180 作用 0061 取对数生长期S180细胞， 用培养液调细胞浓度至5104/ml， 将细胞加入96孔板， 每孔加样 100L， 将细胞放入 37 CO2培养箱培养 6 个小时， 加药， 设空白对照组和阳性。
22、对 照组， 空白对照组加入消毒灭菌过的 PBS20L， 阳性对照组加入 0.5mg/ml 的顺铂 20L， 设定蝎毒纤溶活性蛋白药物浓度组为 1、 2、 4、 8、 16mg/ml， 培养 24h、 48h、 72h， 于培养结束 前 4h， 各孔加入 5mg/ml 的 MTT20L， 4h 后取出， 弃去上清液， 各孔加入 DMSO100L， 震荡 说 明 书 CN 101709083 B5/5 页 7 5min， 使紫色结晶物溶解， 离心， 在酶标仪中测定 490nm 处的 OD 值， 结果如下表 ： 0062 0063 (*P 0.1， *P 0.05) 0064 由上表可以看出 24h 时 16mg/ml 的纤溶活性蛋白的抑瘤率与阳性对照组相近， 随 着浓度的降低抑瘤率慢慢下降， 48h 时纤溶活性蛋白的抑瘤率随着浓度的降低也在逐渐降 低， 72h 使抑瘤率达到最大， 高浓度组达到 56左右， 与阳性对照组相近。 0065 因此， 实施例 3 可以证明蝎尾纤溶活性蛋白具有抗肿瘤作用。 说 明 书 CN 101709083 B1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 。