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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610361321.3 (22)申请日 2016.05.30 (71)申请人 东北师范大学 地址 130024 吉林省长春市人民大街5268 号 (72)发明人 朱筱娟陈晶滢曹让娟何潇潇 (74)专利代理机构 长春市东师专利事务所 22202 代理人 刘延军李荣武 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) (54)发明名称 靶向沉默FOXG1的shRNA (57)摘要 本发明属于生物工程中的DNA重组技术领 域， 具体涉及特异性靶向沉默FOXG1的s。
2、hRNA， 首 先是根据人源的FOXG1的CDS区序列设计出19bp 的目的片段， 合成的目的片段两端带有合适的酶 切位点， 将目的片段连接到PLL3.7载体上， 连接 转化， 挑取阳性克隆鉴定。 鉴定正确后， 将提取的 质粒送去进行测序， 测序比对正确之后转染细胞 并进行FOXG1沉默效率的检测。 设计合成了能够 靶向人源FOXG1的19bp的shRNA ， 序列为 GGACCAGACTGTAAGTGAA。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 105969771 A 2016.09.28 CN 105969771 A 1.一种能够靶向人源FOXG1的序列， 其特征是序列为： GGAC。
3、CAGACTGTAAGTGAA。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105969771 A 2 靶向沉默FOXG1的shRNA 技术领域 0001 本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域， 具体涉及特异性靶向沉默FOXG1的 shRNA。 背景技术 0002 FOXG1又叫BF-1 ， qin ， ChickenBrainFactor1或XBF-1， 目前统一命名， 在小鼠 中称为Foxg1， 在人类中称为FOXG1， 在其他中称为FoxG1， 它是一个在进化上高度保守的转 录抑制因子， 属于叉头框转录因子家族， 主要表达在大脑中。 FOXG1由DNA结合结构域和转录 调节区组成， 该基因的。
4、转录抑制作用主要是通过其JBD结合结构域(JARID1B-binding domain)和Groucho结合结构域 （Groucho-bindingdomain） 与其它转录共阻遏物结合， 进而 调节基因的转录。 0003 自发现以来， FOXG1在脑中的作用被广泛的研究， 近年来的研究表明， 在胚胎期， Foxg1在嘴侧神经管和端脑神经上皮的祖细胞中有表达； 在成年期， Foxg1主要分布在由端 脑发育而来的大脑皮层、 海马、 嗅球和基底神经节。 它能通过调节增殖分化来调节端脑的发 育以及端脑的神经生， 它还能参与海马的神经发生以及视神经的发育。 随着对FOXG1家族的 了解， FOXG1在。
5、肿瘤中的作用也逐渐被重视起来， 在肿瘤中能调节增殖， 来促进肿瘤的发生。 在人类胶质瘤中， FOXG1的高表达预示着肿瘤具有高的浸润能力和生长能力， 这就暗示了在 医学上更加难以治愈， 所以特异性的沉默FOXG1对于其在疾病中作用研究至关重要。 发明内容 0004 本发明的目的是合成特定的能够靶向沉默FOXG1的shRNA， 并构建其表达载体。 0005 本发明中所需要构建的主要是FOXG1的沉默表达载体。 核心沉默表达载体构建分 为两个大的步骤， 首先是根据人源的FOXG1的CDS区序列设计出19bp的目的片段， 合成的目 的片段两端带有合适的酶切位点， 将目的片段连接到PLL3.7载体上，。
6、 连接转化， 挑取阳性克 隆鉴定。 鉴定正确后， 将提取的质粒送去进行测序， 测序比对正确之后转染细胞并进行 FOXG1沉默效率的检测。 0006 本发明中设计合成了能够靶向人源FOXG1的19bp的shRNA， 序列为 GGACCAGACTGTAAGTGAA 能够特异性沉默FOXG1的表达载体的构建包括以下步骤： 第一步， 序列设计 根据人源FOXG1基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别 FOXG1的沉默序列。 0007 第二步， 对靶序列进行退火成双链以及对PLL3.7载体进行酶切 将核心载体PLL3.7进行双酶切后,利用胶回收试剂盒回收线性化载体， 为下一步。
7、的实 验准备。 0008 将合成的靶序列利用退火buffer溶解之后， 利用PCR仪进行退火， 95/4min， 72 说明书 1/3 页 3 CN 105969771 A 3 /10min， 之后降温到4。 0009 第三步， 将合成的靶序列以及核心载体进行连接 将上一步中的两个产物在T4连接酶的作用下进行连接， 经转化、 提取等步骤获得沉默 载体。 0010 第四步， 沉默靶蛋白效率的检测 经转染细胞后提取蛋白， 利用westernblot等试验手段检测沉默效率。 沉默FOXG1之 后， 利用CCK8检测细胞的增殖， 实验结果显示， 沉默FOXG1之后能抑制细胞的增殖。 0011 本发明沉。
8、默FOXG1之后能抑制U87MG胶质瘤细胞的增殖， 为更加深入的研究FOXG1 在肿瘤中的功能以及FOXG1在选择、 制备治疗肿瘤药物提供了有效的手段。 0012 附图说明 0013 图1为pLL3.7载体双酶切凝胶电泳图； 图2为FOXG1shRNA菌液PCR结果凝胶电泳图， 框中为阳性结果； 图3为将阳性克隆进行质粒提取， 之后进行双酶切验证， 框中为阳性结果； 图4为外源检测FOXG1shRNA沉默效率图； 图5为沉默FOXG1之后影响细胞的增殖图。 0014 本发明中设计合成的19bp的目的片段， 能够特异性的沉默FOXG1， 同时也为构建 FOXG1-shRNA提供关键的序列片段。 。
9、FOXG1是转录因子， 在神经发生以及肿瘤中都有很重要 的作用。 经研究表明， FOXG1在肿瘤的生长以及肿瘤的进程中发挥一定的作用， 构建成功的 载体， 能够用来特异性的沉默FOXG1， 沉默FOXG1能够降低肿瘤的转移潜能， 所以能够为选 择、 制备治疗肿瘤药物提供了理论基础。 具体实施方式 0015 实施例一:特异性沉默靶标蛋白FOXG1的表达载体构建 1、 特异性沉默靶蛋白FOXG1的序列设计 （1） 根据人源FOXG1基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计， 设计的原 则： 19bp的特异性结合FOXG1的序列的GC含量为45%-55%， 退火温度45-65， 同时。
10、按照载 体的要求， 第一个碱基必须为G。 将选取的片段进行BLAST人基因组比对， 选择特异性识别人 源FOXG1的序列。 0016 （2） Hpa -GN18-TT-loop-81NC-Xho 形式合成一段59bp序列， 81NC为NG18的反向 互补， 5 端为Hpa 酶切位点， 3 端为Xho 酶切位点。 设计合成的特异性识别FOXG1的序列片 段为GGACCAGACTGTAAGTGAA。 0017 2、 特异性沉默靶蛋白FOXG1的序列的合成与储存 （1） 将合成的两段Oligo利用退火buffer溶解至50M， 各取100l混合。 0018 （2） 各取10l上述储存液， 放在PCR。
11、管中， 混匀放入PCR仪中， 95变性4min， 72 退火10min， 之后可以放在4保存。 0019 3、 FOXG1沉默载体的构建 （1） 取1gPLL3.7载体， 利用Hpa 和Xho 进行双酶切， 电泳， 回收线性PLL3.7大片段 【图 说明书 2/3 页 4 CN 105969771 A 4 1】 。 0020 （2） 连接和转化。 将线性PLL3.7浓度稀释至160ng/， 将退火形成的DNA片段稀释成 合适的浓度， 进行连接反应 （Promega公司的T4DNA连接酶） 16过夜连接， 将连接产物转化Stb13感受态细胞， 涂布在具有氨苄青霉素的LB平板 上。 0021 （3。
12、） 阳性克隆鉴定。 在转化平板上挑取单克隆摇菌， 试剂盒提取质粒， 通过PCR以及 酶切鉴定阳性克隆 【图2】【图3】 。 鉴定引物为pLL3.7test-F： 5 -GCACAGACTTGTGGGAGAAG- 3 ， pLL3.7test-R:5 CCTGCTGGAATCTCGTGAA-3 。 以U6启动子为测序引物， 送长春库美基因 测序。 0022 实施例二: 沉默靶蛋白效率的检测 （1） 将control、 FOXG1shRNA分别与Flag-FOXG1表达载体通过PEI共同转染进入293T 细胞 （2） 提取细胞总蛋白， 利用Westernblot免疫印迹分析， 转入FOXG1沉默载体后， FOXG1 表达量显著降低， -Tubulin为内参 【图4】 。 0023 实施例三: 沉默FOXG1之后检测细胞的增殖， 结果显示， 沉默之后能抑制细胞的增殖。 0024 序列表 东北师范大学 靶向沉默FOXG1的shRNA 2013-3-30 19 1 19 DNA 人工序列 misc_RNA (1). (19) 1 GGACCAGACTGTAAGTGAA。 说明书 3/3 页 5 CN 105969771 A 5 图 1 图 2 说明书附图 1/2 页 6 CN 105969771 A 6 图 3 图 4 图 5 说明书附图 2/2 页 7 CN 105969771 A 7 。