凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌ZF04及在生防中应用.pdf

《凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌ZF04及在生防中应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌ZF04及在生防中应用.pdf（16页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610297834.2 (22)申请日 2016.04.28 (83)生物保藏信息 GDMCC No.60014 2016.03.10 (71)申请人 韩山师范学院 地址 521041 广东省潮州市湘桥区桥东 (72)发明人 傅力蔡丽王忠合王军 侯小桢 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌。

2、ZF04及在 生防中应用 (57)摘要 本发明公开一种凤凰单丛茶树内生拮抗芽 孢杆菌ZF04及在生防中应用， 通过从凤凰单丛茶 树根中取样， 分离纯化、 筛选和培养， 获得一株有 较好生防效果的芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04 GDMCCNo： 60014， 菌种在生理生化特性和分子水 平方面与常见的芽孢杆菌具有明显的差异， 是一 种典型的新菌种， ZF04菌株对梨果黑斑病菌、 核 桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌和立枯丝核菌有较好 的抑菌作用， 菌丝生长抑制率分别为77.55、 83.30、 74.52和75.19， ZF04对瓜果腐霉菌 丝生长抑制率为31.60， 是一种典型性突出、 。

3、专 一性强的生防菌， 在生防中具有广泛的应用价 值。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图3页 CN 105969682 A 2016.09.28 CN 105969682 A 1.一种凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04， 其特征在于， 所述的芽 孢杆菌(Bacillussp.)ZF04菌种保藏号为GDMCCNo： 60014。 2.如权利要求1所述凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04在防治梨果 黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105969682 A 2。

4、 凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌ZF04及在生防中应用 技术领域 0001 本发明涉及农业生物生防技术领域， 具体涉及一种从凤凰单丛茶树内生拮抗菌及 其在生物防治中应用的技术领域。 背景技术 0002 植物内生菌(Endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物各种 组织内部或细胞间隙， 而不使宿主产生明显病理症状的微生物。 拮抗内生菌是指能够产生 拮抗作用的微生物。 植物体是一个复杂的微生态系统， 健康植物体内含有大量的内生细菌 (EndophyticBacteria)， 已从小麦、 棉花、 水稻、 花生、 马铃薯、 番茄、 柠檬、 柑桔等50多种植 物体内分离鉴定出内生细菌5。

5、0多个属， 几乎所有健康植物体内均含有内生细菌。 0003 在农业种植业中， 梨、 核桃、 红枣、 棉花等农作物遭受梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病 菌、 梨腐烂病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核病菌等的侵害严重， 化学杀菌剂是控制以上病害 常用的方法， 但化学杀菌剂污染环境， 诱导病菌产生抗药性， 破坏生态平衡， 它的残留问题 令人担忧， 因此植物病害的生物防治研究越来越受到重视。 0004 目前植物病害的生物防治是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进 行有效防治的技术与方法。 单丛茶是我国重要的茶树品种， 从单丛茶树内生细菌中筛选出 对植物病原菌有抑菌作用的拮抗菌株， 对开发生物防腐剂及抑。

6、菌剂， 保障食品和环境安全 具有重要的意义。 0005 国外已有报道从不同的植物中分离出Acinotobacter、 Agrobacterium、 Alcaligenes、 Bacillus、 Clavibacter、 Enterobacter、 Erwinia、 Klebsiella、 Phyllobacterium、 Pseudomonas和Serratia等属的内生细菌。 国内黄晓琴， 张丽霞等从茶树 内生菌中进行了冰核细菌拮抗菌的筛选， 得到菌株Y1， 通过对其进行形态学观察、 生理生化 指标测定及16SrDNA序列测定， 鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefa。

7、ciens)。 罗 明对新疆棉花植株组织中的内生细菌进行分离， 共得到102个菌株， 初步鉴定分属于芽孢杆 菌属(Bacillussp.)、 黄单孢菌属(Xanthomonassp.)、 假单孢菌属(Pseudomonassp.)、 欧 文氏菌属(Erwiniasp.)及短小杆菌属(Curtobacteriumsp.)， 从中筛选出对棉花枯萎病 菌有体外拮抗活性的菌株22个， 对立枯丝核菌有体外拮抗活性的菌株15株。 0006 生物防治不仅可降低对环境的影响， 还不易产生抗药性。 芽孢杆菌营养简单， 在自 然界中广泛存在， 对人畜无毒无害， 不污染环境， 可研究其用于植物病害的生物防治， 为研。

8、 究开发生物防控菌杀菌剂奠定基础。 0007 凤凰单丛茶产于潮州市凤凰山， 素以滋味浓醇鲜爽， 香气似天然花果香著称， 种植 历史悠久， 种质资源丰富， 已达80多个品系。 目前对凤凰单丛茶的研究主要集中在品种鉴 定、 遗产多样性分析、 品质化学特性、 生理活性、 质量安全和做青工艺的研究， 对于凤凰单丛 茶树内生菌的研究不多。 因此对凤凰单丛茶树内生菌进行分离， 从中筛选出具有抑菌活性 的拮抗菌株都具有重要的意义。 说明书 1/9 页 3 CN 105969682 A 3 发明内容 0008 针对现有技术中关于凤凰单丛茶树内生细菌对常见细菌腐败菌和梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌。

9、、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌的研究未见报道， 本 发明旨在于提供一种新的凤凰单丛茶树内生拮抗芽孢杆菌ZF04及在生防中应用， 通过试验 证明获得新的菌种对梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉 菌等植物病原菌具有相对高防治能力且性能稳定， 表明本发明提供一种新的抗性菌株， 作 为植物病原菌的生物防治材料， 无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂， 该菌都具有很 好的应用前景。 0009 本发明采用的主要技术方案： 0010 本发明通过凤凰单丛茶树根中分离筛选出一株对梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌有较高抑制。

10、效果的细菌菌株ZF04， 是与常见的芽孢杆菌(Bacillus)不同的新菌种， 通过利用分离出的新菌种对梨果黑斑病 菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌进行抑菌试验， 并提供一种利用芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014进行植物病原菌生物防治 中应用技术方案， ZF04菌株对梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌和立枯丝核菌有 较好的抑菌作用， 菌丝生长抑制率分别为77.55、 83.30、 74.52和75.19， ZF04对瓜 果腐霉菌丝生长抑制率为31.60， 作为植物病原菌的生物防治材料， 无论开发新的生物农 药。

11、或者生物防治菌剂， 该菌都具有很好的应用前景。 0011 本发明通过从凤凰单丛茶树根中取样， 进行分离、 筛选和培养， 从中筛选出一株编 号为ZF04的菌株， 经微生物学分类与鉴定， 该菌株从其分类学角度属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株。 本发明采用菌株编号为ZF04的细菌菌株， 通过对所获菌株进行形态特征、 生理生 化特性及总DNA的提取、 16SrDNA的PCR扩增和序列测定及系统发育分析， 获得一种与常见的 芽孢杆菌(Bacillussp.)菌株存在明显不同特性的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株， 从科学角 度证明了是一株新菌， 并确定其分类地位。 同时， 利用筛选出的菌株。

12、ZF04对梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌进行抑菌试验， ZF04菌株对梨果黑 斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌和立枯丝核菌有较好的抑菌作用， 菌丝生长抑制率分 别为77.55、 83.30、 74.52和75.19， ZF04对瓜果腐霉菌丝生长抑制率为31.60， 是 一种典型性突出、 专一性强的生防菌。 0012 本发明具体提供一种芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014， 通过从凤凰 单丛茶树根中分离、 筛选和培养， 获得一批芽孢杆菌属(Bacillussp.)， 从中筛选出一株对 防治梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌。

13、、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌方面具有突出 功效的芽孢杆菌ZF04， 经微生物学分类与鉴定， 属于芽孢杆菌(Bacillussp.)菌株。 0013 具体的， 本发明通过从凤凰单丛茶树根中取样， 样本是凤凰单丛茶树根， 采集于广 东省潮州饶平县浮滨镇， 树龄15、 25和50年， 种植海拔高度750m， 茶树品种为凤凰单丛茶水 仙， 进行分离、 筛选和培养， 从中筛选出一株编号为ZF04的菌株， 经微生物学分类与鉴定， 该 菌株属于芽孢杆菌(Bacillussp.)菌株。 本发明采用菌株编号为ZF04的细菌菌株， 该菌株 已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位： 广东省微。

14、生物菌种保藏中心 (GDMCC)。 地址： 广州市先烈中路100号大院59号楼5楼， 广东省微生物研究所， 邮编： 510075。 说明书 2/9 页 4 CN 105969682 A 4 保藏日期为2016年3月10日， 菌种保藏号为GDMCCNo： 60014。 该菌株最适生长条件为： 温度 37， 培养基采用常见的牛肉膏蛋白胨液体培养基、 营养琼脂培养基。 0014 本发明提供的ZF04菌株， 经20h培养后， 在营养琼脂培养基上菌落为白色， 干燥， 不 透明， 中间褶皱凸起， 周边放射状， 边缘不整齐。 将菌种ZF04通过镜检观察， 该菌株属革兰氏 染色阳性， 在显微镜下个体形态为短杆。

15、状， 单个或成链状排列， 产芽孢。 根据以上形态特征， 参照 伯杰氏细菌鉴定手册 第八版及 常见细菌鉴定手册 对菌株进行分类鉴定， 并结合分 子生物学测序， 初步鉴定该菌株为芽孢杆菌(Bacillussp.)。 经分子测序结果表明， 芽孢杆 菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014的16SrDNA基因序列为1492bp， 与NCBI数据库 BacilluscereusATCC14579(NR_074540.1)同源性最高， 最高相似性为94， 但本发明提 供的芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014与常见的芽孢杆菌存在明显的生理生 化特性差。

16、异和分子水平的差异性， 依据菌种生理生化特性分析， 分子水平分析及系统分类 学的综合鉴定， 编号为ZF04的菌种是一种典型的新菌种， 有别于常见的芽孢杆菌 (Bacillus)， 与常见的细菌菌种相比， 其对盐的耐受能力更强， 对梨果黑斑病菌、 核桃叶枯 病菌和红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌有较好的抑制作用， 但是依据菌种生理生 化特性分析， 分子水平分析及系统分类学的综合鉴定， 将编号为ZF04的菌种大致分类归属 为芽孢杆菌(Bacillussp.)。 0015 本发明进而提供芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014的分离和培养方 法。 0016 (1)。

17、分离培养基采用： 牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏5g、 蛋白胨10g、 氯化钠 5g、 蒸馏水1000mL， pH7.0-7.2， 营养琼脂培养基为蛋白胨10g、 牛肉膏3g、 氯化钠5g、 琼脂 15g、 蒸馏水1000mL。 0017 (2)分离和筛选条件： 0018 根中内生细菌的分离： 采用组织块培养法， 将表面消毒后的根剪成0.50.5cm的 组织块， 根采用树龄15、 25和50年， 种植海拔高度750m， 茶树品种为凤凰单丛茶水仙， 每三个 组织块为一组置于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 37下培养20h， 取80 L涂布于营养琼 脂平板， 37培养18h。 待长出细菌菌落后。

18、， 挑取形状、 大小、 颜色等不同的菌落分别划线涂 布于营养琼脂平板， 37培养18h， 反复在营养琼脂平板上划线分离纯化， 直至得到单个纯 菌落。 0019 经培养筛选确定的芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo.60014在营养琼脂培 养基上菌落为白色， 干燥， 不透明， 中间褶皱凸起， 周边放射状； 营养琼脂培养基： 蛋白胨 10g、 牛肉膏3g、 氯化钠5g、 琼脂15g、 蒸馏水1000mL， pH自然。 0020 进一步， 本发明提供一种芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014在生防 中的应用， 通过将芽孢杆菌(Bacillussp.。

19、)ZF04GDMCCNo： 60014在防治梨果黑斑病菌、 核 桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌中应用， ZF04菌株对梨 果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌和红枣黑斑病菌和立枯丝核菌有较好的抑菌作用， 菌丝生长抑 制率分别为77.55、 83.30、 74.52和75.19， ZF04对瓜果腐霉菌丝生长抑制率为 31.60， 是一种典型性突出、 专一性强的生防菌。 0021 通过实施本发明具体技术指标， 实现本发明内容， 可以达到以下有益效果： 0022 (1)本发明提供了一种新的凤凰单丛茶树内生拮抗菌-芽孢杆菌(Bacillussp.) 说明书 3/9 页 5 CN。

20、 105969682 A 5 ZF04GDMCCNo： 60014。 0023 (2)本发明提供的芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014可高效抑制梨 果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌， 菌丝 生长抑制率分别为77.55、 83.30、 74.52、 75.19和31.60， 经测定， ZF04对梨果黑 斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌有很强的抑制效果； 作为 植物病原菌的生物防治材料， 无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂， 该菌都具有很好 的应用前景。 附图说明 0024 图1所示。

21、为芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014的菌落形态和个体形 态图。 0025 图2所示为芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014琼脂糖凝胶电泳图。 0026 图3所示为芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014系统发育树状图。 0027 图4所示为芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014对大肠杆菌的抑制效果 图。 0028 图5所示为芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014对植物致病菌的抑菌 效果图， 图中： D为梨果黑斑病菌， E为核桃叶枯病菌。

22、， G为红枣黑斑病菌， X为瓜果腐霉， Y为立 枯丝核菌。 具体实施方式 0029 下面， 举实施例说明本发明， 但是， 本发明并不限于下述的实施例。 本发明中选用 的所有原辅材料， 以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的， 本发明中涉及到的 都为重量百分比， 除非特别指出除外。 0030 牛肉膏蛋白胨液体培养基： 由溶剂和溶质组成， 溶质为牛肉膏、 蛋白胨、 氯化钠， 溶 剂为蒸馏水； 加入牛肉膏5g、 蛋白胨10g、 氯化钠5g、 蒸馏水1000mL， 在pH7.0-7.2， 在温度 121的条件下灭菌15min。 0031 营养琼脂培养基： 由溶剂和溶质组成， 溶质为牛肉膏、 蛋白胨。

23、、 氯化钠、 琼脂， 溶剂 为蒸馏水； 加入蛋白胨10g、 牛肉膏3g、 氯化钠5g、 琼脂15g、 蒸馏水1000mL， 121条件下灭菌 15min。 0032 水琼脂培养基： 加入琼脂25g、 蒸馏水1000mL， 121条件下灭菌15min； 0033 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)： 由溶剂和溶质组成， 溶质为马铃薯浸出粉、 葡萄 糖、 琼脂， 溶剂为蒸馏水； 加入马铃薯浸出粉6g、 葡萄糖20g、 琼脂12g、 蒸馏水1000mL， 121 条件下灭菌15min。 0034 采用主要设备仪器： LD2X-30KA型立式电热压力蒸汽灭菌锅、 DHP-9162型电热恒温 培养箱武汉诺。

24、贝思机械制造有限公司； TGRADIENT型PCR仪、 PowerPac型电泳仪、 Fluorchem Xplor型荧光-可见光凝胶成像分析系统北京弘图科技有限公司。 0035 采用的试验指示细菌： A大肠杆菌(Escherichiacoli)、 B枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 C金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、 P白色念珠球菌(Monilia albican)属于常见的对照菌。 说明书 4/9 页 6 CN 105969682 A 6 0036 采用的D梨果黑斑病菌(Alternariaalternate)、 E核桃叶枯病菌(Walnut 。

25、Blight)、 F梨腐烂病菌(ValsaambiensPers)、 G红枣黑斑病菌(Alternariasp.)、 H茄腐镰 刀病菌(Fusariumsolani)、 X瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、 Y立枯丝核菌 (Rhizoctoniasolani)为常见的植物病原菌， 本领域普通技术人员可以通过病害作物梨、 核桃、 红枣、 棉花、 茄科植物中分离； 细菌基因组DNA快速提取试剂盒、 引物27F、 引物1492R、 2 TapPCRMastermix， 生物生工(上海)有限责任公司。 0037 本发明中选用的所有原辅材料， 以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选。

26、用 的， 本发明中涉及到的都为重量百分比， 除非特别指出除外。 0038 实施例一： 芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014的分离、 筛选及鉴定 0039 1、 菌种的分离和筛选 0040 本发明所使用的芽孢杆菌(Bacillussp.)由韩山师范学院从广东省潮州饶平县 浮滨镇中凤凰单丛茶树根中取样， 根样本采用凤凰单丛茶树根， 采集于广东省潮州饶平县 浮滨镇， 树龄15、 25和50年， 种植海拔高度750m， 茶树品种为凤凰单丛茶水仙， 有机种植。 经 过采用组织块培养法分离出根中内生细菌， 以不同的培养温度、 pH值、 培养基为富集条件， 经过优化筛选出一。

27、批生长良好的细菌菌株， 从中优选出一株编号为ZF04的菌株。 0041 分离步骤： 0042 (1)分离培养基采用： 牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏5g、 蛋白胨10g、 氯化钠 5g、 蒸馏水1000mL， pH7.0-7.2)， 营养琼脂培养基为蛋白胨10g、 牛肉膏3g、 氯化钠5g、 琼脂 15g、 蒸馏水1000mL。 0043 表面消毒： 先将根剪成约5cm长， 用75乙醇浸泡根4min， 无菌水冲洗7次， 用3.0 的双氧水浸泡3min， 再用无菌水冲洗10次。 0044 (2)分离纯化： 0045 根中内生细菌的分离： 采用组织块培养法， 将上述步骤表面消毒后的凤凰单丛茶 树根。

28、剪成0.50.5cm的组织块， 每三个组织块为一组置于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基 中， 37下培养20h， 取80 L涂布于营养琼脂平板， 37培养18h。 待长出细菌菌落后， 挑取形 状、 大小、 颜色等不同的菌落分别划线涂布于营养琼脂平板， 37培养18h反复在营养琼脂 平板上划线分离纯化， 直至得到单个纯菌落。 0046 2、 菌株的培养条件 0047 (1)编号为ZF04的菌株的生长培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基， 牛肉膏5g、 蛋白胨 10g、 氯化钠5g、 蒸馏水1000mL， pH7.0-7.2， 经37、 20h培养。 0048 (2)编号为ZF04的菌株在37-45条件下均。

29、能生长， 最适生长温度为37， 培养 时间为20h。 0049 (3)编号为ZF04的菌株的生长pH为7.0-7.2。 0050 上述采用菌株编号为ZF04的细菌菌株， 该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约 微生物国际保藏单位： 广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。 地址： 广州市先烈中路100号大 院59号楼5楼， 广东省微生物研究所， 邮编： 510075。 保藏日期为2016年3月10日， 菌种保藏编 号为GDMCCNo： 60014。 该菌株最适生长条件为： 温度37， 培养基采用牛肉膏蛋白胨液体培 养基(牛肉膏5g、 蛋白胨10g、 氯化钠5g、 蒸馏水1000mL， pH7.0。

30、-7.2)、 营养琼脂培养基(蛋白 胨10g、 牛肉膏3g、 氯化钠5g、 琼脂15g、 蒸馏水1000mL)。 经20h培养后， 在营养琼脂培养基上 说明书 5/9 页 7 CN 105969682 A 7 菌落为白色， 干燥， 不透明， 中间褶皱凸起， 周边放射状。 将菌种ZF04通过镜检观察， 该菌株 属革兰氏染色阳性， 在显微镜下个体形态为短杆状， 单个或成链状排列， 产芽孢。 芽孢杆菌 (Bacillussp.)ZF04菌落和个体形态参见附图1。 0051 本发明采用的菌株ZF04可在常见的牛肉膏蛋白胨固体培养基或液体培养基中进 行增殖培养。 利用常规固体斜面培养、 低温保藏的方法，。

31、 每次传代可保藏3个月以上； 以干燥 冷冻法制做的长期保藏菌种， 可保藏1年以上； 或是以甘油管进行长期保藏。 0052 3、 菌株ZF04的生理生化鉴定 0053 生理生化特征： 该菌株ZF04在牛肉膏蛋白胨液体培养基、 营养琼脂培养基上生长 良好， 经试验， 选择V-P试验、 吲哚试验、 甲基红试验、 接触酶试验、 4生长试验、 酪氨酸水解 试验、 淀粉水解试验、 明胶液化试验、 硝酸盐还原试验、 10NaCl生长试验、 柠檬酸盐利用试 验、 糖类产酸试验对拮抗细菌进行鉴定， 结果表明菌株ZF04可以利用葡萄糖、 柠檬酸盐、 淀 粉、 明胶， 耐受10NaCl， 菌株ZF04生理生化特性见。

32、表1。 0054 表1： 菌株ZF04的生理生化特性 0055 0056 通过上述对于菌种芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014的菌体形态、 培养特征观察及生理生化指标测定， 即通过菌体形态观察、 菌株培养特征观察、 生长温度测 定、 耐性试验等试验， 参照 伯杰氏细菌鉴定手册 第八版及 常见细菌鉴定手册 的方法进 行， 编号为ZF04的菌种尽管与常见的芽孢杆菌相比， 具有共性的一些属性， 但是与常见的芽 孢杆菌菌种存在明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性， 表明ZF04菌株是一种典型 的新菌种， 从菌种分类角度将菌种编号为ZF04的菌株综合鉴定为芽孢杆菌(。

33、Bacillus sp.)。 0057 实施例二： 芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014分子水平鉴定 0058 利用细菌DNA基因组快速提取试剂盒提取目标菌系DNA。 0059 引物选用细菌通用引物， 细菌16SrDNA通用引物序列： 0060 27F： 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 说明书 6/9 页 8 CN 105969682 A 8 0061 1492R： 5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 0062 本申请所用引物27F、 引物1492R、 2TapPCRMastermix均购自生物生工(上海)有 限责任公司。 0。

34、063 提取基因组DNA采用的20 LPCR扩增体系： 引物27F和引物1492R各1.0 L、 2 TapPCRMastermix7.0 L、 内生细菌的DNA混合液1.0 L、 双蒸水10.0 L。 0064 PCR扩增程序： 94预变性5min、 94变性30s、 55退火30s、 72延伸40s， 从变性 到延伸30个循环， 72延伸7min， 保温4min。 PCR产物经1.8琼脂糖电泳， EB染色后由荧光- 可见光凝胶成像分析系统检测。 0065 以提取的ZF04总DNA为模板， 利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增， 将扩增产 物回收并进行测序， 测得的序列是具有序列表的。

35、核苷酸序列。 菌种ZF04的16SrDNA扩增产物 的琼脂凝胶电泳约在1500bp处出现荧光条带， 参见附图2。 0066 经测定， 芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014的16SrDNA基因片段为 1492bp， 序列提交GenBank数据库， 具体序列参见附后的SEQUENCELISTING。 0067 将测序得到的16SrDNA序列输入NCBI， 与NCBI数据库中已知序列进行比对， 采用 MEGA5.0软件、 ClustalW程序进行多重比对， 然后以各菌株在NCBI上查询的相近各个种的 16SrDNA序列， 采用Neighbour-joining方法构。

36、建系统发育树， 并进行bootstrap分析， 重复 次数为1000次， 参见附图3。 ZF04菌株16SrDNA序列与NCBI数据库BacilluscereusATCC 14579(NR_074540.1)同源相似性为94， 与该属其他标准菌株序列比对同源性分别为94 (BacillusthuringiensisIAM12077(NR_043403.1)、 94(Bacilluspseudomycoides NBRC101232(NR_113991.1)、 94(BacillustoyonensisBCT-7112(NR_121761.1)及 94(Bacillusweihenstephan。

37、ensisDSM11821(NR_024697.1)。 初步断定为该属潜在新 种。 结合ZF04的形态结构特征及生理生化特性， 经序列比对表明， 初步鉴定为芽孢杆菌 (Bacillussp.)。 0068 实施例三： 芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014的生长因子 0069 表3： 温度、 pH、 NaCl对菌株ZF04生长的影响 0070 温度()41015202530374045 生长情况-+ pH456789 生长情况-+- NaCl浓度567891015 生长情况+- 0071 按照如上方式将芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 。

38、60014进行培养， 菌种 的培养条件为： 培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基和营养琼脂培养基， 培养条件： pH7.0， 温 度37条件下培养20h。 0072 由表3得出， 菌株ZF04最适合生长因子通过以上结果得出将芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZF04GDMCCNo： 60014的最佳培养温度为37， 最适生长pH为7.0， 耐受10NaCl。 0073 实施例四： 芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014对试验指示细菌的抑 菌作用 说明书 7/9 页 9 CN 105969682 A 9 0074 采用双层平板法测定芽孢杆菌(Bacillussp.)Z。

39、F04对以下试验指示细菌的抑制 作用： A大肠杆菌(Escherichiacoli)、 B枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、 C金黄色葡萄 球菌(Staphylococcusaureus)、 P白色念珠球菌(Moniliaalbican)： 0075 (1)菌株的活化： 分别挑取一环保存于营养琼脂平板上的试验指示细菌和ZF04， 分 别划线于营养琼脂平板上， 37下培养20h。 0076 (2)挑取ZF04纯菌落三环接种于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 37、 150r/min 培养72h， 将培养后的菌液经5000r/min离心10min， 取上清液， 经0.22 m滤膜。

40、过滤， 去除菌 体， 制成ZF04无菌发酵滤液。 0077 (3)灭菌后的水琼脂15mL倒在直径为9cm的培养皿内， 待其凝固， 将灭菌的100mL营 养琼脂培养基冷却到50左右， 加入1.25mL含有1104-1105cfu/mL试验指示细菌的菌 液， 摇均， 取5mL加到水琼脂平板上； 凝固后用打孔器(外径8mm)打孔， 孔中加入ZF04菌株无 菌发酵滤液240 L， 同时在孔中加入240 L无菌水作对照， 在4冰箱放置2h使无菌发酵滤液 扩散， 37培养18h， 测量抑菌圈直径。 0078 由测定结果可知， 参见附图4， ZF04菌株对大肠杆菌有抑菌作用， 其抑菌圈直径为 14.36mm。

41、； 对枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌和白色念珠球菌没有抑菌作用。 0079 实施例五： 芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCCNo： 60014对植物病原菌的抑菌 作用 0080 采用对峙培养法测定芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04对以下植物病原菌的抑制作 用， D梨果黑斑病菌(Alternariaalternate)、 E核桃叶枯病菌(WalnutBlight)、 F梨腐烂病 菌(ValsaambiensPers)、 G红枣黑斑病菌(Alternariasp.)、 H茄腐镰刀病菌(Fusarium solani)、 X瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum。

42、)、 Y立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)： 0081 (1)菌株的活化： 挑取一环保存于营养琼脂平板上的ZF04划线于营养琼脂平板上， 37下培养20h， 挑取一环植物病原菌划线于PDA培养基上， 28下培养5d。 0082 (2)挑取步骤(1)中得到的ZF04纯菌落三环接种于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基 中， 37、 150r/min培养72h， 将培养后的菌液经5000r/min离心10min， 取上清液， 经0.22 m 滤膜过滤， 去除菌体， 制成ZF04无菌发酵滤液。 0083 (3)将内生细菌ZF04无菌发酵滤液200 L涂布于PDA平板上， 对照为涂布200 L。

43、无菌 水， 取直径为11cm的植物病原菌菌块放于PDA平板正中央， 28培养5d， 测量菌落直径， 计 算菌丝生长抑制率。 0084 菌丝生长抑制率的计算公式如下： 0085 0086 式中， B为对照植物病原菌菌落生长直径(mm)； T为涂内生细菌发酵滤液后植物病 原菌菌落生长直径(mm)。 0087 由测定结果可知， 参见附图5， ZF04菌株对梨果黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑 病菌和立枯丝核菌有较好的抑菌作用， 菌丝生长抑制率分别为77.55、 83.30、 74.52 和75.19， ZF04对瓜果腐霉菌丝生长抑制率为31.60， 经测定， ZF04对梨果黑斑病菌、 核 桃叶枯。

44、病菌、 红枣黑斑病菌和立枯丝核菌均有很强的抑制效果。 0088 通过上述系列实施例， 根据由韩山师范学院从广东省潮州饶平县浮滨镇中凤凰单 说明书 8/9 页 10 CN 105969682 A 10 丛茶树根中取样， 样品为茶树的根， 采集于广东省潮州饶平县浮滨镇， 树龄15、 25和50年， 种 植海拔高度750m， 茶树品种为凤凰单丛茶水仙， 有机种植， 经过采用组织块培养法分离出根 中内生细菌， 以不同的培养温度、 pH值、 培养基为富集条件， 筛选出一批生长良好的细菌菌 株， 从中优选出一株编号为ZF04的菌株。 根据以上形态特征， 参照 伯杰氏细菌鉴定手册 第 八版及 常见细菌鉴定手。

45、册 对菌株进行分类鉴定， 并结合分子生物学测序， 初步鉴定该菌 株为芽孢杆菌(Bacillussp.)。 分子测序结果表明， 芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04GDMCC No： 60014的16SrDNA基因序列为1492bp， 与NCBI数据库BacilluscereusATCC14579(NR_ 074540.1)同源性最高， 最高相似性为94， 但本发明提供的芽孢杆菌(Bacillussp.)ZF04 GDMCCNo： 60014与常见的细菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性， 依据 菌种生理生化特性分析， 分子水平分析及系统分类学的综合鉴定， 编号为ZF04的菌种。

46、在生 理生化特性和分子水平方面与常见的芽孢杆菌具有明显的差异， 是一种典型的新菌种， 有 别于常见的芽孢杆菌(Bacillus)， 与常见的细菌菌种相比， 其对盐的耐受能力更强， 对梨果 黑斑病菌、 核桃叶枯病菌、 红枣黑斑病菌、 立枯丝核菌和瓜果腐霉菌有较好的抑制作用， 但 是依据菌种生理生化特性分析， 分子水平分析及系统分类学的综合鉴定， 编号为ZF04的菌 种为芽孢杆菌(Bacillussp.)。 0089 上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 而并非对实施方式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化 或变动。 这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。 而由此所延伸出的显而易见的变化 或变动仍处于本发明的保护范围之中。 说明书 9/9 页 11 CN 105969682 A 11 0001 序列表 1/2 页 12 CN 105969682 A 12 0002 序列表 2/2 页 13 CN 105969682 A 13 图1 图2 说明书附图 1/3 页 14 CN 105969682 A 14 图3 图4 说明书附图 2/3 页 15 CN 105969682 A 15 图5 说明书附图 3/3 页 16 CN 105969682 A 16 。