技术领域
本发明属于氨基酸发酵领域，是中国专利第201310278997.2号和第201310278996.8号的继续申请，具体而言，本发明涉及发酵生产L-色氨酸的工艺及其后续从发酵液中提取的工艺（包括分离提取L-色氨酸的工艺）。
背景技术
L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，以游离态或结合态存在于生物体中。 当前利用微生物直接发酵法生产L-色氨酸以其原料成本低，来源广泛，产品纯度高，反应条件温和等优点逐渐成为L-色氨酸的主要生产方法，和其他生物工程产品一样，色氨酸工业生产也常常会受到生产成本的制约，而在生产成本的构成中，分离提取等下游工程的成本占有相当的比例。因此，研究L-色氨酸的提取方法具有重要的理论意义和实用价值。
通过产L-色氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产L-色氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。当前的文献报道中，通过基因工程改造的注意力主要集中在mtr、aroP、tnaA、trpB、gnd以及traB等基因上（参见中国专利85101270、93117586、96111972、200580043246、200710056966、201010598350等），未见为了L-色氨酸生产而关注tdcD酶及其调控序列。
TdcD酶由tdcD基因编码。在E. coli K12菌株及其衍生菌株（如，W3110菌株）等中，野生型的tdcD基因的核苷酸序列如Genbank登录号AP009048.1中第3263515-3262220位所示，通过Genbank提供的同源性比较工具，也能够找到其他野生型的tdcD基因及其上游调控元件。
本发明人经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现tdcD基因及其上游调控元件的改造能够有助于提高L-色氨酸的产量，并且后续可以采用耦合分离工艺对发酵液中的L-色氨酸进行分离提取，使得收率高，运行维护成本低，减少三废水排。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-色氨酸的方法及分离提取L-色氨酸的方法。
具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产L-色氨酸的方法，其包括：
（1）改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低；和，
（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-色氨酸。
在第二方面，本发明提供了发酵生产L-色氨酸的方法，其包括：
（1）改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失；和，
（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-色氨酸。
在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，采用Biovector公司商品化的pKD46质粒系统来进行改造，将未改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因，改造成能够使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低的新的tdcD基因。因此，在本文文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。
在本文中，术语“下游酶基因”指的是tdcD基因的野生型的调控元件所能调控的编码酶的基因，而且该酶位于该调控元件的下游。所以，该调控原件一般是启动子。优选在本文中，下游酶基因是tdcD基因。
本发明人经过长期研究发现，使得tdcD基因所编码的tdcD酶的表达量消失，或使得tdcD基因所编码的tdcD酶的酶活性消失，在一定培养基下，并不造成细菌本身生长困难，仍旧能够正常生长/繁殖，并发酵。更为令人意想不到的是，tdcD基因座位上的基因彻底消失，将进一步提高L-色氨酸的产量。因此，本发明的“改造”要相对于未改造的细菌，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低，优选使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低50%以上，更优选降低70%以上，如降低80%、90%或95%以上，最加优选降低100%（即，消失），也最优选是改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性消失并且使得tdcD基因座位上的基因被敲除（即，彻底消失）。
改造的方式可以是在tdcD酶活性结构域，如该酶的氨基酸序列的第17-38位、第90-156位、183-205位和330-362位，进行突变，一般都能造成活性下降；也可以是在tdcD基因上引入终止密码子，使得无法表达有活性的tdcD酶；也可以通过同源重组，将tdcD基因替换成其他基因，如抗生素抗性基因，例如抗氯霉素抗性基因；或者完全敲除tdcD基因座位上的基因，使之彻底消失。在本发明的具体实施方式中，优选采用后两者。
另外，本发明人经过长期研究也发现，使得tdcD基因的野生型的调控元件被敲除（替换成其他无关序列），将造成细菌本身生长困难，甚至无法生长/繁殖（而只是使tdcD酶的表达量消失却在一些培养基中能正常生长）。因此，本发明的“改造”要相对于未改造的细菌，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失，优选减弱20%~95%，更优选减弱50%~90%，更加优选减弱70%~85%，如减弱15%、20%、25%或30%。在本文中，该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失可以通过其下游酶基因（如，tdcD基因）所编码的酶的表达量降低但不消失来表征，优选表达量降低20%~95%，更优选降低50%~90%，更加优选降低70%~85%，如降低15%、20%、25%或30%。
在本文中，细菌优选是埃希氏菌属细菌，更优选是大肠杆菌，如大肠杆菌K-12菌株的后续菌株，包括W3110衍生的菌株。由于现有技术几乎没有在l-色氨酸生产/发酵中关注过细菌的tdcD基因，改造的染色体的基因大多集中于mtr、aroP、tnaA、trpB、gnd以及traB等基因位点上，因此现有技术中的细菌（尤其是埃希氏菌属细菌，如大肠杆菌）没有被报道不带有野生型的tdcD基因。在本发明的具体实施方式中，无论高产还是低产L-色氨酸的细菌，只要带有野生型的tdcD基因，通过本发明的方法进行改造，就能使得L-色氨酸的发酵量得到提高。
在第三方面，针对现有发酵法生产L-色氨酸的工业化过程中，提取收率低以及环境污染严重的问题，本发明提供了分离提取L-色氨酸的方法，其包括：
（一）向含有L-色氨酸的发酵液加入明矾和NaHSO3后，搅拌并加热；
（二）纳滤（如用陶瓷纳滤膜纳滤）以分离得到色氨酸微滤液和菌体蛋白（所述菌体蛋白进一步制成高蛋白饲料）；
（三）用闪蒸脱气机对所述色氨酸微滤液脱气；
（四）将脱气的色氨酸微滤液进行色谱分离，得到色氨酸提取液；
（五）将所述色谱提取液蒸发至其色氨酸浓度提高至5%，再通过双效结晶器进行浓缩结晶；
（六）将所述结晶获得的浆料用酸（如，硫酸）调节pH至6.0~7.0，然后进行梯度降温，终点温度控制在18~40℃，再进行离心分离；
（七）对所述离心分离获得的湿晶体闪蒸干燥，获得含水率0.5~1.0%的色氨酸晶体；
（八）对所述离心分离获得的一次母液脱色，脱色液过滤后进入双效结晶器浓缩结晶并再进行离心分离；和，
（九）将所述色谱分离的残液与所述再进行离心分离的二次母液合并制成生物肥料。
优选在本发明第三方面的方法中，所述含有L-色氨酸的发酵液是通过本发明第一或第二方面的方法制备的。
在本文中，如无相反的指示（如下述占体积的百分比浓度，显然是重量体积百分比浓度（g/mL）），百分比浓度均为质量（重量）百分比浓度。
优选在本发明第三方面的方法中，所述明矾为所述发酵液体积的0.1％~1.0％。
优选在本发明第三方面的方法中，所述NaHSO3为所述发酵液体积的0.1％~1.0％。
优选在本发明第三方面的方法中，所述加热是加热到40~80℃。
优选在本发明第三方面的方法中，所述色谱分离是用SSMB色谱系统进行的。
优选在本发明第三方面的方法中，在所述色谱分离中，以0.05-0.8%氨水将色氨酸进行解脱。
优选在本发明第三方面的方法中，所述色谱分离包括：
（1）首尾循环连接色谱系统的1区、2区、3区和4区的各层析柱，使得脱气的色氨酸微滤液在各层析柱内置换循环，不排出；
（2）切断各层析柱间连接，对3区的层析柱出料；
（3）向1区的层析柱加入0.05-0.8%氨水，并收集1区的层析柱的洗脱液；和，
（4）依次连接色谱系统的1区、2区和3区，并收集3区的层析柱的洗脱液。
优选在本发明第三方面的方法中，所述一次母液经过10%的粉状活性炭脱色，脱色温度65-70℃，脱色时间60min。
本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-色氨酸的发酵量的方式，对于高产和低产L-色氨酸的细菌都适用，而且与现有改造的大量高产L-色氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突；本发明采用陶瓷纳滤膜分离系统过滤发酵液，与普通陶瓷微滤膜相比除菌除杂更彻底，滤液质量更好，为后续操作减轻了除杂压力；与有机材质的超滤纳滤膜相比，耐酸碱耐高温，使用寿命长，运行维护费用低；采用顺序式模拟移动床色谱精制工艺与传统离子交换和活性炭脱色工艺相比，树脂用量减少了70%，树脂无需酸碱再生，用纯水解析避免了氨水的使用，杜绝了高氨氮废水排放；而且脱盐脱色一步耦合完成，大大提高了操作效率，杜绝了使用活性炭脱色造成的固体废碳的排放；L-色氨酸提取收率从原来75%提升到 90%以上，色氨酸得到高效分离回收，能够提高产品纯度和等级，实现了清洁连续在线生产。色谱残夜与菌体蛋白综合利用制造生物菌肥，实现了产品利润的最大化。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1为L-色氨酸分离提取工艺示意图。
图2为L-色氨酸色谱分离流程示意图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1 使tdcD基因表达失活及彻底敲除
将不再含有tdcD酶的ORF的1100 bp的DNA片段分别随pKD46质粒分别转化入几乎不产L-色氨酸的E. coli K12 W3110菌株（可购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITEBiological Resource Center,NBRC)）和高产L-色氨酸的E. coli 1-1703菌株（可购自中科院微生物研究所，其为经E. coli K12 W3110诱变突变得到的L-色氨酸生产工程菌，经测序保留了野生型的tdcD基因）中，得到两种具有氯霉素抗性的阳性菌株，分别记为YPT-W-001（来自E. coli K12 W3110菌株）和YPT-W-011（来自E. coli 1-1703）。
再将pCP20质粒（可购自Biovector，Inc）电转化入YPT-W-001和YPT-W-011，筛选以将引入的氯霉素抗性基因也敲除（使得tdcD基因座位上的基因被彻底敲除），得到不具有氨苄青霉素和氯霉素抗性的菌株，分别记为YPT-W-002（来自YPT-W-001）和YPT-W-012（来自YPT-W-011）。
实施例2 用转录活性较弱的启动子替换tdcD的上游调控序列
将弱转录启动子并委托中科院微生物所合成并构建入pKOV-Up-P-Down质粒中，来替换菌株tdcD基因ORF上游337bp的野生型的启动子区域，以减弱野生型tdcD基因的表达强度。
将构建好的pKOV-Up-P-Down质粒分别电转化入几乎不产L-色氨酸的E. coli K12W3110菌株（可购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITE Biological ResourceCenter,NBRC)）和高产L-色氨酸的E. coli 1-1703菌株（可购自中科院微生物研究所，其为经E. coli K12 W3110诱变突变得到的L-色氨酸生产工程菌，经测序保留了野生型的tdcD的上游序列）中，分别得到tdcD启动子突变的（低/高产L-色氨酸）大肠杆菌，分别记为YPT-W-101（来自E. coli K12 W3110菌株）和YPT-W-111（来自E. coli 1-1703）。
实施例3 色氨酸发酵实验
将E. coli K12 W3110菌株和E. coli 1-1703以及实施例1、2制备的菌株分别接种在25mL表1所述的种子培养基中，于37℃、220rpm培养8 h。然后取1 mL种子培养基的培养物接种在25 mL表1所述的发酵培养基中，于37℃、220rpm培养培养36 h。当培养完成时，通过HPLC测定l-色氨酸的产生。
表1 培养基配方
成分 种子培养基配方（g/L） 发酵培养基配方（g/L） 葡萄糖 20 7.5 磷酸氢二钾 5.6 7.5 七水硫酸镁 1.6 2 柠檬酸钠 1.6 柠檬酸 2 酵母提取物 1.1 1 硫酸铵 1.2 1.6 维生素B1 0.0013 0.0013 生物素 0.003 0.0003 硫酸亚铁 0.028 0.075 硫酸锰 0.012 0.0016 硫酸钠 0.05 硫酸锌 0.003 氯化钴 0.0004 硫酸铜 0.002
结果如表2所示，通过本发明的构建，色氨酸发酵量得到了提高，尤其是几乎不产色氨酸的菌株，提高L-色氨酸的产量的提高非常可观，尽管绝对提高量比不过高产菌株，但是相对提高量却远远高于高产菌株。
表2 色氨酸发酵量
菌株 发酵量（g/L） 提高倍数 菌株 发酵量（g/L） 提高比例（%） E. coli K12 W3110 0.4 - E. coli 1-1703 11.3 - YPT-W-001 0.8 1 12.6 11.5 YPT-W-002 1.1 1.75 13.3 17.7 YPT-W-101 0.7 0.75 YPT-W-111 13.0 15.0
实施例4 色氨酸提取实验
本发明的色氨酸分离提取工艺采用耦合分离工艺，其工艺流程如图1所示，具体而言，该工艺包括以下步骤：
第一步、对直接发酵法产生的含有L-色氨酸发酵液进行预处理：处理方式为分别加入发酵液体积0.1％~1.0％的明矾和发酵液体积0.1％~1.0％的NaHSO3后，搅拌并加热到40~80℃，制为处理液；
第二步、将处理液泵入陶瓷纳滤膜过滤器，得到除去菌体的色氨酸微滤液以及菌体蛋白；
第三步、将色氨酸微滤液泵入闪蒸脱气机进行脱气处理，得到进色谱前的预处理液；
第四步、将色谱预处理液泵入SSMB色谱系统，使料液中的色氨酸和其他杂质在色谱体系下进行有效分离，同时在0.05-0.8%氨水的作用下，将色氨酸进行解脱，得到纯度更高的色氨酸提取液；具体色谱分离流程如下：
如图2所示，L-色氨酸色谱分离流程分为以下几个步骤：
第1步 物料循环 无进无出：间隙体积的移动，同体积的物料在各柱内置换；
第2步 进料/吸附 物料由3区进入柱内，残液由3区出料；
第3步 提取液收集/解吸 洗提液由1区进入，提取液由1区收集；其中，第2步和第3步同时进行以提高产能。程序中会使 2，3 这两步的生产时间相同。该步骤进行时，2区和4区无任何操作；
第4步 残液收集 洗提液由1区进入，残液由3区排出并收集。该步骤下，4 区无任何操作；不同的区带中色谱柱通过进料口和出料口自动阀切换；
第五步、将色谱提取液通过预热器换热后泵入二效降膜式蒸发器，使料液浓度由1.5%提高至5%，再经过双效结晶器进行浓缩结晶，结晶出料温度控制65℃左右；
第六步、将结晶浆料泵入拉冷罐进行梯度降温，终点温度控制在18-20℃，降温前用硫酸调pH至6.0-7.0，温度降到后使用平板刮刀离心机进行离心分离，晶体水分控制在10-30%；
第七步、将离心机分离得到的湿晶体用螺旋输送器输送到闪蒸干燥系统，在气流作用下，中细颗粒直接进入上部气流干燥机烘干；大块料向下落入搅拌器内，在搅拌器作用下，大块料被打碎，小颗粒料顺着气流干燥管烘干，进入旋风分离器、空心浆叶冷却机冷却；经冷却后再经过振动筛的筛分进入料仓进行包装，烘干成品水分控制在≤0.5%。
第八步、离心分离得到的一次母液经过10%的粉状活性炭脱色，脱色温度65-70℃，脱色时间60min，脱色液经压滤机过滤后进入母液结晶系统。
第九步、SSMB色谱分离的残液与离心分离的二次母液一起经过浓缩，喷浆造粒工艺制成生物肥料，减少三废的排放。