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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610362607.3 (22)申请日 2016.05.26 (71)申请人 中国农业科学院作物科学研究所 地址 100081 北京市海淀区学院南路80号, 资源北楼402 (72)发明人 陈红霖程须珍王丽侠王素华 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标 记及其应用 (5。
2、7)摘要 本发明提供与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分 离的分子标记， 所述绿豆抗豆象基因VrPGIP位于 绿豆第5号染色体第5.558Mb和5.625Mb区域内， 与基因VrPGIP共分离的分子标记包括SSR标记 Vr05-5590和Vr05-5597， 它们与绿豆抗豆象基因 VrPGIP的物理距离分别为1.5kb和850bp。 本发明 还提供所述分子标记在绿豆抗豆象基因定位或 绿豆遗传育种中的应用。 本发明通过精细定位绿 豆抗豆象基因VrPGIP， 发现了两个与绿豆抗豆象 基因共分离的SSR标记， 该分子标记的开发为绿 豆抗豆象分子辅助育种提供了一条可行途径。 权利要求书2页 说明书5页 序。
3、列表2页 附图2页 CN 105950736 A 2016.09.21 CN 105950736 A 1.与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标记， 其特征在于， 所述绿豆抗豆象基因 VrPGIP位于绿豆第5号染色体5.558Mb和5.625Mb区域内， 与基因VrPGIP共分离的分子标记 包括SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597， 它们与绿豆抗豆象基因VrPGIP的物理距离分别为 1.5kb和850bp； 上述物理位置参考已测序绿豆种VC1973A； 用于PCR扩增标记Vr05-5590的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO:1和2； 用于PCR扩增标记Vr05-559。
4、7的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO:3和4； 其中， 绿豆抗豆象基因VrPGIP为： i)SEQIDNO:9所示的核苷酸序列； 或 ii)SEQIDNO:9所示的核苷酸序列经取代、 缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核苷酸序列； 或 iii)在严格条件下与SEQIDNO:9所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列， 所述严格条件为在含0.1SDS的0.1SSPE或含0.1SDS的0.1SSC溶液中， 在65下 杂交， 并用该溶液洗膜； 或 iv)与i)、 ii)或iii)的核苷酸序列具有90以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。 2.根据权利要求1。
5、所述的分子标记， 其特征在于， 利用SEQIDNO:1和2在抗豆象绿豆品 种TC1966、 VC6089A、 中绿3号、 中绿6号、 中绿7号和苏绿2号中可扩增出大小为145bp的特征 条带， 在绿豆感豆象品种中绿1号、 中绿5号和中绿10号中可扩增出大小为108bp的特征条 带； 利用SEQIDNO:3和4在抗豆象绿豆品种TC1966、 VC6089A、 中绿3号、 中绿6号、 中绿7号和 苏绿2号中可扩增出大小为241bp的特征条带， 在绿豆感豆象品种中绿1号、 中绿5号和中绿 10号中可扩增出大小为246bp的特征条带。 3.权利要求1或2所述分子标记在鉴定绿豆抗豆象基因VrPGIP中的。
6、应用； 其中， 绿豆抗 豆象基因VrPGIP的定义同权利要求1所述。 4.权利要求1或2所述分子标记在筛选或鉴定绿豆抗豆象资源中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 包括如下步骤： 1)提取待测植株的基因组DNA； 2)以待测植株的基因组DNA为模板， 利用扩增权利要求1或2所述分子标记的引物， 进行 PCR扩增反应； 3)检测PCR扩增产物； 其中， SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597的正向引物和反向引物序列同权利要求1所述。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 步骤3)中采用8非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离扩增产物， 银染法染色。 7.权利要求1或。
7、2所述分子标记在绿豆分子标记辅助育种中的应用。 8.用于筛选或鉴定绿豆抗豆象资源的特异性PCR引物， 其特征在于， 包括扩增权利要求 1或2所述分子标记的引物； 其中， SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597的正向引物和反向引物序 列同权利要求1所述。 9.用于筛选或鉴定绿豆抗豆象资源的PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含权 利要求8所述引物。 10.根据权利要求1或2所述分子标记开发的与绿豆抗豆象基因共分离的分子标记； 其 权利要求书 1/2 页 2 CN 105950736 A 2 中， 绿豆抗豆象基因VrPGIP的定义同权利要求1所述。 权利要求书 2/2 页 3 。
8、CN 105950736 A 3 与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标记及其应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程、 分子生物学及遗传育种技术领域， 具体地说， 涉及与绿豆抗 豆象基因VrPGIP共分离的分子标记及其应用。 背景技术 0002 绿豆(Vignaradiata)是一种豆科、 蝶形花亚科豇豆属植物， 中国是绿豆的发源地 之一， 拥有类型繁多的绿豆品种资源。 中国、 缅甸等国是主要的绿豆出口国。 由于其生育期 短、 适应性广， 且具有较好的固氮能力， 因此是种植业资源合理配置、 倒茬轮作、 间作套种、 减灾救灾不可缺少的粮食作物及重要的经济作物； 同时绿豆富含蛋白质、 维。
9、生素、 多种矿物 质及人体必需的氨基酸， 还具有清热解毒、 降血压和胆固醇、 防止动脉粥样硬化等功效， 具 有较高的营养保健和经济价值， 在国际市场上备受青睐。 近年来， 国际市场对绿豆的需求量 和全世界绿豆的生产量均有所增加， 目前中国的绿豆年出口量在20-30万吨， 出口价格一般 400-500美元。 绿豆的社会经济价值不容忽视。 然而， 豆象是危害绿豆最严重的仓储害虫， 豆 象分布范围广， 在任何种植和储藏食用豆的地方都可发生绿豆象危害。 在一个生活周期内， 因绿豆象危害一般损失产量30-56， 可导致整仓绿豆被破坏。 在我国， 绿豆象每年可繁 殖4-11代， 除危害绿豆外， 还可危害小。
10、豆、 豇豆、 豌豆、 蚕豆、 菜豆、 扁豆等。 国内外对绿豆豆 象的研究还相当滞后， 分子水平的研究更显薄弱。 0003 从20世纪80年代开始， 日本、 泰国、 澳大利亚等国家的食用豆类遗传育种学家致力 于抗豆象的研究。 目前为止， 报道的高抗豆象绿豆资源主要有马达加斯加野生种TC1966和 澳大利亚野生种ACC41， 经验证TC1966和ACC41抗豆象表型均为Br1基因控制。 Kaga等(1998) 用RFLP标记Bng143和Bng110将Br1基因定位于第9连锁群。 程须珍等(2005)筛选出一个与 Br1基因紧密连锁的RAPD标记。 梅丽等(2007)将Br1基因定位于RFLP标记。
11、mgM213VrCS161 之间， 还发现Br1基因与一个控制种子重量的QTL。 Chen等(2013)证明Br1基因与控制绿豆黄 花叶印度病毒(MYMIV)的主效QTL连锁。 孙蕾等(2008)利用抗豆象栽培绿豆V2709与感豆象 推广品种中绿1号(VC1973A)配制F2杂交组合， 利用抗、 感亲本和抗、 感池筛选63个RAPD引物 和113对SSR/STS引物。 将该抗豆象基因初步定位在一个RAPD标记和一个STS标记之间， 遗传 距离分别为11.0cM和5.8cM。 发明内容 0004 本发明的目的是提供与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标记。 0005 本发明的另一目的是提供所。
12、述分子标记在绿豆抗豆象基因定位或绿豆遗传育种 中的应用。 0006 为了实现本发明目的， 本发明提供的与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标 记， 所述绿豆抗豆象基因VrPGIP位于绿豆第5号染色体5.558Mb和5.625Mb区域内， 与基因 VrPGIP共分离的分子标记包括SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597， 它们与绿豆抗豆象基因 VrPGIP的物理距离分别为1.5kb和850bp； 上述物理位置参考已测序绿豆种VC1973A。 说明书 1/5 页 4 CN 105950736 A 4 0007 用于PCR扩增标记Vr05-5590的正向引物和反向引物序列分别为SEQID。
13、NO:1和2。 0008 用于PCR扩增标记Vr05-5597的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO:3和4。 0009 绿豆抗豆象基因VrPGIP为： 0010 i)SEQIDNO:9所示的核苷酸序列； 或 0011 ii)SEQIDNO:9所示的核苷酸序列经取代、 缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核苷酸序列； 或 0012 iii)在严格条件下与SEQIDNO:9所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列， 所述严格条件为在含0.1SDS的0.1SSPE或含0.1SDS的0.1SSC溶液中， 在65 下杂交， 并用该溶液洗膜； 或 0013 iv)与i)、 。
14、ii)或iii)的核苷酸序列具有90以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。 0014 利用SEQIDNO:1和2在抗豆象绿豆品种TC1966、 VC6089A、 中绿3号、 中绿6号、 中绿 7号和苏绿2号中可扩增出大小为145bp的特征条带， 扩增产物的测序结果如SEQIDNO:5所 示， 在绿豆感豆象品种中绿1号、 中绿5号和中绿10号中可扩增出大小为108bp的特征条带， 扩增产物的测序结果如SEQIDNO:6所示； 利用SEQIDNO:3和4在抗豆象绿豆品种TC1966、 VC6089A、 中绿3号、 中绿6号、 中绿7号和苏绿2号中可扩增出大小为241bp的特征条带， 扩增 。
15、产物的测序结果如SEQIDNO:7所示， 在绿豆感豆象品种中绿1号、 中绿5号和中绿10号中可 扩增出大小为246bp的特征条带， 其中， 扩增产物的测序结果如SEQIDNO:8所示。 0015 本发明还提供所述分子标记在鉴定绿豆抗豆象基因VrPGIP中的应用。 0016 本发明还提供所述分子标记在筛选或鉴定绿豆抗豆象资源和品种中的应用。 0017 包括如下步骤： 0018 1)提取待测植株的基因组DNA； 0019 2)以待测植株的基因组DNA为模板， 利用扩增所述分子标记的引物， 进行PCR扩增 反应； 0020 3)检测PCR扩增产物。 如用引物SEQIDNO:1和2能够扩增出145bp。
16、大小的目的片段 (SEQIDNO:5)， 和/或用引物SEQIDNO:3和4能够扩增出241bp大小的目的片段(SEQID NO:7)， 则标志着该绿豆品种抗豆象基因VrPGIP的存在。 0021 优选地， 步骤3)中采用8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物， 银染法EB染 色。 0022 本发明还提供所述分子标记在绿豆分子标记辅助育种中的应用。 0023 本发明还提供用于筛选或鉴定绿豆抗豆象资源的特异性PCR引物， 包括扩增所述 分子标记Vr05-5590的引物(SEQIDNO:1和2)， 和/或扩增分子标记Vr05-5597的引物(SEQ IDNO:3和4)。 0024 本发明还提供用于。
17、筛选或鉴定绿豆抗豆象资源的PCR检测试剂盒， 所述试剂盒包 含上述引物。 0025 本发明还提供所述分子标记在开发与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标记 中的应用。 0026 本发明进一步提供利用所述分子标记开发的与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的 分子标记。 说明书 2/5 页 5 CN 105950736 A 5 0027 本发明通过精细定位绿豆抗豆象基因VrPGIP， 发现了与绿豆抗豆象基因共分离的 SSR分子标记Vr05-5590和Vr05-5597， 所述分子标记的开发为绿豆抗豆象分子辅助育种提 供了一条可行途径。 本发明的分子标记可以简便、 快速、 高通量地应用于绿豆育种实。
18、践和资 源及品种鉴定。 本方法方便、 快捷、 准确且成本低廉， 为绿豆抗豆象分子标记的筛选提供了 新思路。 附图说明 0028 图1为本发明实施例3中利用F2群体定位绿豆抗豆象基因VrPGIP的遗传图谱。 0029 图2为本发明实施例4中与抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标记Vr05-5590在抗豆 象品种中绿3号、 中绿6号、 中绿7号、 V2802、 V2709、 V1128和抗豆象野生种TC1966中的PAGE电 泳检测结果。 0030 图3为本发明实施例4中与抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标记Vr05-5597在抗豆 象品种中绿3号、 中绿6号、 中绿7号、 V2802、 V27。
19、09、 V1128和抗豆象野生种TC1966中的PAGE电 泳检测结果。 具体实施方式 0031 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 均按照常规实验条件， 如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW , Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)， 或按照制造厂商说明书建议的条件。 0032 实施例1TC1966/中绿1号F1和F2群体构建及表型鉴定 0033 以抗豆象绿豆野生资源TC1966为父本， 以感豆象绿豆品种中绿1号为母本， 配制杂 种， 构建了包含150个单株的TC1。
20、966/中绿1号分离群体， 每个F2单株通过自交获得相应的 TC1966/中绿1号F2:3家系， 进行抗虫鉴定。 具体方法如下： 0034 每份材料随机选取30粒健康种子， 包括2份感豆象中绿1号、 抗豆象TC1966对照， 置 于抗豆象鉴定室塑料箱内， 温度保持在25-29之间， 湿度控制在70-80之间。 每个塑 料箱内放入400-500头刚羽化1-3天的绿豆象成虫， 让其随机产卵， 当每粒种子落卵量在5个 以上时， 除去成虫。 40-45天后调查抗虫种子粒数及抗虫率， 参照程须珍等(2001)的方法对 每个单株进行抗性评价。 达到中抗以上材料进行重复鉴定， 设3次重复。 抗豆象鉴定分级标。
21、 准见表1。 0035 表1绿豆抗豆象特性分级标准 0036 0037 抗豆象鉴定结果显示， TC1966、 中绿1号以及TC1966/中绿1号杂交获得的F1种子全 抗， 表明TC1966抗豆象特性由显性基因控制。 150个TC1966/中绿1号F2:3家系对豆象的抗性 级别频率分布呈连续分布， 根据对豆象的抗虫级别将F2:3家系分为抗豆象、 抗感分离和感 说明书 3/5 页 6 CN 105950736 A 6 豆象三种表现型， 而相应的F2单株的基因型则分别为记为RR(纯合抗虫)、 Rr(杂合抗虫)和 rr(纯合感虫)三种。 F2群体对豆象的抗感分离比符合1:2:1的比例， 说明抗豆象基因。
22、由显性 基因VrPGIP控制。 0038 实施例2与绿豆抗豆象基因VrPGIP连锁的SSR分子标记的开发 0039 绿豆抗豆象基因VrPGIP的获得： 利用抗豆象亲本TC1966与感豆象亲本中绿1号杂 交的F2分离群体和抗、 感池筛选出多态性SSR标记。 将该抗豆象基因初步定位于绿豆第5号 染色体上。 根据NCBI已公布的绿豆基因组序列(GenBank登录号： JJMO00000000)， 用软件 Primer3.0进行引物设计， 在绿豆第5号染色体共产生3143对SSR引物。 提取绿豆叶片DNA， 进 行引物成功率检测， 结果表明， 共有1254对SSR引物在100-300bp检测到清晰条带。
23、， 表明引物 设计成功率较高。 0040 实施例3绿豆抗豆象基因VrPGIP的精细定位 0041 用改良CTAB法提取亲本和F2群体各株系的DNA， 经紫外分光光度计测定浓度后稀 释标定到25ng/ L， 置于-20冰箱备用。 0042 参照Chen等(2015)的方法， 以绿豆基因组DNA为模板， 进行PCR反应。 10 lPCR反应 体系包括： 40ngDNA， 1Taq酶缓冲液(10mmolL-1Tris-HCl， pH8.8； 10mmolL-1KCl； 10mmol L-1(NH4)2SO4； 1.5mmolL-1MgCl2； 0.1TritonX-100)， 1mmolL-1dNT。
24、Ps， 上、 下游引物各 0.25 molL-1和1UTaqDNA聚合酶， ddH2O补至10 l。 反应程序： 95预变性5min； 95变性 30s， 55退火45s， 72延伸45s， 3235个循环； 最后72延伸5min。 整个反应在东胜EDC- 810PCR扩增仪上进行。 用8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物， 银染法染色。 扩增 的DNA条带在荧光灯箱内观察， 获取F2群体基因型信息。 根据连锁交换规律， 利用 MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型信息构建绿豆的遗传连锁图谱。 共获 得13个SSR标记， 图谱长度为63cM(图1)。 0043 进一步。
25、通过精细定位， 将抗豆象基因定位于绿豆第5号染色体5.558Mb和5.625Mb 区域内， SSR标记Vr05-5590和Vr05-5597之间， 它们与绿豆抗豆象基因VrPGIP的物理距离分 别为1.5kb和850bp(上述物理位置参考已测序绿豆种VC1973A)， 通过测序发现此区间仅包 括一个基因(基因PGIP)编码多聚半乳糖醛酸酶抑制剂， 基因PGIP的DNA序列如SEQIDNO:9 所示， 在抗、 感虫材料中存在碱基变异， 并引起其编码蛋白的氨基酸序列变化， 从而为绿豆 资源抗豆象的分子育种提供新的基因资源。 0044 扩增各分子标记的引物如下： 用于PCR扩增标记Vr05-5590。
26、的正向引物和反向引物 序列分别为SEQIDNO:1和2； 用于PCR扩增标记Vr05-5597的正向引物和反向引物序列分别 为SEQIDNO:3和4。 0045 实施例4标记Vr05-5590和Vr05-5597在鉴定绿豆抗豆象资源中的应用 0046 用引物SEQIDNO:1和2能够扩增出145bp大小的目的片段(SEQIDNO:5)， 和/或 用引物SEQIDNO:3和4能够扩增出246bp大小的目的片段(SEQIDNO:6)， 则标志着该绿豆 品种抗豆象基因VrPGIP的存在。 其中， PCR反应体系和反应程序同实施例3所述。 采用8非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物， 银染法染色。 。
27、0047 利用上述两个标记Vr05-5590和Vr05-5597对我国主要绿豆推广品种如中绿1号、 中绿3号、 中绿5号、 中绿6号、 中绿7号、 中绿10号， 国外绿豆品种如VC6089A、 V1128、 V2802和 V2709， 国外绿豆野生种TC1966进行抗豆象基因鉴定， 结果表明这2个标记的鉴定效率均达 说明书 4/5 页 7 CN 105950736 A 7 到99.5以上。 0048 通过上述分子标记鉴定绿豆抗豆象基因VrPGIP来预测绿豆植株抗虫性， 可提高我 国绿豆抗豆象品种的育种进程。 0049 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 。
28、本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 0050 参考文献 0051 1.程须珍,王素华,吴绍宇,等.绿豆抗豆象基因PCR标记的构建与应用.中国农业 科学,2005,38(8):1534-1539 0052 2.梅丽,程须珍,王丽侠,等.重组近交系群体定位绿豆抗绿豆象基因.作物学报, 2007, (10):1601-1605 0053 3.MeiL ,ChengXZ,WangSH ,etal .Relationshipbetweenbruchid resistan。
29、ceandseedmassinmungbeanbasedonQTLanalysis.Genome.2009,52(7): 589-596 0054 4.ChenHM,KuHM,SchafleitnerR,etal.Themajorquantitativetrait locusformungbeanyellowmosaicIndianvirusresistanceistightlylinkedin repulsionphasetothemajorbruchidresistancelocusinacrossbetween mungbeanVignaradiata(L.)Wilczekanditsw。
30、ildrelativeVignaradiatassp sublobata.Euphytica,2013,192(2):205-216 0055 5.http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/？ valJJMO01#contigs 0056 6.程须珍,王素华,金达生,杨又迪,吴绍宇,周吉红.绿豆抗豆象遗传的初步研究. 植物遗传资源科学.2001,2(4):12-15 0057 7.ChenHL,WangLX,WangSH,LiuCJ.BlairMW,ChengXZ.Transcriptome sequencingofmungbean(VignaradiataL.)genesandtheidentificationofEST- SSR.PLoSONE.2015,10(4):e0120273 说明书 5/5 页 8 CN 105950736 A 8 0001 序列表 1/2 页 9 CN 105950736 A 9 0002 序列表 2/2 页 10 CN 105950736 A 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 105950736 A 11 图3 说明书附图 2/2 页 12 CN 105950736 A 12 。