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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610400202.4 (22)申请日 2016.06.08 (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区上下店 路15号 (72)发明人 孙威江郭义红陈志丹 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于DNA条形码技术的闽南乌龙茶品种 鉴定方法 (57)摘要 一种基于DNA条形码技术快。
2、速鉴定茶叶品种 的方法， 属于茶叶质量安全领域， 用改良的植物 DNA提取试剂盒提取样品总DNA， 再对特定序列进 行PCR扩增、 纯化、 测序， 建立闽南乌龙茶的基因 库， 将未知品种的闽南乌龙茶的DNA序列与所建 的基因库进行同源性分析， 可快速鉴定待测闽南 乌龙茶品种。 经改良的植物DNA提取试剂盒提取 的茶叶样品DNA浓度高， 电泳条带清晰； 该方法能 快速、 准确地鉴定出闽南乌龙茶产品的品种， 避 免人工感官审评主观意识的影响和传统化学检 测方法的繁杂操作， 结果科学准确。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 105950749 A 2016.09.21 CN 1。
3、05950749 A 1.一种用于鉴定闽南乌龙茶品种方法的引物， 其特征在于： 所述的引物为： 3F： 5 -CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3 ； 1R： 5 -ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3 。 2.一种基于DNA条形码技术的闽南乌龙茶品种鉴定方法， 其特征在于： 所述方法包括以 下步骤： （1） 茶样的准备： 收集不同茶树品种的制成的闽南乌龙茶茶叶样品； （2） 茶叶样品DNA的提取： 试剂盒提取植物DNA的步骤为： 取植物组织在研钵中加入液氮充分研磨成细粉； 研磨前准备一个1.5mL的离心管， 加 入400 l缓冲液AP1和4 lRNas。
4、e室温备用； 转移细粉20-30mg到1.5mL离心管漩涡振荡， 充分混匀帮助裂解； 65水浴10min， 在水浴过程中颠倒离心管2-3次， 混合样品； 加入130 l缓冲液AP2， 充分混匀， 冰上放置5分钟， 14000rpm离心5-10min， 小心吸取 上清液到一个新的1.5mL离心管中； 计算上清量加入1.5倍体积的AP3/E， 立即吹打混匀； 将上一步所得的混合物加入一个吸附柱AC中， 吸附柱放入收集管中13000rmp离心 30-60秒， 倒掉收集管中的废液； 加入600 l漂洗液WB， 12000rmp离心30秒， 弃掉废液； 加入600 l漂洗液WB， 12000rmp离心3。
5、0秒， 弃掉废液； 将吸附柱AC放回空收集管中， 13000rmp离心2分钟， 去除漂洗液； 取出吸附柱AC放入一个干净的离心管中， 在吸附膜的中间部位加100 l洗脱缓冲液 EB， 室温放置3-5min， 12000rmp离心1min， 将得到的溶液重新加入吸附柱中， 室温放置2min， 12000rmp离心1min； 所得的DNA可存放于2-8， 若要长时间保存可放置于-20； （3） 特定基因序列的PCR扩增、 纯化： matK序列扩增选用权利要求1中所述引物3F(5 - CGT-ACA-GTA-CTT-TTG-TGT-TTA-CGA-G-3 )和1R （5 -ACC-CAG-TCC-A。
6、TC-TGG-AAA-TCT-TGG- TTC-3 )， PCR扩增总体积为20 L， 反应体系为PCRmix10 L， 引物各1 L， 茶叶样品总DNA1 L， ddH2O7 L； PCR反应程序为95预变性30s； 5630s， 7230s， 10个循环； 8830s， 56 30s， 7230s， 25个循环； 7210min； 纯化PCR产物后送至铂尚生物公司测序； （4） 序列分析： 序列用HMMer注释法切除5.8和26S端， 保留特定序列的全长； 经BLAST比 对， 进行同源性分析。 3.根据权利要求2所述的一种基于DNA条形码技术的闽南乌龙茶品种鉴定方法， 其特征 在于： 步。
7、骤 （1） 中选取不同品种的闽南乌龙茶产品作为实验对象。 4.根据权利要求2所述的一种基于DNA条形码技术的闽南乌龙茶品种鉴定方法， 其特 征在于： 步骤 （2） 中， 替换为： 取20-30mg的茶叶样品， 用液氮速冻， 在液氮中研磨至粉 末， 加入已加600 LAP1缓冲液和6-8 g蛋白酶K的1.5mL离心管中， 在42恒温水浴锅中水 浴15h。 5.根据权利要求2所述的一种基于DNA条形码技术的闽南乌龙茶品种鉴定方法， 其特征 在于： 步骤 （3） 对所提取样品的DNA进行PCR扩增， 获得高纯度的matK片段。 6.一种如权利要求1所述的引物在鉴定闽南乌龙茶品种中的应用。 权利要求书。
8、 1/1 页 2 CN 105950749 A 2 一种基于DNA条形码技术的闽南乌龙茶品种鉴定方法 技术领域 0001 本发明涉及利用DNA条形码技术快速鉴定闽南乌龙茶品种的方法， 属于茶叶质量 安全领域。 背景技术 0002 乌龙茶是我国的六大茶类之一， 一直以来以独特的滋味和香气受到大众的喜爱， 目前， 市售闽南乌龙茶的所制品种主要有铁观音、 黄旦、 本山、 毛蟹等， 虽然这几个品种都是 国家级的茶树优良品种， 品质优良， 但铁观音品种制成的闽南乌龙茶由于具有独特的 “观音 韵” ， 因而价格较其他品种制成的闽南乌龙茶价格高。 近年来闽南乌龙茶以次充好的现象普 遍， 消费者通常无法辨别，。
9、 因此， 通过技术手段来明确鉴定闽南乌龙茶品种、 建立规范的乌 龙茶产品质量标准逐渐成为茶叶研究的重点和热点。 0003 成品茶是茶叶的实际应用形式， 因此以市售乌龙茶为研究对象， 进行分子鉴定进 而鉴别其品种， 对提高我国成品茶品种鉴定技术具有一定的现实意义。 发明内容 0004 本发明在于提供一种利用DNA条形码技术鉴定闽南乌龙茶品种的方法， 通过该方 法可快速、 准确地鉴定闽南乌龙茶产品的品种， 有利于规范闽南乌龙茶市场。 0005 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 一种用于鉴定闽南乌龙茶品种方法的引物， 所述的引物为： 3F： 5 -CGTACAGTACTTTTGTGTTTA。
10、CGAG-3 ； 1R： 5 -ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3 。 0006 一种利用DNA条形码技术对闽南乌龙茶进行品种鉴定的方法， 包含以下几个步骤： （1） 茶样的准备： 收集不同茶树品种的制成的闽南乌龙茶茶叶样品； （2） 茶叶样品DNA的提取： 试剂盒提取植物DNA的步骤为： 取植物组织在研钵中加入液氮充分研磨成细粉； 研磨前准备一个1.5mL的离心管， 加 入400 l缓冲液AP1和4 lRNase室温备用； 转移细粉20-30mg到1.5mL离心管漩涡振荡， 充分混匀帮助裂解； 65水浴10min， 在水浴过程中颠倒离心管2-3次， 混合样品； 加入1。
11、30 l缓冲液AP2， 充分混匀， 冰上放置5分钟， 14000rpm离心5-10min， 小心吸取 上清液到一个新的1.5mL离心管中； 计算上清量加入1.5倍体积的AP3/E， 立即吹打混匀； 将上一步所得的混合物加入一个吸附柱AC中， 吸附柱放入收集管中13000rmp离心 30-60秒， 倒掉收集管中的废液； 加入600 l漂洗液WB， 12000rmp离心30秒， 弃掉废液； 加入600 l漂洗液WB， 12000rmp离心30秒， 弃掉废液； 将吸附柱AC放回空收集管中， 13000rmp离心2分钟， 去除漂洗液； 说明书 1/4 页 3 CN 105950749 A 3 取出吸附。
12、柱AC放入一个干净的离心管中， 在吸附膜的中间部位加100 l洗脱缓冲液 EB， 室温放置3-5min， 12000rmp离心1min， 将得到的溶液重新加入吸附柱中， 室温放置2min， 12000rmp离心1min； 所得的DNA可存放于2-8， 若要长时间保存可放置于-20； （3） 特定基因序列的PCR扩增、 纯化： matK序列扩增选用所述引物3F(5 -CGT-ACA-GTA- CTT-TTG-TGT-TTA-CGA-G-3 )和1R （5 -ACC-CAG-TCC-ATC-TGG-AAA-TCT-TGG-TTC-3 )， PCR 扩增总体积为20 L， 反应体系为PCRmix10。
13、 L， 引物各1 L， 茶叶样品总DNA1 L， ddH2O7 L； PCR反应程序为95预变性30s； 5630s， 7230s， 10个循环； 8830s， 5630s， 72 30s， 25个循环； 7210min； 纯化PCR产物后送至铂尚生物公司测序； （4） 序列分析： 序列用HMMer注释法切除5.8和26S端， 保留特定序列的全长； 经BLAST比 对， 进行同源性分析。 0007 步骤 （1） 中选取不同品种的闽南乌龙茶产品作为实验对象。 0008 步骤 （2） 中， 替换为： 取20-30mg的茶叶样品， 用液氮速冻， 在液氮中研磨至 粉末， 加入已加600 LAP1缓冲液。
14、和6-8 g蛋白酶K的1.5mL离心管中， 在42恒温水浴锅中 水浴15h。 0009 步骤 （3） 对所提取样品的DNA进行PCR扩增， 获得高纯度的matK片段。 0010 本发明的优点在于： 使用改良的植物DNA提取试剂盒， 成功提取出一定浓度的样品DNA， 电泳条带清晰， 克服 了原试剂盒和常用植物DNA提取方法提取样本DNA浓度低、 无电泳条带的情况； 将DNA条形码 技术应用于闽南乌龙茶产品的品种鉴定， 极大程度减少了感官审评的造成的误差， 提高产 品品种的鉴定效率， 有利于闽南乌龙产品市场的规范。 附图说明 0011 图1不同闽南乌龙茶产品的总DNA电泳图， 从左至右分别为铁观音。
15、A、 铁观音B、 铁观 音C、 Maker、 Maker、 金观音、 本山、 铁观音D、 黄金桂、 Maker。 0012 图2不同品种的matK序列的PCR产物电泳图， 从右至左分别为DNAmaker、 铁观音、 铁观音、 本山、 本山、 黄旦、 黄旦、 大叶乌龙、 大叶乌龙、 福建水仙、 金观音、 毛蟹、 佛手。 具体实施方式 0013 实施例1 （1） 茶样的准备： 所选样品为福建省主要闽南乌龙茶产地不同茶树品种制成的闽南乌 龙茶茶叶样品， 详细信息见表1。 0014 表1样品信息表 说明书 2/4 页 4 CN 105950749 A 4 （2） 上述茶叶样品DNA的提取： 提取方法主。
16、要是对艾德来生物公司的新型植物基因组 DNA快速提取试剂盒进行改良。 试剂盒提取植物DNA的步骤为： 取适量植物组织在研钵中 加入液氮充分研磨成细粉； 研磨前准备一个1.5mL的离心管， 加入400 l缓冲液AP1和4 lRNase室温备用； 转移细粉20-30mg到前面准备的1.5mL离心管漩涡振荡， 充分混匀帮助 裂解； 65水浴10min， 在水浴过程中颠倒离心管3次， 混合样品； 加入130 l缓冲液AP2， 充分混匀， 冰上放置5分钟， 14000rpm离心5-10min， 小心吸取上清液到一个新的1.5mL离心 管中； 计算上清量加入1.5倍体积的AP3/E， 立即吹打混匀； 将上。
17、一步所得的混合物加入 一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中） 13000rmp离心50秒， 倒掉收集管中的废液； 加入 600 l漂洗液WB， 12000rmp离心30秒， 弃掉废液； 加入600 l漂洗液WB， 12000rmp离心30秒， 弃掉废液； 将吸附柱AC放回空收集管中， 13000rmp离心2分钟， 尽量去除漂洗液； 取出吸 附柱AC放入一个干净的离心管中， 在吸附膜的中间部位加100 l洗脱缓冲液EB， 室温放置 4min， 12000rmp离心1min， 将得到的溶液重新加入吸附柱中， 室温放置2min， 12000rmp离心 1min。 所得的DNA可存放于2-8， 若要。
18、长时间保存可放置于-20。 0015 改良的步骤为： 取20-30mg的茶叶样品， 用液氮速冻， 在液氮中研磨至粉末， 加入已 加600 lAP1缓冲液和6-8 g蛋白酶K的1.5mL离心管中， 在42恒温水浴锅中水浴15h， 后续 步骤参照艾德来生物公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒的说明书中的步骤-， 最后加入3 lRNase在37水浴锅中水浴30min。 茶叶样品DNA的提取： 提取方法主要是对艾 德来生物公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒进行改良。 先取20-30mg的茶叶样品， 用液氮速冻， 在液氮中研磨至粉末， 加入已加600 lAP1缓冲液和6-8 g蛋白酶K的1.5。
19、mL离 心管中， 在42恒温水浴锅中水浴15h， 后续步骤参照艾德来生物公司的新型植物基因组 DNA快速提取试剂盒的说明书。 0016 （3） 特定基因序列的PCR扩增、 纯化： matK序列扩增， PCR扩增总体积为20 L， 反应体 系为PCRmix10 L （GenstarBiosolutionsCo.） ， 上下游引物各1 L， 茶叶样品总DNA1 L， ddH2O7 L。 PCR反应程序为95预变性30s； 5630s， 7230s， 10个循环； 8830s， 56 30s， 7230s， 25个循环； 7210min。 纯化PCR产物送至铂尚生物公司测序。 0017 （4） 序列。
20、分析： 测序后得到的序列利用Chromas软件检查峰图， 要求峰图质量达到 数据分析要求， 再利用DNASTAR进行正反序列的拼接。 用所得的序列建立闽南乌龙茶产品的 说明书 3/4 页 5 CN 105950749 A 5 基因库。 数据库中的基因序列片段用软件MAFFT7.237自动比对， 并借助软件优化比对结果。 将比对结果导入Mega6.0软件， 计算出闽南乌的种内最大变异值。 0018 （5） 未知品种闽南乌龙茶鉴定： 选择未知品种的闽南乌龙茶， 按照步骤 （2） 提取其 总DNA， 再根据步骤 （3） 进行操作， 获得未知品种闽南乌龙茶的DNA条形码序列， 与步骤 （4） 所 建的。
21、基因库进行比对。 主要根据构建系统发生树， 遗传距离最小的对应的物种即为待测闽 南乌龙茶的品种。（建议对具体的实施结果进行分析） 表1.matK通用引物序列 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修 饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 4/4 页 6 CN 105950749 A 6 SEQUENCELISTING 福建农林大学 一种基于DNA条形码技术的闽南乌龙茶品种鉴定方法 2 2 PatentInversion3.3 1 25 DNA 人工序列 1 cgtacagtacttttgtgtttacgag25 2 27 DNA 人工序列 2 acccagtccatctggaaatcttggttc27 序列表 1/1 页 7 CN 105950749 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 105950749 A 8 。