技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测Δ42PD1的引物、试剂盒和检测方法。
背景技术
细胞程序性细胞死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)，又名CD279，属于CD28分子家族，表达于激活的T细胞，NKT细胞，B细胞和巨噬细胞表面PD-1有两个配体，PD-L1(又名CD274或者B7-H1)和PD-L2(又名CD273或者B7-DC)，二者都是B7家族成员。研究结果表明，PD-1/PD-L通路(包括PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L2)具有免疫抑制功能。
在研究中国人群PD-1分子的基因多态性时首次发现了一种全新的PD-1基因的mRNA选择性剪接转录本。与全长PD-1mRNA相比，该新型转录本框内缺失了外显子2起始端的42个碱基(ACT CCC CAG ACA GGC CCT GGA ACC CCC CCA CCT TCT CCC CAG)，该段碱基编码PD-1胞外区的14个氨基酸(DSPDRPWNPPTFFP)。因此，该新型PD-1基因的选择性剪接转录本被命名为Δ42PD1。研究发现，常用的商业化的PD-1的单克隆抗体(EH12.2H7,MIH4,EH12.1，J110等)不能识别Δ42PD1，提示14个氨基酸的缺失使Δ42PD1的结构发生显著变化。此外，Δ42PD1也不能与PD-1的配体(PD-L1和PD-L2)相结合。以上结果表明，Δ42PD1与PD-1具有不同的结构。进一步研究发现，Δ42PD1可诱导人外周血单个核细胞和树突状细胞分泌TNF-α，IL-6和IL-1β等前炎性细胞因子。此外，在小鼠体内Δ42PD1可作为分子佐剂，显著增强HIV Gag p24DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，这些结果都提示Δ42PD1可能具有重要的免疫调节功能。
然而，Δ42PD1与PD-1序列的高度一致性，显著增加了开发特异性检测该基因转录水平的技术手段，限制了对该新发现免疫调节分子的研究和应用。
然而，Δ42PD1与PD-1序列的高度一致性，显著增加了开发特异性检测该基因转录水平的技术手段，限制了对该新发现免疫调节分子的研究和应用。目前对基因转录水平的常用检测方法包括普通PCR和qPCR等。PCR技术是终点法分析，需要PCR后的凝胶电泳分析结果，耗时较长，使用的染料(如EB等)具有致癌性，且其检测灵敏度较低。qPCR又分为探针法和SYBR Green I法，二者均无需电泳分析，且灵敏度高，可定量。但是探针法需要使用较为昂贵的特异性探针，成本较高，不利于大规模使用；而SYBR Green I法虽无需为使用较为昂贵的探针而被广泛使用，但其所用引物的特异性和灵敏性则成为设计的关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的检测Δ42PD1的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短和适用范围广的引物对和含有该引物对的试剂盒及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
本发明一方面公开了一种用于检测Δ42PD1的引物对，所述引物对的扩增产物和/或扩增量能区分Δ42PD1和PD-1序列。
在一优选例中，检测Δ42PD1的引物对的两条引物序列均与Δ42PD1完全配对，且其中一条引物序列在与PD-1序列配对时被PD-1序列中形成的Δ42PD1的剪接位点所隔断。
在一优选例中，在剪接位点所隔断的引物序列，隔断后分为引物的上游区域和引物的下游区域，所述上游区域的碱基与下游区域的碱基比为1：4～4：1。
在一优选例中，检测Δ42PD1的引物对中的一条序列包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在一优选例中，另一条引物序列包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
在一优选例中，所述的区分所用的方法为荧光定量PCR方法。
在一优选例中，所述的区分所用的方法为荧光定量PCR SYBR Green I染料法。同时区分方法不局限于荧光定量PCR方法，区分方法还包括芯片杂交、测序、凝胶电泳等方法。
本发明第二方面公开了上面所述引物对在制备检测Δ42PD1的产品中的应用。
在一优选例中，所述检测Δ42PD1的产品包括PCR扩增试剂。
在一优选例中，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂。
本发明第三方面公开了一种试剂盒，包括上面所述的引物对。
在一优选例中，试剂盒还包括PCR扩增试剂。
在一优选例中，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂。
在一优选例中，所述荧光定量PCR试剂包括来自TaKaRa公司的货号为RR820A的Premix Ex TaqTMII试剂盒所包含的试剂。
在一优选例中，试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
在一优选例中，试剂盒还包括RNA提取试剂。
在一优选例中，所述RNA提取试剂包括来自TIANGEN公司的货号为Cat.#DP419的RNAsimple Totle RNA Kit总RNA提取试剂盒所包含的试剂。
在一优选例中，试剂盒还包括逆转录试剂。
在一优选例中，所述逆转录试剂包括来自TaKaRa公司的货号为Code No.6110A的逆转录试剂盒1st Strand cDNA Synthesis Kit所包含的试剂。
本发明第四方面公开了上面所述的试剂盒在检测Δ42PD1中的应用。
本发明第五方面公开了一种检测待测样品中Δ42PD1的方法，包括使用上面所述的引物对的步骤。
在一优选例中，检测待测样品中Δ42PD1的方法，所述待测样品为包含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为质粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的试剂；
在一优选例中，当待测样品为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或为质粒时，将其直接作为模板与所述引物对进行实时荧光PCR反应；然后判断待测样品中Δ42PD1的存在和/或含量。
在一优选例中，当待测样品为含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为mRNA，或为含有mRNA的试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段再进行实时荧光PCR反应检测；然后判断待测样品中Δ42PD1的存在和/或含量。
在一优选例中，所述待测样品为血液时，还包括对血液的总RNA提取的步骤以及对总RNA进行逆转录的步骤。
在一优选例中，检测待测样品中Δ42PD1的方法，利用荧光PCR反应检测所用的反应体系如下：
在一优选例中，上面所述的荧光PCR反应的程序如下：98℃预变性1分钟；98℃变性10s、60℃退火30s，40个循环。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明针对Δ42PD1设计的扩增引物特异性好、灵敏度高、检测时间短和适用范围广。
(2)本发明建立的Δ42PD1的检测方法，可灵敏、准确、简便和快速的定性和/或定量的检测Δ42PD1的存在和/或含量，对Δ42PD1与PD-1序列可进行高度区分。
附图说明
图1Δ42PD1与PD-1的有差异部分的基因序列对比，以及Δ42PD1上游引物的序列(SEQ ID NO.1)在Δ42PD1与PD-1对应的位置的示意图。
图2 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2引物对检测Δ42PD1的特异性分析结果示意图。
图3 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2引物对检测Δ42PD1的灵敏性分析结果示意图。
图4 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2引物对定量检测Δ42PD1的Ct值与Δ42PD1拷贝数的线性回归分析。
图5每ml人外周血Δ42PD1mRNA拷贝数检测结果示意图。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种检测人Δ42PD1转录水平的引物对及其应用。
引物对的设计：上游引物(SEQ ID NO.1)包含20个寡核苷酸，其中前16个核苷酸位于Δ42PD1的第一个外显子上，后4个位于第二个外显子上，该设计可以排除基因组PD-1DNA对检测结果的干扰；此外在PD-1全长转录本上，上游引物的前16个寡核苷酸和后4个寡核苷酸所对应的核酸序列之间存在42个碱基(如图1所示)，以排除PD-1mRNA对检测结果的干扰，即上游引物序列跨越PD-1形成Δ42PD1的剪接位点，是该对引物可以特异性检测Δ42PD1mRNA的关键所在。
为得到灵敏度和特异性最好的引物，我们最初设计了至少5条跨越剪接位点的上游引物，实验结果发现，尽管这至少5条上游引物的检测敏感性相当，但是上游引物(SEQ ID NO.1)的特异性显著优于其它4条引物。
引物对具体序列如下：
上游引物F：5’-CCAGGATGGTTCTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO.1)，
下游引物R：5’-GCTTGTCCGTCTGGTTGCTG-3’(SEQ ID NO.2)。
上述引物对由深圳华大基因科技有限公司合成。
上述PCR引物可应用于制备检测Δ42PD1的产品，以对Δ42PD1与PD-1序列可进行高度区分；所述检测Δ42PD1的产品还可以包括PCR扩增试剂；所述PCR扩增试剂优选为荧光定量PCR试剂。
实施例2
本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
(1)上游引物F和下游引物R(来自实施例1)；
(2)来自TaKaRa公司的货号为RR820A的Premix Ex TaqTMII试剂盒所包含的试剂。
实验证明，上述Premix Ex TaqTMII试剂盒、上游引物F和下游引物R的联合使用，具有省时、经济、可重复性高、高灵敏度和特异性的特点，效果更加优越。
上述试剂盒可应用于检测Δ42PD1上，能够高度区分Δ42PD1与PD-1序列。
实施例3
本实施例提供了一种检测待测样品中Δ42PD1的方法，例如检测待测样品中Δ42PD1的存在和/或含量，该方法使用了实施例1的RPA引物和实施例2的试剂盒。
上述待测样品可以为包含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为质粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的试剂。当待测样品为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或为质粒时，将其直接作为模板与所述引物对进行实时荧光PCR反应；然后判断待测样品中Δ42PD1的存在和/或含量；
当待测样品为含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为mRNA，或为含有mRNA的试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段再进行实时荧光PCR反应检测；然后判断待测样品中Δ42PD1的存在和/或含量。例如当待测样品为血液时，还需要对血液的总RNA提取以及对总RNA进行逆转录，以得到cDNA样品，总之待测样品本身为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或为质粒时不作处理，其余均需处理成DNA、cDNA或cDNA片段样品。
上述方法包括如下步骤：
1.实时荧光PCR反应
按照Premix Ex TaqTMII(Code No.RR820A,TaKaRa)试剂盒的说明配制反应液：取12.5μL SYBR Premix Ex Taq II、1μL上游引物F(10μM)、1μL下游引物R(10μM)、0.5μL ROX Reference Dye II、1μL DNA或cDNA或cDNA片段(拷贝数为101至109)、9μL超纯水加入至0.2mL PCR反应管中，以超纯水为阴性对照样品，振荡混匀后瞬时离心数秒。将反应管置于ViiATM7实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行实时荧光PCR扩增和检测，所述实时荧光PCR扩增的程序如下：98℃1分钟；98℃10秒，60℃30秒，40个循环。如表1所示。
表1
2.判断待测样品中Δ42PD1的存在和/或含量
在每个循环的60℃阶段结束后收集荧光信号并进行熔融曲线的分析，结果为阳性(Ct≤33)代表待测样品中含有Δ42PD1，结果为阴性(Ct＞33)则代表待测样品中未含Δ42PD1。
当需要判断待测样品中Δ42PD1的含量时，则在上述步骤1中还需设定已知拷贝数的阳性对照。
实施例4
本实施例对实施例1的引物对进行了特异性验证，具体包括如下步骤：
1.样品制备
将Δ42PD1和PD-1全长cDNA(其中PD-1来源于Genbank的ID NM_005018)插入载体pVAX1载体(货号V260-20，美国Invitrogen公司)中，构建真核表达质粒pVAX-Δ42PD1和pVAX-PD1。采用质粒中量提取试剂盒(货号D0018，上海碧云天生物技术有限公司)，并按照试剂盒说明制备质粒pVAX-Δ42PD1和pVAX-PD1。用微量紫外分光光度计分别测定质粒pVAX-Δ42PD1和pVAX-PD1的浓度，通过其分子量计算出拷贝数，然后制备拷贝数为1×109/μL的样品。
2.PCR反应
按照Premix Ex TaqTMII(Code No.RR820A,TaKaRa)试剂盒的说明配制反应液：取12.5μL SYBR Premix Ex Taq II、1μL上游引物F(10μM)、1μL下游引物R(10μM)、0.5μL ROX Reference Dye II、1μL样品、9μL超纯水加入至0.2mL PCR反应管中，以超纯水为阴性对照样品，振荡混匀后瞬时离心数秒。将反应管置于ViiATM7实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行实时荧光PCR扩增和检测，所述实时荧光PCR扩增的程序如下：98℃1分钟；98℃10秒，60℃30秒，40个循环。如表1所示。
表1
3.结果：
检测结果如图2所示，图2表明109拷贝数的Δ42PD1样品的Ct值为10.065，109拷贝数的PD1样品的Ct值为31.572，阴性对照检测不到Ct值。此实验结果说明用该引物对扩增Δ42PD1的效率约为扩增PD-1的效率的221(231.572-10.065)倍，具有非常强的特异性。
实施例5
本实施例对实施例1的引物对进行了灵敏性验证，具体包括如下步骤：
1.样品制备
用微量紫外分光光度计分别测定质粒pVAX-Δ42PD1(质粒的制备见实施例4)的浓度，通过其分子量计算出拷贝数，然后依次制备10倍梯度稀释至个位拷贝数的样品，共计7个梯度，拷贝数为：1×106至1×100/μL。
2.PCR反应
按照Premix Ex TaqTMII(Code No.RR820A,TaKaRa)试剂盒的说明配制反应液：取12.5μL SYBR Premix Ex Taq II、1μL上游引物F(10μM)、1μL下游引物R(10μM)、0.5μL ROX Reference DyeII、1μL样品、9μL超纯水加入至0.2mL PCR反应管中，以超纯水为阴性对照样品，振荡混匀后瞬时离心数秒。将反应管置于ViiATM7实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行实时荧光PCR扩增和检测，所述实时荧光PCR扩增的程序如下：98℃1分钟；98℃10秒，60℃30秒，40个循环。如表2所示。
表2
3.结果：检测结果如图3所示，图3表明用所述引物的qPCR检测Δ42PD1的检测下线为1(100)拷贝，而阴性对照检测不到Ct值。且Ct值与Δ42PD1拷贝数之间具有非常强的线性关系(P<0.0001，r＝0.999，图4)，表明用本发明的引物对的qPCR检测Δ42PD1的灵敏性非常强。
实施例6
本实施例提供了实施例1中提供的引物对定量检测人外周血Δ42PD1mRNA逆转录后cDNA的拷贝数。
1.样品制备
取24名健康人静脉抗凝血(EDTA抗凝)250μL，用RNAsimple Totle RNA Kit总RNA提取试剂盒(Cat.#DP419，TIANGEN)，参考试剂盒说明书，提取血液细胞总RNA，溶于50μL无RNA酶的超纯水中。取12.5μL总RNA，用逆转录试剂盒1st Strand cDNA Synthesis Kit(Code No.6110A，TaRaKa)，参考试剂盒说明书，进行逆转录合成20μL cDNA。阳性对照的标准品制备如实施例4所述的样品制备。
2.PCR反应
按照Premix Ex TaqTMII(Code No.RR820A,TaKaRa)试剂盒的说明配制反应液：取12.5μL SYBR Premix Ex Taq II、1μL上游引物F(10μM)、1μL下游引物R(10μM)、0.5μL ROX Reference Dye II、1μL cDNA模板(由健康人抗凝血制备)、9μL超纯水加入至0.2mL PCR反应管中；以超纯水为阴性对照模板，用标准品平行做阳性对照实验。振荡混匀后瞬时离心数秒。将反应管置于ViiATM7实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行实时荧光PCR扩增和检测，所述实时荧光PCR扩增的程序如表2所示。
3.结果
检测结果如图5所示，图5表明24例健康成年人外周血中Δ42PD1cDNA拷贝数平均值为7.92×107，最小和最大值分别为2.85×106和1.91×108。