技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及毕赤酵母重组子表达人源SOD的研究。
背景技术
作为真核细胞，巴斯德4fswh8p赤酵母具有许多的高等真核细胞特性表达系统的优点，如蛋白质加工，蛋白质折叠，翻译后修饰，且像大肠杆菌或酵母酿酒酵母生物一样容易操作。相比于杆状病毒或哺乳动物组织培养，巴斯德毕赤酵母具有更快，更方便，较便宜，高水平表达等优点。作为酵母菌的一种，巴斯德毕赤酵母拥有和酿酒酵母分子和遗传同样的操作优势，同时还具有10至100倍的异源蛋白质表达水平。这些特点使毕赤酵母作为蛋白表达系统成为可能。
巴斯德毕赤酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源。在甲醇代谢的第一步是氧化的甲基甲醇通过酶醇氧化酶作用产生甲醛，除了产生甲醛，还产生了过氧化氢。避免过氧化氢的毒性作用，甲醇代谢在一个特殊的细胞器，称为过氧化物酶体，这个细胞器的作用可以螯合副产物将有毒成分带走细胞外。由于醇氧化酶对于氧气具有差的亲和力，所以毕赤酵母通过产生大量的酶来补充醇氧化酶。醇氧化酶的大量产生是驱动异源蛋白质在毕赤酵母表达的一个因素。
但目前研究中毕赤酵母表达的培养条件，发酵过程结束后，存在着SOD表达含量低，细胞内表达，酶活力低等不利因素。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明旨在提供一种通过改变条件来优化目的蛋白的表达量的方法。
本发明采用的技术方案是：毕赤酵母重组子表达人源SOD的研究中优化的培养条件包括：
1)培养基；
重组毕赤酵母在BMGY中培养进行诱导表达；
2)通气；
将有重组毕赤酵母的BMGY至于底部或侧壁有挡板的三角瓶中进行培养，三角瓶的容积尺寸为500ml，培养基的体积需小于或等于三角瓶体积的10％-30％，选用2-3层棉纱布或是宽松的瓶塞盖在三角瓶上；
3)温度和摇床震荡速度；
将装有培养基的三角瓶至于恒温震荡培养箱中培养，温度设置为30℃；所述恒温震荡培养箱若采用落地式恒温震荡培养箱，那么设定震荡转速为225-250rpm；若采用台面式恒温振荡培养箱，那么设定震荡转速为250-300rpm；
4)甲醇浓度；
在重组毕赤酵母分泌表达SOD过程中，在其培养液中添加甲醇至甲醇终浓度为1％；
5)铜离子浓度；
在重组毕赤酵母分泌表达SOD过程中，在其培养液中添加硫酸铜至铜离子终浓度为1％；
所述BMGY的成分组成包括：酵母浸粉、蛋白胨、pH6.0磷酸钾缓冲溶液、YNB、生物素、甲醇、水。
所述BMGY的各成分的含量为：每100ml培养基液中含有1g酵母浸粉、2g蛋白胨、100mM pH6.0的磷酸钾缓冲溶液、1.34gYNB(YNB培养基商品)、4×10-5g生物素、1g甲醇，其余成分为水。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：通过培养条件的优化，在500ml的三角瓶、装液量为20％、30℃、225rpm、Cu2+浓度为1％、甲醇浓度为1％，培养基24h时，重组毕赤酵母表达人源SOD的酶活力最高，可达到18.322U/ml。通过此发酵条件优化后，可以获得分泌型的SOD发酵液，并且具有酶活性的SOD产品。
附图说明
图1为SOD标准品曲线图；
图2为不同浓度甲醇下各重组毕赤酵母表达SOD活力测定图；
图3为不同时间内各浓度铜离子处理重组毕赤酵母表达SOD活力测定图；
图4为重组毕赤酵母表达SOD的SDS-PAGE测定图；
图5为重组毕赤酵母表达SOD的Western测定图。
具体实施方式
本发明采用的技术方案是：
一、毕赤酵母重组子表达人源SOD的研究中优化的培养条件包括：
1)培养基；
重组毕赤酵母在BMGY中培养进行诱导表达；
2)通气；
将有重组毕赤酵母的BMGY至于底部或侧壁有挡板的三角瓶中进行培养，三角瓶的容积尺寸在50-2000ml范围内，培养基的体积需小于或等于三角瓶体积的10％-30％，选用2-3层棉纱布或是宽松的瓶塞盖在三角瓶上；
3)温度和摇床震荡速度；
将装有培养基的三角瓶至于恒温震荡培养箱中培养，温度设置为30℃；所述恒温震荡培养箱若采用落地式恒温震荡培养箱，那么设定震荡转速为225-250rpm；若采用台面式恒温振荡培养箱，那么设定震荡转速为250-300rpm；
4)甲醇浓度；
在重组毕赤酵母分泌表达SOD过程中，分别在其培养液中添加甲醇至甲醇终浓度分别为0.5％、1％、2％，于恒温震荡培养箱中于30℃、225rpm条件下培养48h，测定SOD酶活力，测定结果如图2所示；
5)铜离子浓度；
在重组毕赤酵母分泌表达SOD过程中，分别在其培养液中添加硫酸铜至铜离子终浓度分别为0％、0.2％、0.5％、1％，在恒温震荡培养箱中于30℃、225rpm条件下培养培养至24、48h、72h，测定SOD酶活力，测定结果如图3所示。
二、重组毕赤酵母表达SOD的SDS-PAGE测定：
1)样品制备
将SOD蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个Eppendorf管中混合；放入100℃水浴中加热5－10min，取上清点样；
2)分离胶及浓缩胶的制备
1将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad MiniⅡ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；
3按如下体积配制10％分离胶8.0ml，混匀；
ddH2O 3.0ml
1.0mol/LTris-HCl pH＝8.8 2.1ml
30％Acr-Bis 2.8ml
10％SDS 80ul
10％AP 56ul
TEMED 6ul
4向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20min后胶即可聚合；
5按如下体积配制6％浓缩胶3.0ml，混匀；
ddH2O 2.0ml
1.0mol/LTris-HClpH＝6.8 400ul
30％Acr-Bis 600ul
10％SDS 36ul
10％AP 24ul
TEMED 4ul
6将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
7装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20μl；
8稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45min～1h；
9卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2hr；加入脱色液，置于80rpm脱色摇床上,每20min更换一次脱色液(10ml冰乙酸；45ml乙醇；45ml蒸馏水)至完全脱净；测定结果如图4所示。
三、重组毕赤酵母表达SOD的Western Blot测定：
1)此步骤同SDS-PAGE步骤；
2)转膜：
1Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒；
2将PVDF膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5～10min；
3将凝胶推到一张玻璃板(或投影胶片)上，在凝胶上放3层滤纸，用玻璃棒在滤纸上稍用力滚动，以除去各层间可能夹带的气泡。再在滤纸上盖一张投影胶片或玻璃板上，形成“玻璃板→凝胶→滤纸→玻璃板”装置；用手捏住上下玻璃板，将整个装置反转后放在桌面上；小心移去上面的玻璃板，在凝胶上覆盖PVDF膜，再在PVDF膜上覆盖3层滤纸，形成“3层滤纸→凝胶→PVDF膜→3层滤纸”的装置；用玻璃棒在滤纸上稍用力滚动，以除去各层间可能夹带的气泡；将上 面的装置夹在两块转印海面垫间，再夹入电转印夹。
4将电转印夹插入转印电极板间，方向为“负极→海面垫→3层滤纸→凝胶→PVDF膜→3层滤纸→海面垫→正极”；
5将转印电极板插入电泳槽，加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极，100V,1h；
3)膜的封闭：
1洗膜：室温漂洗3次×10min，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合；
2封闭：取漂洗的转印膜，放入5％No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4℃过夜；
3漂洗：用1×TBS-T，pH7.6洗液，室温漂洗3×10min；
4)抗体杂交：
1封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液(TBS-T)稀释的Ab1浓度为1μg/ml，封口，4℃孵育过夜或室温(22～25℃)摇动孵育2h；
2液洗膜3×10min；
3标记的Ab2(羊抗鼠-HRP)室温1h，洗膜3×10min。
5)ECL发光显色：
1ECL显色剂配制：按1ml H2O加显色剂A、B各1滴，混匀；
2在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上混合好的显色液，约1～5min；
3用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液，将一透明的玻璃纸盖住抚平，并确定干的表面与胶片接触；
4将印迹膜在暗室中使胶片暴光1～5min，冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时间，暴光时间可短至几秒也可以长到数小时。测定结果如图5所述。
四、SOD酶活力测定操作方法：
1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为72U/mL，48U/mL，24U/mL，12U/mL，6U/mL)；
2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
4)配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用；
5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
7)温育：操作同本过程的步骤3)；
8)洗涤：操作同本过程的步骤5)；
9)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
11)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)；测定应在加终止液后15分钟以内进行。
五、SOD酶活力测定计算方法：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，如图1所示，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
从图2、图3、图4以及图5的测试结果能够得到通过培养条件的优化，在500ml的三角瓶、装液量为20％、30℃、225rpm、Cu2+浓度为1％、甲醇浓度为1％，培养基24h时，重组毕赤酵母表达人源 SOD的酶活力最高，可达到18.322U/ml。通过此发酵条件优化后，可以获得分泌型的SOD发酵液，并且具有酶活性的SOD产品。