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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610280845.X (22)申请日 2016.04.29 (71)申请人 中国科学院微生物研究所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院 3号 (72)发明人 钟瑾葛晓璇滕坤玲 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅白艳 (51)Int.Cl. C12N 9/12(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 9/38(20。
2、06.01) (54)发明名称 一种提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导 效率的方法 (57)摘要 本发明公开了一种提高乳酸菌NICE表达系 统中nisin诱导效率的方法。 本发明通过对诱导 剂nisin分子的受体组氨酸激酶NisK进行突变改 造， 来增加其对nisin的感受活性。 通过实验证 明： 将NisK突变改造后， 经相同浓度nisin诱导 后， 报告蛋白的表达量有明显升高， nisin的诱导 效率明显增强， 这对于利用NICE系统提高外源蛋 白表达量、 降低诱导剂浓度及降低系统构建的复 杂性都具有非常重要的意义。 权利要求书1页 说明书5页 序列表13页 附图1页 CN 105。
3、950582 A 2016.09.21 CN 105950582 A 1.一种蛋白质， 为如下(1)或(2)或(3)： (1)将NisK蛋白氨基酸序列的第59位的异亮氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质； (2)将NisK蛋白氨基酸序列的第108位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质； (3)将NisK蛋白氨基酸序列的第46位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质。 2.根据权利要求1所述蛋白质， 其特征在于： 所述NisK蛋白为如下a)或b)的蛋白质： a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功。
4、能的由a)衍生的蛋白质。 3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。 4.根据权利要求3所述核酸分子， 其特征在于： 所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)或 5)所示的基因： 1)其编码序列是序列表中序列3的DNA分子； 2)其编码序列是序列表中序列4的DNA分子； 3)其编码序列是序列表中序列5的DNA分子； 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子； 5)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白质 的DNA分子。 5.下述a1)-a4)中的任一种生物材料： a1)含有权利要求3或4所述核酸分子。
5、的表达盒； a2)含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体； a3)含有权利要求3或4所述核酸分子的重组菌； a4)含有权利要求3或4所述核酸分子的转基因细胞系。 6.权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述核酸分子或权利要求5所述生物材料 在如下b1)-b4)中任一种中的应用： b1)提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导效率； b2)制备提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导效率的产品； b3)提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导外源蛋白表达量； b4)制备提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导外源蛋白表达量的产品。 7.一种NICE表达系统， 其特征在于： 其中的N。
6、isK蛋白为权利要求1所述蛋白质。 8.一种提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导外源蛋白表达量的方法， 其特征在于： NICE表达系统中的NisK蛋白为权利要求1所述蛋白质。 9.一种提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导外源蛋白表达量的方法， 包括如下步骤： nisin诱导下， 使乳酸菌NICE表达系统表达权利要求1所述蛋白质。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于： 所述外源蛋白为 -半乳糖苷酶。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105950582 A 2 一种提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导效率的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一。
7、种提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导 效率的方法。 背景技术 0002 乳链菌肽nisin是由乳酸乳球菌产生的一种羊毛硫细菌素， 是通过核糖体合成并 经过翻译后修饰形成的具有生物活性的抗菌肽。 由于其具有优良的抑菌活性， 已经作为天 然安全的食品防腐剂在世界上80多个国家和地区广泛应用40余年。 Nisin的生物合成相关 基因成簇排列， 形成基因簇。 Nisin的前肽蛋白首先由nisA编码合成， 经过NisBC修饰、 NisT 转运到细胞外， 最后由NisP切除前导肽形成成熟有活性的nisin。 NisFEGI负责对nisin分子 的免疫， 使自身细胞不受nisin的伤害。 同时， N。
8、isin通过组氨酸激酶NisK和反应调节蛋白 NisR形成的双组份调控系统来对自身的生物合成进行调控。 Nisin诱导NisK进行自磷酸化， 然后将磷酸基团转移给NisR使其活化， 从而结合nisA和其它相关基因的启动子， 激活下游 基因的表达。 Nisin控制的基因表达系统NICE(NIsinControlledgeneExpression system)就是以nisin结构基因nisA的启动子和双组分调控系统基因nisRK为基础构建的食 品级表达系统， 由外界添加nisin诱导引发nisA启动子控制下基因的表达， 因具操作方便、 严谨性强、 诱导型表达利于毒性蛋白表达、 表达产量高等特点，。
9、 是迄今在乳酸菌中应用最广 泛的表达系统之一。 0003 许多报道证明了利用NICE系统在乳酸菌中表达异源蛋白的多功能性和有效性， 其 诱导效率可超过1000倍以上。 但由于nisin对革兰氏阳性菌有一定抑制作用， 高浓度使用可 能会伤害宿主菌而导致蛋白表达量下降， 通常使用亚致死剂量诱导NICE系统中目标蛋白的 表达。 而在工业生产中， 对目标蛋白表达量最大化的需求， 往往需通过提高nisin的诱导浓 度来实现， 但这不仅易使宿主细胞受到伤害， 也增加了生产成本。 因此提高nisin的诱导效 率， 使相同浓度nisin能诱导产生更高表达量的目标蛋白是现今迫切需要解决的问题， 也一 直是研究者。
10、们关注的焦点。 发明内容 0004 本发明的第一个目的是提供一种蛋白质。 0005 本发明提供的蛋白质为如下(1)或(2)或(3)： 0006 (1)将NisK蛋白氨基酸序列的第59位的异亮氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质； 0007 (2)将NisK蛋白氨基酸序列的第108位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质； 0008 (3)将NisK蛋白氨基酸序列的第46位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白质。 0009 上述蛋白质中， 所述NisK蛋白为如下a)或b)的蛋白质： 0010 a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 0011 b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸。
11、残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。 说明书 1/5 页 3 CN 105950582 A 3 0012 本发明的第二个目的是提供编码上述蛋白质的核酸分子。 0013 上述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)或5)所示的基因： 0014 1)其编码序列是序列表中序列3的DNA分子； 0015 2)其编码序列是序列表中序列4的DNA分子； 0016 3)其编码序列是序列表中序列5的DNA分子； 0017 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白质的DNA分子； 0018 5)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90以上的同源性且编码上。
12、述蛋白质的DNA 分子。 0019 本发明的第三个目的是提供下述a1)-a4)中的任一种生物材料： 0020 a1)含有上述核酸分子的表达盒； 0021 a2)含有上述核酸分子的重组载体； 0022 a3)含有上述核酸分子的重组菌； 0023 a4)含有上述核酸分子的转基因细胞系。 0024 本发明的第四个目的是提供上述蛋白质或上述核酸分子或上述生物材料的新用 途。 0025 本发明提供了上述蛋白质或上述核酸分子或上述生物材料在如下b1)-b4)中任一 种中的应用： 0026 b1)提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导效率； 0027 b2)制备提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导。
13、效率的产品； 0028 b3)提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导外源蛋白表达量； 0029 b4)制备提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导外源蛋白表达量的产品。 0030 本发明的第五个目的是提供一种NICE表达系统。 0031 本发明提供的NICE表达系统中的NisK蛋白为上述蛋白质。 0032 本发明的第六个目的是提供一种提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导外源蛋白 表达量的方法。 0033 本发明提供的提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导外源蛋白表达量的方法为使 NICE表达系统中的NisK蛋白为上述蛋白质。 0034 本发明的最后一个目的是提供一种提高乳酸菌N。
14、ICE表达系统中nisin诱导外源蛋 白表达量的方法。 0035 本发明提供的提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导外源蛋白表达量的方法包括 如下步骤： nisin诱导下， 使乳酸菌NICE表达系统表达上述蛋白质。 0036 上述方法中， 所述使乳酸菌NICE表达系统表达上述蛋白质的方法为将乳酸菌NICE 表达系统中的NisK蛋白的编码基因序列进行突变， 使所述乳酸菌NICE表达系统表达上述蛋 白质。 0037 上述方法中， 所述将乳酸菌NICE表达系统中的NisK蛋白的编码基因序列进行突变 为如下1)或2)或3)： 0038 1)将乳酸菌NICE表达系统中的NisK蛋白的编码基因的第13。
15、7位脱氧核糖核苷酸由 A突变C， 第138位脱氧核糖核苷酸由A突变G； 0039 2)将乳酸菌NICE表达系统中的NisK蛋白的编码基因的第323位脱氧核糖核苷酸由 说明书 2/5 页 4 CN 105950582 A 4 A变为C， 第324位脱氧核糖核苷酸由A突变为G； 0040 3)将乳酸菌NICE表达系统中的NisK蛋白的编码基因第175脱氧核糖核苷酸由A突 变为G， 第176位脱氧核糖核苷酸由T突变为C， 第177位脱氧核糖核苷酸由T突变为G。 0041 上述方法中， 所述外源蛋白为 -半乳糖苷酶。 0042 本发明通过对诱导剂nisin分子的受体组氨酸激酶NisK(NICE表达系统。
16、中的必要 蛋白)进行突变改造， 来增加其对nisin的感受活性。 通过实验证明： 将NisK改造后， 经相同 浓度nisin诱导后， 报告蛋白的表达量有明显升高， 对于利用NICE系统提高外源蛋白表达 量、 降低诱导剂浓度及降低系统构建的复杂性都具有非常重要的意义。 附图说明 0043 图1为质粒pMG36e-RKNlacZ的结构图。 其中， 质粒pMG36e-RKNlacZ中nisR和NisK基 因由P32启动子控制表达， lacZ基因由nisA的启动子PnisA控制表达。 0044 图2为NisK蛋白的结构示意图。 上图是SMART网站预测的NisK蛋白的结构图， N端含 有两个跨膜区， 。
17、C端是二聚化及自磷酸化区HisKA及ATP酶所含保守区HATPase。 下图为根据 上图所画的NisK结构示意图。 0045 图3为NisK蛋白N端胞外区的二级结构预测及突变位点。 红色氨基酸代表的是被突 变的位点。 0046 图4为NisK突变后NICE系统的 半乳糖苷酶活性。 其中， MU代表 半乳糖苷酶活性， “-” 代表菌株未添加nisin诱导。 0047 图5为NisK突变后NICE系统的诱导效率。 具体实施方式 0048 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0049 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0050 下述实施。
18、例中的pMG36e载体在文献 “JianqiangNi,KunlingTeng,GangLiu, CaixiaQiao,LiandongHuan,JinZhong.Autoregulationoflantibioticbovicin HJ50biosynthesisbytwo-componentsignaltransductionsystemBovK/BovRin StreptococcusbovisHJ50.ApplEnvironMicrobiol， 2011Jan； 77(2):407-15.” 中公开 过， 公众可从中国科学院微生物研究所获得。 0051 下述实施例中的乳酸乳球菌Lact。
19、ococcuslactisMG1363在文献 “LiuG,Zhong J,NiJ,ChenM,XiaoH,HuanL.CharacteristicsofthebovicinHJ50genecluster inStreptococcusbovisHJ50.Microbiology2009； 155(Pt2):58493.” 中公开过， 公 众可从中国科学院微生物研究所获得。 0052 下述实施例中的GM17培养基的配方： 细菌蛋白胨5g， 大豆蛋白胨5g， 牛肉膏5g， 酵 母粉2.5g， -磷酸甘油二钠19g， 维生素C0.5g， 1MMgSO41mL， 葡萄糖5g， 加ddH2O定容至 10。
20、00ml得到液体培养基。 0053 实施例1、 NisK突变体的获得 0054 NisK是nisin的受体蛋白， 含有两个跨膜域， 是一个膜蛋白(图2)， 其胞外区是感受 信号的关键区域。 NisK蛋白的编码基因序列为序列1， NisK蛋白的氨基酸序列为序列2， 将 说明书 3/5 页 5 CN 105950582 A 5 NisK进行突变， 使NisK的胞外区单个氨基酸替换为丙氨酸， 按照具体突变位置的不同， 分别 得到如下三种突变体： 0055 1、 NisK突变体E46A： NisK突变体E46A为将序列2所示的第46位的谷氨酸突变为丙 氨酸后得到的蛋白； NisK突变体E46A的编码基。
21、因序列为序列3。 0056 2、 NisK突变体E108A： NisK突变体E108A为将序列2所示的第108位的谷氨酸突变为 丙氨酸后得到的蛋白； NisK突变体E108A的编码基因序列为序列4。 0057 3、 NisK突变体I59A： NisK突变体I59A为将序列2所示的第59位的异亮氨酸突变为 丙氨酸后得到的蛋白； NisK突变体I59A的编码基因序列为序列5。 0058 实施例2、 NisK突变体在提高乳酸菌NICE表达系统中nisin诱导效率中的应用 0059 一、 质粒的获得 0060 1、 质粒pMG36e-RKNlacZ的获得 0061 利用pMG36e载体(含有P32启动。
22、子)构建了质粒pMG36e-RKNlacZ。 质粒pMG36e- RKNlacZ为将序列6所示的DNA片段插入pMG36e载体的酶切位点XbaI和HindIII间， 且保持 pMG36e载体的其他序列不变得到的载体。 其中， 序列6所示的DNA片段中的第8-695位核苷酸 为nisR的编码基因， 第687-2030位核苷酸为NisK的编码基因， 第5094-5330位为nisA启动子 (启动子PnisA)， 第2037-5093位核苷酸为报告基因lacZ。 在质粒pMG36e-RKNlacZ中利用P32 启动子控制nisRK的组成型表达， 利用nisA的启动子PnisA控制报告基因lacZ的诱。
23、导型表达。 0062 2、 质粒pMG36e-RKNlacZ的突变 0063 (1)将质粒pMG36e-RKNlacZ中的NisK蛋白的编码基因的第137位脱氧核糖核苷酸 由A突变C， 第138位脱氧核糖核苷酸由A突变G， 且保持质粒pMG36e-RKNlacZ的其他序列不 变， 使NisK的胞外区单个氨基酸替换为丙氨酸(图3)， 得到突变后的质粒pMG36e-RKNlacZ- E46A； 0064 (2)将质粒pMG36e-RKNlacZ中的NisK蛋白的编码基因的第323位脱氧核糖核苷酸 由A变为C， 第324位脱氧核糖核苷酸由A突变为G， 且保持质粒pMG36e-RKNlacZ的其他序列。
24、不 变， 使NisK的胞外区单个氨基酸替换为丙氨酸(图3)， 得到突变后的质粒pMG36e-RKNlacZ- E108A； 0065 (3)将质粒pMG36e-RKNlacZ中的NisK蛋白的编码基因的第175脱氧核糖核苷酸由A 突变为G， 第176位脱氧核糖核苷酸由T突变为C， 第177位脱氧核糖核苷酸由T突变为G， 且保 持质粒pMG36e-RKNlacZ的其他序列不变， 使NisK的胞外区单个氨基酸替换为丙氨酸(图3) 得到突变后的质粒pMG36e-RKNlacZ-I59A。 0066 二、 重组菌的获得 0067 分别将质粒pMG36e-RKNlacZ、 突变后的质粒pMG36e-RK。
25、NlacZ-E46A、 突变后的质粒 pMG36e-RKNlacZ-E108A和突变后的质粒pMG36e-RKNlacZ-I59A转化乳酸乳球菌 LactococcuslactisMG1363中， 分别构建得到pMG36e-RKNlacZ/MG1363和如下含NisK突变 体的三个重组表达菌株： pMG36e-RKNlacZ-E46A/MG1363、 pMG36e-RKNlacZ-E108A/MG1363和 pMG36e-RKNlacZ-I59A/MG1363。 0068 三、 重组菌的诱导表达 0069 分别将步骤二获得的各个菌株pMG36e-RKNlacZ/MG1363(WT)、 pMG3。
26、6e-RKNlacZ- E46A/MG1363(E46A)、 pMG36e-RKNlacZ-E108A/MG1363(E108A)和pMG36e-RKNlacZ-I59A/ 说明书 4/5 页 6 CN 105950582 A 6 MG1363(I59A)接种于GM17培养基中培养(培养的温度为30)， 培养至OD600值为0.6-0.7 时， 添加外源nisin诱导报告基因lacZ表达生成 -半乳糖苷酶， 诱导培养时间为2h， nisin在 各个培养体系中的浓度均为9ng/ml。 并以未加入未添加外源nisin进行诱导的菌株作为对 照。 0070 诱导培养结束后， 参照文献 “Anewand。
27、efficientphosphatestarvation inducibleexpressionsystemforLactococcuslactis .ApplMicrobiol Biotechnol.2008Jul； 79(5):803-10.” 中的方法通过检测上述各表达菌株中的 -半乳糖 苷酶的活性(MU)来检测各个表达菌株可表达外源蛋白的表达量， 并计算nisin对各个菌株 的诱导效率。 nisin对某一菌株的诱导效率的计算方法如下： 经nisin诱导后的某一菌株的 -半乳糖苷酶的活性与未添加nisin诱导的该菌株的 -半乳糖苷酶的活性的比值。 0071 各个菌株中的 -半乳糖苷酶的活。
28、性(MU)的检测结果如图4所示： 从图4可以看出， 经相同浓度nisin诱导后， 和pMG36e-RKNlacZ/MG1363(WT)相比， 三个重组表达菌株： pMG36e-RKNlacZ-E46A/MG1363(E46A)、 pMG36e-RKNlacZ-E108A/MG1363(E108A)和pMG36e- RKNlacZ-I59A/MG1363(I59A)的报告蛋白表达量均有明显升高， 三个重组表达菌株： pMG36e-RKNlacZ-E46A/MG1363(E46A)、 pMG36e-RKNlacZ-E108A/MG1363(E108A)和pMG36e- RKNlacZ-I59A/M。
29、G1363(I59A)中的报告蛋白的表达量比对照菌株pMG36e-RKNlacZ/MG1363 (WT)分别提高了38.24， 36.28和20.64。 0072 诱导效率的检测结果如图5所示： 从图中可以看出， pMG36e-RKNlacZ/MG1363(WT) 的诱导效率为138.88， 而pMG36e-RKNlacZ-I59A/MG1363(I59A)的诱导效率为1405.13， pMG36e-RKNlacZ-E46A/MG1363(E46A)和pMG36e-RKNlacZ-E108A/MG1363(E108A)的诱导效 率分别为344.9和484.12。 pMG36e-RKNlacZ-。
30、I59A/MG1363的诱导效率比pMG36e-RKNlacZ/ MG1363(WT)提高了约10.12倍， 比pMG36e-RKNlacZ-E108A/MG1363提高了约3.49倍， 比 pMG36e-RKNlacZ-E46A/MG1363提高了约2.48倍。 0073 综上所述， 对诱导剂nisin分子的受体组氨酸激酶NisK进行突变改造后， 增加了 NisK对nisin的感受活性， 提高了报告蛋白的表达量水平， 增强了NICE系统中nisin的诱导 效率。 说明书 5/5 页 7 CN 105950582 A 7 0001 序列表 1/13 页 8 CN 105950582 A 8 0。
31、002 序列表 2/13 页 9 CN 105950582 A 9 0003 序列表 3/13 页 10 CN 105950582 A 10 0004 序列表 4/13 页 11 CN 105950582 A 11 0005 序列表 5/13 页 12 CN 105950582 A 12 0006 序列表 6/13 页 13 CN 105950582 A 13 0007 序列表 7/13 页 14 CN 105950582 A 14 0008 序列表 8/13 页 15 CN 105950582 A 15 0009 序列表 9/13 页 16 CN 105950582 A 16 0010 序列表 10/13 页 17 CN 105950582 A 17 0011 序列表 11/13 页 18 CN 105950582 A 18 0012 序列表 12/13 页 19 CN 105950582 A 19 0013 序列表 13/13 页 20 CN 105950582 A 20 图1 图2 图3 图4 图5 说明书附图 1/1 页 21 CN 105950582 A 21 。