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1、(10)授权公告号 CN 101638425 B (45)授权公告日 2011.12.07 CN 101638425 B *CN101638425B* (21)申请号 200910144620.1 (22)申请日 2009.08.24 C07J 63/00(2006.01) (73)专利权人 安徽省科学技术研究院 地址 230031 安徽省合肥市蜀山区濉溪路 312 号 (72)发明人 陈龙胜 许舒雯 吕杨 陈兰 (74)专利代理机构 安徽省合肥新安专利代理有 限责任公司 34101 代理人 吴启运 CN 101311186 A,2008.11.26, 说明书第 2-4 页 . (54) 发明。
2、名称 一种自南蛇藤根皮中提取雷公藤红素的方法 (57) 摘要 一种自南蛇藤根皮中提取雷公藤红素的方 法， 以南蛇藤根皮粉为原料， 包括提取、 分离、 纯 化和重结晶， 所述的提取首先以低级氯代烷烃 为溶剂， 加热回流提取， 根皮粉与溶剂的质量比 1 3 20， 时间不少于 2 小时， 提取液脱溶后 得到浸膏状初提物， 然后向初提物中加入 50 70vt甲醇或乙醇溶液， 充分搅拌、 静置萃取， 萃 取液脱溶后得到稠膏状粗提物 ； 所述的纯化是粗 提物用甲醇溶解后用固定相为正相硅胶或反相硅 胶的柱色谱分离纯化， 收集洗脱液， 脱溶干燥后得 到粉末状精提物， 最后用乙醇 - 水混合溶剂重结 晶。本方。
3、法分离、 纯化工艺简单， 得到纯度达 98 的雷公藤红素。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李士坤 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 CN 101638425 B1/1 页 2 1. 一种自南蛇藤根皮中提取雷公藤红素的方法， 以南蛇藤根皮粉为原料， 包括提取、 分离、 纯化和重结晶， 其特征在于 ： 所述的提取首先以低级氯代烷烃为溶剂， 加热回流提取， 根皮粉与溶剂的质量比 1 3 20， 时间不少于 2 小时， 提取液脱溶后得到浸膏状初提物， 然后向初提物中加入 50 70vt甲醇或乙醇溶液， 充分搅拌。
4、、 静置萃取， 萃取液脱溶后得 到稠膏状粗提物 ； 所述的纯化是粗提物用甲醇溶解后用固定相为反相硅胶的柱色谱分离纯 化， 收集洗脱液， 脱溶干燥后得到粉末状精提物， 最后用乙醇 - 水混合溶剂重结晶 ； 所述的 低级氯代烷烃选自氯仿或均二氯乙烷或偏三氯乙烷 ； 所述的反相硅胶柱色谱固定相为 C18 或 C8反相硅胶 ； 洗脱液为 pH3 4 的 75 87vt甲醇或乙醇溶液。 权 利 要 求 书 CN 101638425 B1/4 页 3 一种自南蛇藤根皮中提取雷公藤红素的方法 一、 技术领域 0001 本发明涉及一种自植物中制备天然化学品的方法， 具体的说是一种自南蛇藤根皮 中提取雷公藤红素。
5、的方法。 二、 背景技术 0002 雷公藤红素 (tripterine) 分子式为 C29H38O 又名南蛇藤素 (Celastrol)， 是一种存 在于卫矛科植物雷公藤、 南蛇藤等植物中的五环三萜类物质， 其结构式如图。 0003 0004 以往研究表明， 雷公藤红素能抑制多种癌细胞的增值， 包括白血病、 神经胶质瘤、 前列腺癌等。 此外， 有证据显示， 雷公藤红素能参与促炎症细胞因子、 诱导性一氧化氮合酶、 黏附分子、 蛋白酶体活性、 拓扑异构酶、 钾通道以及热休克应答等调控。在体内研究方面， 雷公藤红素能显著的抑制前列腺癌以及胰腺癌细胞小鼠肿瘤抑制模型中癌细胞的增值， 并 且在系统性红斑。
6、狼疮、 哮喘、 类风湿性关节炎以及胶原诱导的关节炎等动物模型中显示有 效的抗炎症作用。因此， 无论在科研还是药物研发中雷公藤红素的需求越来越大。雷公藤 红素在已报道的植物中含量极低， 目前多采用常压反复硅胶柱层析进行分离， 得率低， 毒性 大， 而且有毒溶剂消耗也大。 0005 中国专利 20071002543.3 公开了南蛇藤茎总萜提取物及其制备方法及用途。特点 是从南蛇藤属植物南蛇藤茎中提取分离而得到含有南蛇藤茎总二、 三萜的提取物。工艺采 用 95乙醇提取， 乙酸乙酯萃取后即得南蛇藤茎总二、 三萜， 优点在于原料提取率高， 成本 低， 操作简便， 但是未提及雷公藤红素的单体制备。 000。
7、6 中国专利 200710041518.X 公开了南蛇藤素的碱金属盐化合物及其制备方法。其 特点是一种水溶性南蛇藤素碱金属盐化合物及其制备方法， 可制成药学上的各种剂型， 包 括注射剂， 特别是用于制造注射剂用粉针剂。 0007 中国专利 200710039694.X 公开了南蛇藤葡甲胺炎及其制备方法。其特点是采用 选择性的只有南蛇藤分子中羧基参与成盐的南蛇藤葡甲胺盐， 可制成药学上的各种剂型。 0008 中国专利 200510121360.8 公开了一种南蛇藤中成药及其在抗类风湿关节炎中的 应用。 其特点是从卫茅科南蛇藤属植物南蛇藤中提取分离而得到含有南蛇藤总萜类的提取 物， 经药效学及毒理。
8、学实验证明， 该提取物对类风湿关节炎具有较好的治疗作用。 说 明 书 CN 101638425 B2/4 页 4 0009 美国专利号 US4328309 公开了用植物细胞培养方法来制备雷公藤甲素、 雷公藤红 素等活性成分。 三、 发明内容 0010 本发明旨在提供高纯度的雷公藤红素， 所要解决的技术问题是遴选雷公藤红素含 量丰富的植物源及其提取方法。 0011 研究表明， 在植物源南蛇藤中， 雷公藤红素含量最为丰富， 且多集中在其根皮部 位。所以本发明的技术方案是以南蛇藤根皮粉为原料， 包括提取、 分离、 纯化、 重结晶， 所述 的提取包括动态回流提取和静态醇沉萃取， 动态回流提取是南蛇藤根。
9、皮粉按 1 3 20 的 质量比加入低级氯代烷烃加热回流提取不少于 2 小时， 冷却、 分离、 提取液脱溶得到暗红色 浸膏状初提物 ； 静态醇沉萃取是向上述初提物中加入浓度 50 70vt ( 体积百分比， 下 同 ) 的甲醇或乙醇溶液， 充分搅拌后静置萃取， 待白色析出物沉淀完全后分离， 萃取液脱溶 得到红色稠膏状粗提物 ： 所述的纯化是将粗提物溶于甲醇中用固定相为正相硅胶或者反相 C18或 C8硅胶的柱色谱分离纯化， 等度洗脱， 收集洗脱液， 脱溶、 干燥后得到红色粉末状精提 物， 精提物经重结晶得到纯度 98红色结晶状雷公藤红素。 0012 所述的低级氯代烷烃选自三氯甲烷 ( 氯仿 ) 。
10、或 1， 2- 二氯乙烷 ( 均二氯乙烷 ) 或 1， 1， 1- 三氯乙烷 ( 偏三氯乙烷 ) 等。 0013 所述的正相硅胶柱色谱固定相为 200 300 目正相硅胶， 洗脱液 ( 流动相 ) 为氯 仿 - 甲醇 ( 体积比 70 30 50 50) 混合液。 0014 所述的反相 C18或 C8硅胶柱色谱固定相相为 C18或 C8反相硅胶， 洗脱液 ( 流动相 ) 为 pH 值 3 4 的 75 87vt乙醇或甲醇溶液。 0015 重结晶所用溶剂为乙醇 - 水 ( 体积比 90 10 70 30) 混合溶剂。 0016 具体操作如下 ： 0017 1、 回流提取 ： 选取南蛇藤根皮部粉末。
11、， 按质量比加入 3 20 倍量的 1， 2- 二氯乙 烷， 加热回流提取 2-6 小时， 然后冷却静置、 分离、 过滤， 滤液减压浓缩回收溶剂得初提物， 呈暗红色浸膏状。 0018 2、 醇沉萃取 ： 将 1 步骤所得的雷公藤红素初提物溶于 50 -70vt的甲醇或乙醇 溶液， 静置取上清液或过滤取滤液浓缩得到粗提物， 呈红色稠膏状。 。 0019 3、 将 2 步骤得到的粗提物溶于甲醇中进行固定相为正相硅胶的柱色谱分离， 洗脱 方式为氯仿与甲醇混合体系 (70 30-50 50) 等度洗脱， TLC 跟踪监测雷公藤红素馏分， 收集馏分浓缩。 0020 4、 将 2 步骤得到的粗提物溶于甲醇。
12、中进行固定相为反相 C18或 C8硅胶的柱色谱分 离， 流动相为加酸调整 pH 值为 3 4 的浓度 75 87vt的乙醇或者甲醇溶液等度洗脱， HPLC-UV 监测收集洗脱液。 0021 5、 柱色谱分离后的馏分或洗脱液浓缩， 干燥后得到红色粉末， 采用两相溶剂结晶 法进一步纯化得到纯度达 98的红色结晶产品， 所用溶剂为 75 90vt乙醇溶液。 0022 雷公藤红素的测定方法为 0023 1、 高效液相制备色谱法 (HPLC-UV)， 色谱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶， 检测波 长 425nm， 流动相为甲醇 -1醋酸 ( 体积比 87 13)， 流速为 1ml/min， 柱温 27， 。
13、进样量 说 明 书 CN 101638425 B3/4 页 5 10l。 0024 2、 200-300 目 G 硅胶铺板， 展开剂 1 ： 氯仿 - 甲醇 ( 体积比 65 35)， pH 调至 3-4 ； 展开剂 2 ： 环己烷 - 丙酮 ( 体积比 1 3) ； 0025 显色方式 ： 碘显色或者香草醛硫酸乙醇溶解， 105加热显色 0026 本申请利用雷公藤红素既溶于氯代烷烃又溶于 50 70vt甲醇或乙醇溶液的物 理性质以及氯代烷烃与醇溶液极性差异的特点， 首先使用氯代烷烃提取， 将仅溶于醇溶液 而不溶于氯代烷烃的非目标产物分离， 然后用醇溶液萃取， 将在醇溶液中有较小溶解度的 另一。
14、些非目标产物沉淀分离， 这时醇溶液中所含非目标产物大大减少， 使粗提物中雷公藤 红素含量较初提物大幅度提高， 从而简化以后的分离纯化过程。 四、 附图说明 0027 图 1 为 2 步骤制备的粗提物 HPLC 检测图谱 0028 图 2 为 4 步骤制备的精提物的 HPLC 检测图谱 0029 图 3、 图 4 为 4 步骤制备的精提物的 13CNMR1， HNMR 检测图谱 0030 图 5 为 4 步骤制备的精提物的 EI-MS 检测图谱 五、 具体实施方式 0031 实施例一 0032 选取粒度为 20 目的南蛇藤根皮部分粗粉 300g， 按 1 5 的质量比加入 1， 2- 二氯 乙烷。
15、， 加热回流提取4小时， 回流提取两次。 过滤， 合并滤液减压浓缩回收1， 2-二氯乙烷后， 得暗红色浸膏 0.39g( 初提物 )， 红素含量 9.2。加 50vt甲醇溶液溶解， 溶液中析出白 色沉淀， 静置， 取上清液浓缩后重复处理 2-3 次， 得到雷公藤红素粗提物， 雷公藤红素含量 51.3。将粗提物甲醇溶解进行固定相为反相 C18制备色谱上进行分离， 洗脱剂为 83vt 甲醇水溶液， 醋酸调 pH 至 3， 根据制备色谱图收集雷公藤红素馏分， 浓缩蒸干后得雷公藤红 素粉末 ( 精提物 )， 采用乙醇 / 水重结晶处理得到纯度达 98的红色结晶雷公藤红素产品。 0033 实施例二 00。
16、34 选取粒度为 20 目的南蛇藤根皮部分粗粉 300g， 按 1 7 的质量比加入偏三氯乙 烷， 加热回流提取 5 小时， 回流提取两次。过滤， 合并滤液减压浓缩回收偏三氯乙烷后， 得 暗红色浸膏 0.41g( 初提物 )， 雷公藤红素含量 10.3。加入 60vt乙醇溶液充分溶解， 溶 液中析出白色沉淀， 过滤后取滤液， 浓缩后再次重复同样处理 2-3 次， 得到雷公藤红素粗提 物， 雷公藤红素含量 48.2。将粗提物甲醇溶解进行固定相为反相 C18制备色谱上进行分 离， 洗脱剂为 85vt甲醇溶液， 醋酸调 pH 至 3， 根据制备色谱图收集雷公藤红素馏分， 浓缩 蒸干后得雷公藤红素粉末。
17、 ( 精提物 )， 采用乙醇 / 水重结晶处理得到纯度达 98的红色结 晶雷公藤红素产品。 0035 实施例三 0036 选取粒度为 20 目的南蛇藤根皮部分粗粉 300g， 按 1 10 的质量比加入氯仿， 加 热回流提取 5 小时， 回流提取两次。过滤， 合并滤液减压浓缩回收氯仿后， 得暗红色浸膏 0.47g(初提物)， 雷公藤红素含量10.1。 加入60vt甲醇溶液， 溶液混浊， 静置， 过滤取滤 液浓缩后再次重复同样处理2-3次， 得到雷公藤红素粗提物， 雷公藤红素含量53.1。 将粗 说 明 书 CN 101638425 B4/4 页 6 提物甲醇溶解硅胶拌样进行固定相为正相硅胶常压。
18、柱分离， 洗脱剂为氯仿/甲醇(6040) 等度洗脱， TLC 跟踪监测， 收集雷公藤红素馏分， 浓缩蒸干后得到雷公藤红素产精提物， 采用 乙醇 / 水重结晶处理得到纯度达 98的红色结晶雷公藤红素产品。 0037 实施例四 0038 选取粒度为 20 目的南蛇藤根皮部分粗粉 300g， 按 1 15 的质量比加入氯仿， 加 热回流提取 5 小时， 回流提取两次。过滤， 合并滤液减压浓缩回收氯仿后， 得暗红色浸膏 0.41g( 初提物 )， 雷公藤红素含量 9.2。加入 50vt乙醇溶液， 溶液混浊， 静置， 过滤取滤 液浓缩后再次重复同样处理2-3次， 得到雷公藤红素粗提物， 雷公藤红素含量50.1。 将粗 提物甲醇溶解硅胶拌样进行固定相为正相硅胶常压柱分离， 洗脱剂为氯仿/甲醇(7030) 等度洗脱， TLC 跟踪监测， 收集雷公藤红素馏分， 浓缩蒸干后得到雷公藤红素精提物， 采用乙 醇 / 水重结晶处理得到纯度达 98的红色结晶雷公藤红素产品。 说 明 书 CN 101638425 B1/4 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101638425 B2/4 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 101638425 B3/4 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 101638425 B4/4 页 10 图 5 说 明 书 附 图 。